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    微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工藝優(yōu)化

    2016-05-30 21:29:03劉源楊剛張孝琴楊學武
    南方農業(yè)學報 2016年3期
    關鍵詞:響應面法甘孜多糖

    劉源 楊剛 張孝琴 楊學武

    摘要:【目的】優(yōu)化微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件,為提高虎掌菌多糖提取率提供新的工藝技術?!痉椒ā恳愿首位⒄凭鸀樵囼灢牧?、多糖提取率為考察指標,在單因素試驗基礎上,通過Box-Behnken中心組合設計及響應面法優(yōu)化微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件?!窘Y果】影響微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的因素順序為:復合酶用量>酶解溫度>微波功率>微波時間,復合酶用量和酶解溫度對多糖提取率的影響極顯著(P<0.01),酶解溫度與微波時間兩因素交互作用影響顯著(P<0.05),其最佳提取工藝條件為:纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、復合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時間4.3 min、微波功率550 W,在此條件下的虎掌菌多糖提取率為16.09%,與模型預測值16.2537%的相對誤差為1.02%,誤差較小?!窘Y論】建立的模型對甘孜虎掌菌多糖具有較好的預測作用,優(yōu)化的工藝參數(shù)可用于實際生產。

    關鍵詞: 虎掌菌;多糖;響應面法;微波協(xié)同復合酶法;甘孜

    中圖分類號: S646.9 文獻標志碼:A 文章編號:2095-1191(2016)03-0442-07

    0 引言

    【研究意義】虎掌菌(Sarcodon imbricatus)又稱獐子菌、翹鱗肉齒菌,其子實體中等至大型,表面有暗灰色至黑褐色大鱗片。中醫(yī)認為,虎掌菌性平味甘,具有追風散寒、降低膽固醇等作用,同時具有益氣補氣、治風破血、和胃通便、降血壓、解食物之毒、治頭痛頭昏等功效(趙雨霽和王琦,2014)。已有研究表明,虎掌菌多糖具有抗腫瘤、抗氧化及抑菌活性等作用(才媛,2013;丁祥等,2015)。虎掌菌主要分布于云南省楚雄州和麗江縣,目前對云南野生虎掌菌的研究較多(杜萍等,2010;王雪冰,2011);但海拔3500 m以上的川西高原每年也出產此菌,據調查四川甘孜州的野生虎掌菌年生長量超300 t,其年產量與云南相當,也是我國虎掌菌的主產區(qū)之一(陳杭等,2014)。由于開發(fā)較晚,目前尚無甘孜虎掌菌的研究報道。因此,研究甘孜虎掌菌的多糖提取工藝,對真菌多糖的藥用開發(fā)具有重要意義。【前人研究進展】近年來,真菌多糖的提取已由傳統(tǒng)水提醇沉法轉為酶解法、超聲波和微波輔助提取。微波協(xié)同酶法提取真菌多糖,是利用酶對細胞壁的破壞,結合微波的高能,促使目標物進入溶劑,從而提高提取率。苗曉燕等(2012)利用微波協(xié)同纖維素與果膠酶的復合酶提取猴頭菌絲體多糖,在復合酶用量1%、pH 4.2、水浴溫度50 ℃、酶解時間30 min、微波功率500 W、微波時間3 min、料液比1∶50的條件下得到多糖提取率為8.01%;黃瓊和丁玲(2013)采用微波協(xié)同果膠酶提取金針菇多糖,得到提取率為21.76%,比單一微波法提取率提高了13.95%;汪振炯等(2014)對蛹蟲草菌絲體采用纖維素酶協(xié)同微波法提取,得到18.45%的蛹蟲草基質多糖。關于云南虎掌菌多糖提取工藝的研究也有一些文獻報道,王雪冰(2011)采用水提、酸堿浸提、酶解、超聲波、微波、超臨界萃取等6個單一工藝提取云南虎掌菌多糖,并比較不同方法在多糖提取工藝中的利弊;之后,王雪冰等(2011)采用響應曲面法優(yōu)化水法提取云南野生虎掌菌多糖的工藝條件,得出最佳提取工藝條件為:提取時間3.25 h、提取溫度94 ℃、水料比45.5∶1,在此條件下,虎掌菌多糖提取率為9.14%;韋丁(2011)利用熱水回流提取法得到黑虎掌菌多糖提取率為2.29%。【本研究切入點】目前關于微波協(xié)同復合酶法提取虎掌菌多糖的研究尚未見報道?!緮M解決的關鍵問題】以甘孜虎掌菌為試驗材料,以多糖提取率為考察指標,在單因素試驗基礎上,通過Box-Behnken中心組合設計及響應面法優(yōu)化微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖的工藝條件,為提高虎掌菌多糖提取率提供新的工藝技術。

    1 材料與方法

    1. 1 試驗材料

    虎掌菌采自四川省甘孜州稻城縣色拉鄉(xiāng),經清水洗凈后晾干、粉碎,過50目篩備用。纖維素酶(酶活單位≥50 U/mg,最適溫度30~60 ℃,最適pH 4.0~6.5)購自江蘇銳陽生物科技有限公司;木瓜蛋白酶(酶活單位≥100 U/mg,最適溫度50~60 ℃,最適pH 5.0~7.5)購自南寧東恒華道生物科技有限責任公司;葡萄糖、硫酸、苯酚、丙酮、乙醚、無水乙醇等試劑均為國產分析純。主要儀器設備:RE52CS-1旋轉蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)、MCR-3S微波爐(西安予輝儀器有限公司)、SP-1901型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)、FW80-1粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)、HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州智博瑞儀器制造有限公司)。

    1. 2 多糖提取工藝流程

    準確稱取甘孜虎掌菌子實體干粉→添加一定量復合酶→加入50%乙醇溶解→調節(jié)pH→控制酶解溫度→進行微波處理→水浴鍋酶解1 h→90 ℃滅酶30 min→抽濾→定容→計算提取率。

    1. 3 提取工藝最佳參數(shù)確定

    在單因素試驗中,以分析純葡萄糖為對照,依次改變不同酶的質量比、復合酶用量、微波時間、微波功率、pH、酶解溫度,以虎掌菌多糖提取率為考察指標進行分析。結合實際工藝過程的條件,確定最佳參數(shù)再進行響應面分析設計試驗。

    1. 4 多糖提取率測定

    以葡萄糖質量濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標繪制標準工作曲線,得回歸方程:y=0.00631x-0.028(R=

    0.9992)。

    多糖提取率(%)=提取得到的多糖質量/原料總質量×100

    1. 5 統(tǒng)計分析

    采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析,Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面分析。

    2 結果與分析

    2. 1 單因素試驗結果

    2. 1. 1 不同酶質量比對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時間3.0 min、微波功率600 W的條件下,分別添加酶總用量為0.5%的纖維素酶、木瓜蛋白酶、纖維素酶與木瓜蛋白酶組成的復合酶(質量比1∶2、1∶1、2∶1),結果見圖1。復合酶的甘孜虎掌菌多糖提取率均高于單一酶的多糖提取率,且以復合酶質量比為1∶1的多糖提取率最高(15.42%),顯著高于單一酶的多糖提取率(P<0.05,下同),但單一酶的多糖提取率與復合酶質量比為1∶2和2∶1的多糖提取率間無顯著差異(P>0.05,下同)。最終選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶以質量比1∶1組成的復合酶進行后續(xù)試驗。

    2. 1. 2 復合酶用量對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時間3.0 min、微波功率600 W的條件下,分別添加0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%的復合酶,結果見圖2。隨著復合酶用量的增加,甘孜虎掌菌多糖提取率逐漸升高,復合酶用量為0.6%時達最大值,顯著高于復合酶用量0.2%和0.4%的提取率;繼續(xù)增加復合酶用量,多糖提取率有所下降,但用量在0.6%~1.0%的提取率間無顯著差異。最終選擇0.4%、0.6%、0.8%的復合酶用量進行響應面試驗。

    2. 1. 3 酶解溫度對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、pH 5.5、微波時間3.0 min、微波功率600 W的條件下,設置不同酶解溫度分別為35、40、45、50、55和60 ℃,結果見圖3。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著酶解溫度的升高而逐漸增大,當酶解溫度為50 ℃時達最大值,40~60 ℃的多糖提取率無顯著差異,但在50 ℃后呈下降趨勢。最終選擇酶解溫度45、50、55 ℃進行響應面試驗。

    2. 1. 4 微波時間對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波功率600 W的條件下,設置不同微波時間分別為1.0、2.0、3.0、4.0和5.0 min,結果見圖4。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著微波時間的延長而逐漸升高,當微波時間超過3.0 min后,多糖提取率間無顯著性差異,4.0 min后提取率略有下降。最終選擇微波時間3.0、4.0、5.0 min進行響應面試驗。

    2. 1. 5 微波功率對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、pH 5.5、酶解溫度50 ℃、微波時間3.0 min的條件下,設置不同微波功率分別為500、550、600、650和700 W,結果見圖5。甘孜虎掌菌多糖提取率隨著微波功率的增大逐漸升高,當微波功率為550 W時達最大值,除與600 W間無顯著性差異外,與其他微波功率均有顯著性差異,超過550 W后,多糖提取率快速下降。最終選擇微波功率500、550、600 W進行響應面試驗。

    2. 1. 6 pH對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響 在固定復合酶用量0.5%、酶解溫度50 ℃、微波功率600 W、微波時間3.0 min的條件下,設置不同pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5和7.0,結果見圖6。甘孜虎掌菌多糖提取率在酸性較大的情況下(pH 4.0~4.5)有顯著性差異,但隨著pH的增加,在4.5~7.0范圍內無顯著變化,因此選擇pH 5.0(提取率為最大值)進行響應面試驗。

    2. 2 響應面法優(yōu)化甘孜虎掌菌多糖提取工藝

    2. 2. 1 響應面法試驗結果 結合上述單因素試驗結果,根據Design-Expert 8.0.6 軟件的Box-Behnken中心組合試驗設計原理,確定纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、pH 5.0,以復合酶用量、酶解溫度、微波時間和微波功率為主要因素,設計4因素3水平響應面分析試驗,試驗因素水平編碼見表1。

    采用Design-Expert 8.0.6軟件對響應面試驗結果(表2)進行多元回歸擬合分析,得到模型的擬合曲線方程為:Y=15.78+1.29A+0.76B+0.21C-0.46D-0.27AB+

    0.13AC+0.022AD+1.06BC-0.44BD-0.47CD-1.32A2-

    1.85B2-1.04C2-2.38D2。

    對模型的回歸系數(shù)和方差分析結果進行顯著性檢驗,由表3可知,該模型的P=0.0001<0.05,表明該模型的回歸方程具有顯著性。各因素對甘孜虎掌菌多糖提取率影響排序為:A>B>D>C,其中,交互項BC作用顯著,一次項A、B和二次項A2、B2、C2、D2作用極顯著(P<0.01)。在P<0.05顯著水平下剔除不顯著項后,對模型式進行優(yōu)化,其結果為:Y=15.78+1.29A+0.76B+ 1.06BC-1.32A2-1.85B2-1.04C2-2.38D2。

    2. 2. 2 響應面分析因素間的交互作用 根據擬合回歸方程,繪制兩個交互項的響應面圖(圖7),以考察其對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響。響應曲面坡度較平滑,說明響應值受各變量變化的影響較??;反之,響應曲面坡度較陡峭,則說明響應值受變量交互作用較為明顯。由圖7可知,酶解溫度與微波時間之間存在顯著的交互作用,而復合酶用量與酶解時間、微波時間、微波功率之間的交互作用,以及酶解溫度與微波功率、微波時間與微波功率間的交互作用不顯著,與響應面方差分析結果相一致。

    2. 2. 3 最佳提取條件的確定和驗證 利用Design- Expert 8.0.6軟件得到優(yōu)化的提取工藝為:復合酶用量0.69%、酶解溫度51.37 ℃、微波時間4.30 min、微波功率542.57 W,在此條件下甘孜虎掌菌多糖提取率的預測值為16.2537%。綜合考慮多糖提取率和試驗可操作性等因素,修正最佳工藝條件為:纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、復合酶用量0.70%、pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時間4.3 min、微波功率550 W,在此條件下進行驗證,實際測定值為16.09%,相對誤差為1.02%。表明該模型推測得到的最佳工藝參數(shù)對實際的預測較可靠,有一定指導意義。

    3 討論

    目前,關于云南虎掌菌的多糖提取多采用單一工藝完成。王雪冰(2011)采用水提醇沉法提取云南黑虎掌菌多糖的提取率為9.01%,采用微波輔助提取多糖的提取率為16.92%;韋?。?011)利用熱水回流提取黑虎掌菌多糖的提取率為為2.29%。比較發(fā)現(xiàn)水提醇沉法耗時多,提取率低;單一微波法的提取率較高,但易破壞活性成分。微波協(xié)同復合酶法提取真菌多糖,選擇適宜的復合酶配比,使植物細胞壁降解,讓多糖成分充分釋放,從而提高提取率,目前此法已廣泛應用于真菌多糖的提取(朱彩平和肖智敏,2011;苗曉燕等,2012;黃瓊和丁玲,2013)。本研究采用微波協(xié)同復合酶法從甘孜野生虎掌菌中提取多糖,通過6個單因素考察試驗,結合Box-Behnken中心組合設計建立了4因素3水平試驗模型,在優(yōu)化的工藝條件下得到多糖提取率為16.09%,較采用水提醇沉法(王雪冰,2011)、熱水回流法(韋丁,2011)的提取率高,也高于同屬野生竹蓀菌托(吳雪艷等,2015)和青頭菌(王靜等,2015)的多糖提取率??梢?,甘孜虎掌菌多糖含量較高,采用微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖可有效提高提取率。

    在本研究中,單因素和兩因素交互作用對甘孜虎掌菌多糖提取率的影響表現(xiàn)為:復合酶用量>酶解溫度>微波功率>微波時間,其中復合酶用量和酶解溫度對多糖提取率的影響極顯著,酶解溫度與微波時間兩因素交互作用影響顯著,與黃瓊和丁玲(2013)的研究結果一致。在微波協(xié)同復合酶法提取多糖的工藝中,還存在其他影響因素,如料液比、酶解時間、提取次數(shù)、其他生物酶的選擇等,下一步將綜合考察這些因素,得出更優(yōu)的提取方案,以期獲得更高的提取率。

    4 結論

    本研究通過響應面法優(yōu)化微波協(xié)同復合酶法提取甘孜虎掌菌多糖工藝,得到最佳提取工藝條件為:纖維素酶與木瓜蛋白酶的復合酶質量比1∶1、復合酶用量0.70%、 pH 5.0、酶解溫度51 ℃、微波時間4.3 min、微波功率550 W,在此條件下的多糖提取率為16.09%,與模型預測值16.2537%的相對誤差為1.02%。表明建立的模型對甘孜虎掌菌多糖具有較好的預測作用,優(yōu)化的工藝參數(shù)可用于實際生產。

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    (責任編輯 羅 麗)

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