2型松弛素抗肺纖維化的研究進(jìn)展

劉國(guó)清 王敏

摘 要：人類2型松弛素（Relaxin-2，RLN2）是一種作用廣泛的小分子肽類激素，其抗纖維化作用近年來成為研究熱點(diǎn)。除間質(zhì)性肺疾病外，哮喘、COPD、矽肺等患者的呼吸道、肺泡周圍甚至整個(gè)肺部在長(zhǎng)期的損傷刺激下均會(huì)出現(xiàn)成纖維細(xì)胞分化、細(xì)胞外膠原沉積等纖維化病變。Relaxin-2可以通過激活1型松弛素受體（RXFP1）然后啟動(dòng)直接抗肺纖維化作用抑制成纖維細(xì)胞活動(dòng)和細(xì)胞外膠原沉積等病變，也可以通過其他方式（如產(chǎn)生NO、激活糖皮質(zhì)激素受體等）發(fā)揮間接抗肺纖維化作用。本文就松弛素在抗纖維化作用機(jī)制及其在抗肺纖維化疾病中的研究進(jìn)展作一綜述。

關(guān)鍵詞：肺纖維化；2型松弛素

肺是發(fā)生纖維化病變的常見器官之一，由感染、機(jī)械通氣、自身免疫等致肺損傷原因引起的肺部嚴(yán)重或長(zhǎng)期的炎癥刺激均可導(dǎo)致肺的纖維化變。肺損傷后損傷部位參與炎癥反應(yīng)的各種細(xì)胞分泌的趨化因子、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF）等細(xì)胞因子，趨化成纖維細(xì)胞浸潤(rùn)，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞活化為肌成纖維樣細(xì)胞、活化肺固有成纖維細(xì)胞，同時(shí)活化的平滑肌細(xì)胞和肌成纖維樣細(xì)胞分泌細(xì)胞外基質(zhì)。在這個(gè)過程中促纖維化因素和抗纖維化因素的調(diào)節(jié)的失衡就會(huì)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞過度增生、新生血管形成、細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積，最終導(dǎo)致肺纖維化的發(fā)生[1]。松弛素尤其是人2型松弛素被發(fā)現(xiàn)在抑制TGF-β、調(diào)控促纖維化和抗纖維化平衡方面具有顯著作用[2]。松弛素是1926年發(fā)現(xiàn)的一種妊娠相關(guān)的肽類激素，除在妊娠和分娩過程中起重要作用外，其還具有舒張血管、血管再生、抗炎、抗纖維化、骨重建等作用[2]，在抗肺纖維化方面近年來也有了新的研究進(jìn)展，本文就將其在細(xì)胞，動(dòng)物、臨床水平的抗肺纖維化研究進(jìn)展作一綜述。

1 人2型松弛素的一般特征

人2型松弛素（Relaxin-2，RLN2）是一種分子量約為6 kD的小分子肽類激素，由53個(gè)氨基酸縮合而成，結(jié)構(gòu)類似于胰島素，屬于胰島素超家族。人類共有7種編碼松弛素家族多肽的基因，除靈長(zhǎng)類外大多數(shù)動(dòng)物只有6種編碼松弛素家族肽的基因，編碼人Relaxin-2的2型基因位于9號(hào)染色體，人類2型松弛素基因產(chǎn)物與嚙齒類動(dòng)物1型松弛素基因編碼產(chǎn)物具有同源性，即人2型和嚙齒動(dòng)物1型松弛素都可以激活人或動(dòng)物的1型松弛素受體。 RLN2的表達(dá)除產(chǎn)生于女性的卵巢、子宮和男性的睪丸、前列腺外，還主要以自分泌和旁分泌的形式廣泛產(chǎn)生于肺臟、心臟、腎臟、脾、皮膚等器官[3]。具有抗纖維化作用的主要是人2型松弛素（嚙齒類為1型松弛素），其主要與人1型松弛素受體（RXFP1）結(jié)合發(fā)揮生理作用。

2 人1型松弛素受體及其引發(fā)抗纖維化的下游細(xì)胞信號(hào)通路

包括人在內(nèi)的哺乳動(dòng)物具有4種松弛素家族肽受體，RLN2主要結(jié)合的受體是1型松弛素受體也是被配體激活后具有抗纖維化的主要松弛素家族肽受體。RXFP1廣泛分布于生殖系統(tǒng)、腦、心臟、肺臟等器官。RXFP1在細(xì)胞外側(cè)的復(fù)雜外功能區(qū)富含亮氨酸重復(fù)序列（LRR）而在細(xì)胞內(nèi)側(cè)結(jié)合有G蛋白藕聯(lián)受體（GPCR），另外RXFP1受體中的低密度脂蛋白a（LDLa）組件、LRR和跨膜域的外側(cè)袢2對(duì)于該受體與配體間的高親和力結(jié)合以及信息的傳遞起至關(guān)重要的作用[4]。

RLN2與LRR區(qū)的結(jié)合改變了外側(cè)區(qū)域的構(gòu)象，進(jìn)而促使LDLa組件與G蛋白偶聯(lián)并可以通過四條途徑以協(xié)同作用產(chǎn)生NO激活鳥苷酸環(huán)化酶使cGMP劇增，進(jìn)而再通過增加表達(dá)金屬蛋白酶（MMPs）和抑制Smad2磷酸化倆條路徑發(fā)揮抗纖維化作用。其大致過程為松弛素作用于RXFP1后：途徑一，RXFP1與Gαs耦合從而激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），然后通過cAMP-蛋白激酶A（PKA）-IкB/NFкB途徑上調(diào)誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（iNOS）的表達(dá)；途徑二，RXFP1同時(shí)耦合GαoB反向調(diào)節(jié)Gαs激活A(yù)C的過程；途徑三，RXFP1耦合Gαi3和βγ亞單位從而激活磷脂酰肌醇激酶（PI3K）進(jìn)而轉(zhuǎn)錄PKC-ζ、AKT、增加ERK的磷酸化，PKC-ζ再反過來激活A(yù)C5；途徑四，PI3K轉(zhuǎn)錄的AKT、胞外信號(hào)相關(guān)激酶（ERK）分別上調(diào)eNOS和nNOS的表達(dá)。無論哪條途徑最終都會(huì)通過增加NO的合成進(jìn)行下一步的信號(hào)傳遞。松弛素這個(gè)的作用過程產(chǎn)生不同區(qū)域性cAMP影響不同的信號(hào)結(jié)局，并且在不同的器官會(huì)有不同的G蛋白被激活，在心臟成纖維細(xì)胞Gαs、GαoB、Gαi3三種G蛋白均可以與松弛素受體耦合而激活，但在腎臟肌成纖維樣細(xì)胞只有Gαs、GαoB可以被激活Gαi3則不被激活，這種激活在肺部細(xì)胞的情況還未知[5]。在這個(gè)過程中金屬蛋白酶1（MMP1）和NO合酶的表達(dá)增加最終通過核因子NFкB的增加轉(zhuǎn)錄來調(diào)節(jié)[3]。

RLN2可以降低金屬蛋白酶組織抑制劑（TIPMs）在心臟、肝星狀細(xì)胞、皮膚的表達(dá)，減除TIPMs對(duì)MMPs的抑制作用[6]，在肺中同樣存在這種抗纖維化作用機(jī)制[7]。

信號(hào)小體是RLN2誘導(dǎo)產(chǎn)生的由Gαs、Gβγ以及AC2組成的蛋白復(fù)合體，AC2通過結(jié)合于RLN2C端螺旋結(jié)構(gòu)的AKAP79與松弛素耦合。信號(hào)小體對(duì)秒摩爾濃度的松弛素非常敏感，這一特點(diǎn)是細(xì)胞對(duì)體液中極低濃度松弛素產(chǎn)生反應(yīng)的基礎(chǔ)，而可激活經(jīng)典途徑的高濃度松弛素是促使信號(hào)小體分解的因素。信號(hào)小體通過AKAP79將RXFP1和AC2架構(gòu)在一起，使AC更容易被Gαs和Gβγ亞單位激活[5]。目前的研究顯示同時(shí)有AC2和RXFP1表達(dá)的組織有腦、肺、心臟、子宮、骨骼肌，所以肺部組織可能也存在這種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，這一機(jī)制為肺部微量吸入2型松弛素治療肺纖維化的發(fā)生提供了思路。

3 人2型松弛素抗肺纖維化的作用機(jī)制

3.1 直接抑制成纖維細(xì)胞的活動(dòng) RLN2激活RXFP1后通過第2部分所述的細(xì)胞信號(hào)通路發(fā)揮抗纖維化作用。MMPs表達(dá)上調(diào)后細(xì)胞外基質(zhì)降解增多，在肺組織主要是MMP1表達(dá)增多使1型和3型膠原降解增多，此外RXFP1被激活后大量產(chǎn)生的NO通過抑制Smad2的磷酸化抑制TGF-β1受體信號(hào)的向內(nèi)傳遞進(jìn)而抑制成纖維細(xì)胞的活化、增殖以及向肌成纖維樣細(xì)胞的分化[8]。

纖維細(xì)胞、肌成纖維樣細(xì)胞是一類具有收縮功能的細(xì)胞，這種功能使得成纖維母細(xì)胞具有遷徙到炎癥部位的能力以及通過機(jī)械收縮向生化信號(hào)的轉(zhuǎn)化機(jī)制保持肌成纖維樣細(xì)胞的持續(xù)分化狀態(tài)。RLN2可以通過iNOS依賴的NO/cGMP信號(hào)通路以及其下游的磷酸激酶G（PKG）的激活然后磷酸化RhoA，進(jìn)而激活RhoA相關(guān)激酶（ROCK），最后ROCK引發(fā)MLC20去磷酸化導(dǎo)致肌成纖維樣細(xì)胞的舒張，RLN2可以通過這種機(jī)制抑制成纖維細(xì)胞遷徙和肌成纖維樣細(xì)胞分化的保持從而起到抗纖維化作用[9]。

3.2 抗炎和促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖作用 RLN2可以通過激活糖皮質(zhì)激素受體、抑制炎癥參與細(xì)胞的活動(dòng)等抗炎作用起到預(yù)防肺纖維化發(fā)生的作用。糖皮質(zhì)激素受體（GR）是一種配體依賴性轉(zhuǎn)錄因子的核受體，在早些年就被證實(shí)糖皮質(zhì)激素可被松弛素激活[10]。被松弛素激活的GR可以產(chǎn)生刺激單核細(xì)胞分化為巨噬細(xì)胞減少細(xì)胞因子的釋放（包括白介素1、6和腫瘤壞死因子）、改變多種影響結(jié)締組織代謝的蛋白的表達(dá)、調(diào)節(jié)松弛素自身的表達(dá)量、上調(diào)GR表達(dá)量等作用[11]。RLN2也可以直接通過抑制炎癥參與細(xì)胞的過度趨化和遷移調(diào)節(jié)炎癥發(fā)生過程[12]。在炎癥的前期階段RLN2可阻止中性類細(xì)胞的活動(dòng)[]，以及阻止嗜堿性類細(xì)胞和肥大細(xì)胞脫顆粒和釋放組胺[13]，避免炎癥造成的過度損傷。此外，RLN2可以促進(jìn)氣道上皮細(xì)胞的增殖和遷移[14]，從而加快氣道正常損傷修復(fù)避免過度的纖維瘢痕形成。

4 RLN2在動(dòng)物和臨床抗纖維化方面的研究及展望

最早抗纖維化的臨床應(yīng)用研究是在抗硬化癥方面[15]，隨后在抗肺纖維化病變方面的研究逐漸增多，但幾乎都處于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段。遺憾的是在一項(xiàng)針對(duì)系統(tǒng)性硬化癥的臨床試驗(yàn)中松弛素組與安慰劑組的病人比較，肺纖維化和肺功能的改善并不明顯[16]。不過在多種包括矽肺[10]、支氣管哮喘、特發(fā)性肺纖維化[9]、肺移植后閉塞性細(xì)支氣管炎[10]等動(dòng)物肺纖維或氣道纖維化疾病模型中，松弛素的治療均可以表現(xiàn)出對(duì)纖維化明顯的抑制和逆轉(zhuǎn)作用。隨著研究的深入，RLN2的一些不利因素逐漸浮出水面，在針對(duì)系統(tǒng)性硬化癥3期臨床試驗(yàn)中不少接受RLN2治療的受試者在停藥后出現(xiàn)了嚴(yán)重的腎損害和高血壓癥狀[16]。最近的研究顯示RLN2可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[]。此外，RLN2的促紅細(xì)胞生成和促血管生成作用[17]也可能成為其治療纖維化時(shí)的不利因素。近來有研究針對(duì)RLN2在合成及其副作用方面的不利因素，嘗試合成新的RXFP1激動(dòng)劑。CGEN25009是一種單鏈多肽，其前體蛋白是C1q腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白8，報(bào)道稱其可以低親和力的結(jié)合并激活RXFP1，并且具有與RLN2相同的抗肺部炎癥和抗肺部纖維化作用[11]。

雖然RLN2在抗肺纖維化的研究方面取得了不少進(jìn)展，但是現(xiàn)有的研究幾乎均集中在細(xì)胞和嚙齒類動(dòng)物，并且給藥方式多為靜脈或腹腔注射，而在大型動(dòng)物模型上的復(fù)制還未見報(bào)道。對(duì)于肺部特有的吸入性給藥方式也未見研究，在一項(xiàng)用鼻腔給與重組人2型松弛素抗小鼠氣道重塑實(shí)驗(yàn)中，取得了較顯著的抗纖維化效果[18]，吸入性給藥是一種用藥量少并且副作用小的肺部特有的一種局部給藥方式，對(duì)于上文提到的CGEN25009這種新型的RXFP1激動(dòng)劑，采用吸入給藥方式或許會(huì)更為完善，而且RLN2誘導(dǎo)信號(hào)小體的對(duì)極微量的RLN2敏感的機(jī)制可能成為RLN2吸入治療和降低副作用新思路。肺部損傷造成的肺纖維化病變或呼吸道重塑，現(xiàn)階段尚無有效的治療手段。RLN2在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中顯示出了較強(qiáng)的促沉積膠原降解、抑制成纖維細(xì)胞遷徙和分化、抑制肌成纖維樣細(xì)胞分泌膠原等抗纖維化作用，但是RLN2除抗纖維化作用外仍表現(xiàn)出擴(kuò)張那個(gè)血管、降低血漿滲透壓、降血壓、促紅細(xì)胞生成等作用，這勢(shì)必會(huì)阻礙松弛素在抗纖維化方面的應(yīng)用。改變給藥途徑、將松弛素結(jié)構(gòu)進(jìn)行針對(duì)性的修飾、或者尋找選擇性較強(qiáng)的RXFP1激動(dòng)劑會(huì)成為松弛素抗纖維化的新的希望。

參考文獻(xiàn)：

[1]Royce SG， Moodley Y， Samuel CS. Novel therapeutic strategies for lung disorders associated with airway remodelling and fibrosis[J]. Pharmacology & therapeutics. 2014， 141（3）：250-260.

[2]Cernaro V， Lacquaniti A， Lupica R， et al. Relaxin： new pathophysiological aspects and pharmacological perspectives for an old protein[J]. Medicinal research reviews. 2014， 34（1）：77-105.

[3]Bathgate RAD， Halls ML， van der Westhuizen ET， et al. Relaxin Family Peptides and Their Receptors[J]. Physiological reviews. 2013， 93（1）：405-480.

[4]Halls ML， Bathgate RA， Sutton SW， et al. International Union of Basic and Clinical Pharmacology. XCV. Recent advances in the understanding of the pharmacology and biological roles of relaxin family peptide receptors 1-4， the receptors for relaxin family peptides[J]. Pharmacological reviews. 2015， 67（2）：389-440.

[5]Halls ML. Constitutive formation of an RXFP1-signalosome： a novel paradigm in GPCR function and regulation[J]. British journal of pharmacology. 2012， 165（6）：1644-1658.

[6]Sassoli C， Chellini F， Pini A， et al. Relaxin prevents cardiac fibroblast-myofibroblast transition via notch-1-mediated inhibition of TGF-beta/Smad3 signaling[J]. Plos One. 2013， 8（5）：e63896.

[7]Samuel CS， Royce SG， Chen B， et al. Relaxin family peptide receptor-1 protects against airway fibrosis during homeostasis but not against fibrosis associated with chronic allergic airways disease[J]. Endocrinology. 2009， 150（3）：1495-1502.

[8]Li XF， Liao J， Xin ZQ， et al. Relaxin attenuates silica-induced pulmonary fibrosis by regulating collagen type I and MMP-2[J]. International immunopharmacology. 2013， 17（3）：537-542.

[9]Huang X， Gai Y， Yang N， et al. Relaxin regulates myofibroblast contractility and protects against lung fibrosis[J]. The American journal of pathology. 2011， 179（6）：2751-2765.

[10] Alexiou K， Wilbring M， Matschke K， et al. Relaxin Protects Rat Lungs from Ischemia-Reperfusion Injury via Inducible NO Synthase： Role of ERK-1/2， PI3K， and Forkhead Transcription Factor FKHRL1[J]. Plos One. 2013， 8（9）.

[11]Duarte C， Kobayashi Y， Kawamoto T， et al. Relaxin receptors 1 and 2 and nuclear receptor subfamily 3， group C， member 1 （glucocorticoid receptor） mRNAs are expressed in oral components of developing mice[J]. Archives of oral biology. 2014， 59（2）：111-118.

[12]Figueiredo KA， Rossi G， Cox ME. Relaxin promotes clustering， migration， and activation states of mononuclear myelocytic cells[J]. Annals of the New York Academy of Sciences. 2009， 1160：353-360.

[13]Walsh SK， Kane KA， Wainwright CL. Mast cells， peptides and cardioprotection - an unlikely marriage？[J]. Autonomic & autacoid pharmacology. 2009， 29（3）：73-84.

[14]Wyatt TA， Sisson JH， Forget MA， et al. Relaxin stimulates bronchial epithelial cell PKA activation， migration， and ciliary beating[J]. Experimental biology and medicine （Maywood， NJ）. 2002， 227（11）：1047-1053.

[15]Casten GG， Boucek RJ. Use of relaxin in the treatment of scleroderma[J]. Journal of the American Medical Association. 1958， 166（4）：319-324.

[16]Antic M， Distler JH， Distler O. Treating skin and lung fibrosis in systemic sclerosis： a future filled with promise？[J]. Current opinion in pharmacology. 2013， 13（3）：455-462.

[17]Squadrito F， Bitto A， Irrera N， et al. Porcine derived relaxin stimulates new vessel formation and improves the disturbed wound healing of the genetically diabetic mice[J]. Italian journal of anatomy and embryology = Archivio italiano di anatomia ed embriologia. 2013， 118（1 Suppl）：66-70.

[18]Royce SG， Lim CX， Patel KP， et al. Intranasally administered serelaxin abrogates airway remodelling and attenuates airway hyperresponsiveness in allergic airways disease[J]. Clinical and experimental allergy ： journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology. 2014， 44（11）：1399-1408.

作者簡(jiǎn)介：劉國(guó)清，研究生、醫(yī)師，研究方向間質(zhì)性肺疾??； 王敏，主任醫(yī)師、教授、楚天學(xué)者，研究方向小兒呼吸系統(tǒng)疾病。