響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取牡丹花總黃酮工藝

吳存兵 陳曉蘭 吳君艷

摘要：【目的】采用響應(yīng)面分析法對牡丹花總黃酮提取工藝進行優(yōu)化，為其開發(fā)利用提供技術(shù)參考?！痉椒ā恳阅档せ樵?，在單因素試驗基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分數(shù)（A）、液料比（B）、提取時間（C）為影響因素，牡丹花總黃酮提取率（Y）為響應(yīng)值，采用Box-Behnken試驗設(shè)計方法，研究各自變量及其交互作用對牡丹花總黃酮提取率的影響。【結(jié)果】牡丹花總黃酮提取率對乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間的二次多元回歸方程為：Y=5.81+0.29A+0.13B+0.30C+0.24AB+

0.45AC+0.24BC-0.50A2-1.42B2-0.61C2（R2=0.9846），該模型擬合程度較好。其中，乙醇體積分數(shù)、提取時間及其二者的交互作用對牡丹花總黃酮提取率有極顯著影響（P<0.01），乙醇體積分數(shù)與液料比、液料比與提取時間的交互作用對提取率有顯著影響（P<0.05）。乙醇提取牡丹花總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)55%、液料比41∶1（mL/g）、提取時間45 min，此條件下牡丹花總黃酮提取率為6.08%，與理論預測值（5.96%）的相對誤差為2.01%?！窘Y(jié)論】通過響應(yīng)面建立的牡丹花總黃酮提取工藝模型擬合效果較好，可用于實際預測。優(yōu)化后的提取工藝具有所需試劑少、提取時間短、易操作等優(yōu)點。

關(guān)鍵詞： 牡丹花總黃酮；乙醇提取；工藝優(yōu)化；響應(yīng)面分析

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2016）08-1370-06

Abstract：【Objective】The extraction process of total flavonoids from peony flower was optimized， in order to provide technical reference for its development and utilization. 【Method】Using peony flower as tested material， the ethanol volume fraction（A）， liquid-solid ratio（B） and extraction time（C） was selected as influencing factor based on single factor experiment， and the extraction rate of total flavonoids（Y） was selected as response value. The effects of all variables and their interactions on extraction rate of total flavonoids from peony flower were investigated through Box-Behnken experiment design method. 【Result】The results showed that， the quadratic multiple regression equation between extraction rate of total flavonoids from peony flower and influencing factors was Y=5.81+0.29A+0.13B+0.30C+0.24AB+0.45AC+0.24BC-

0.50A2-1.42B2-0.61C2（R2=0.9846）， with good fitting degree. Ethanol volume fraction， extraction time and their interaction had extremely significant effects on extraction rate of total flavonoids（P<0.01）. Interaction between ethanol volume fraction and liquid-solid ratio， and interaction between liquid-solid ratio and extraction time had significant effects on extraction rate of total flavonoids（P<0.05）. The optimum extraction conditions of total flavonoids from peony flower was as follows： ethanol volume fraction of 55%， liquid-solid ratio of 41∶1 mL/g and extraction time of 45 min. Under the above optimum conditions， the the extraction rate of total flavonoids from peony flower was 6.08%， the relative error between actual value and predictive value（5.96%） was 2.01%. 【Conclusion】The extraction process model established by response surface methodology shows fitting degree， and can be applied in actual prediction. Furthermore， the optimized extraction process has the advantages of less reagent needed， shorter time， easy operation and so on.

Key words： total flavonoids from peony flower； ethanol extraction； process optimization； response surface analysis

0 引言

【研究意義】牡丹是毛茛科芍藥屬小灌木，原產(chǎn)于我國長江流域及黃河流域各省的山間或丘陵中，由于其觀賞價值和藥用價值較高，逐漸由野生變?yōu)榧茵B(yǎng)（陳思勤等，2012）。牡丹花含有紫云英苷、沒食子酸、苯甲酸等黃酮、多酚類化合物，其中，黃酮類化合物具有降壓、降脂、抗骨質(zhì)疏松、防止動脈硬化、抗衰老等多種保健功效，其花色苷類成分還具有較強的抗氧化活性，可防癌、抗腫瘤（周紅林等，2006；吳震生等，2013；袁亞光等，2013）。牡丹花中黃酮類化合物應(yīng)用前景廣闊。因此，研究牡丹花中黃酮類化合物的提取工藝，對其在生物制品、保健品和化妝品等方面的開發(fā)應(yīng)用具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】黃酮是牡丹含有的有效成分之一（高黎明等，2003），從牡丹中提取黃酮類化合物的方法較多，如傳統(tǒng)的溶劑萃取法、閃式提取法、酶解法等。王曉等（2005）采用酶法提取牡丹花總黃酮，以0.2 mg/mL纖維素酶和0.1 mg/mL果膠酶為復合酶液，在50 ℃、pH 4.5的條件下酶解120 min，總黃酮產(chǎn)量比傳統(tǒng)工藝提高19.8%。劉娟等（2012）采用閃式提取法提取牡丹花粉中黃酮類物質(zhì)，其最優(yōu)工藝參數(shù)為：乙醇濃度90%、提取時間2 min、料液比1∶25（g/mL）、提取轉(zhuǎn)速4000 r/min，總黃酮提取率為7.8%。馮紀南等（2013）研究超聲波輔助提取臭牡丹中黃酮類化合物的工藝，其最佳提取條件為：在超聲功率600 W、乙醇濃度50%、料液比1∶40（g/mL）、提取溫度60 ℃的條件下超聲提取40 min，提取2次，黃酮類化合物基本被提取完全，總提取率為2.653%。吳震生等（2013）采用正交試驗優(yōu)化牡丹花蕊中總黃酮提取工藝，結(jié)果表明，以80%乙醇為提取溶劑，在料液比1∶20、超聲功率25 kHz的條件下超聲提取30 min，得到總黃酮含量為18.85 mg/g?！颈狙芯壳腥朦c】目前尚無利用響應(yīng)面法優(yōu)化乙醇提取牡丹花黃酮類化合物工藝條件的研究報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】選擇乙醇體積分數(shù)、提取時間、液料比等因素進行牡丹花總黃酮提取工藝單因素試驗，以響應(yīng)面試驗設(shè)計優(yōu)化牡丹花總黃酮提取工藝，為其開發(fā)應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

牡丹花采自淮陰五里農(nóng)場，采后置于烘箱中80 ℃恒溫干燥，再用小型粉磨機將其粉碎，過60目篩后放入廣口瓶中密封，避光處常溫保存?zhèn)溆?。蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、乙醇等試劑均購自淮安國藥化學試劑有限公司。主要儀器設(shè)備：725SP紫外可見分光光度計（上海天普分析儀器有限公司）、80-2型離心沉淀機（北京天創(chuàng)尚邦儀器設(shè)備有限公司）、HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海滬粵明科學儀器有限公司）、TP-1200C電子天平（廈門欣銳儀器儀表有限公司）、JJ-2型組織搗碎機（上海弗魯克流體機械制造有限公司）、JY92-2D超聲波細胞粉碎機（武漢愛斯佩科學儀器有限公司）、DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海右一儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 供試品溶液制備 稱取一定質(zhì)量的牡丹花粉末，加入一定體積的乙醇作為提取溶劑，在25 kHz超聲波頻率下提取一定時間，過濾、洗滌濾渣后合并濾液和洗液，再轉(zhuǎn)入200 mL容量瓶中定容、搖勻，即為供試品溶液。

1. 2. 2 標準曲線繪制 準確吸取0.10 mg/mL蘆丁溶液0、0.40、0.80、1.20、1.60、2.00和2.40 mL分別置于10.00 mL容量瓶中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.20 mL，搖勻后靜置7 min；然后分別加入10%硝酸鋁溶液0.20 mL，搖勻后靜置10 min；再分別加入4%氫氧化鈉溶液2.00 mL，用80%乙醇稀釋定容至10.00 mL，搖勻后靜置15 min，用試劑作空白參照試驗，在510 nm處測其吸光值，并求出回歸方程：A=8.241C-0.0069（R=0.9997），式中，A為吸光值，C為蘆丁質(zhì)量濃度。

1. 2. 3 牡丹花總黃酮含量測定 取供試品溶液0.5 mL，按1.2.2方法處理，于510 nm測定吸光值，再由標準曲線計算總黃酮質(zhì)量，按公式計算牡丹花總黃酮提取率。

總黃酮提取率（%）=牡丹花中提取總黃酮質(zhì)量/牡丹花質(zhì)量×100

1. 2. 4 單因素試驗設(shè)計

1. 2. 4. 1 乙醇體積分數(shù)的確定 在固定液料比30∶1 （mL/g）、提取時間30 min的條件下，考察不同乙醇體積分數(shù)（30%、40%、50%、60%和70%）對牡丹花總黃酮提取率的影響。

1. 2. 4. 2 液料比的確定 在固定乙醇體積分數(shù)50%、提取時間30 min的條件下，考察不同液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1和50∶1）對牡丹花總黃酮提取率的影響。

1. 2. 4. 3 提取時間的確定 在固定液料比30∶1（mL/g）、乙醇體積分數(shù)50%的條件下，考察不同提取時間（10、20、30、40和50 min）對牡丹花總黃酮提取率的影響。

1. 2. 5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)Box-Benhnken 8.0設(shè)計原理，確定中心組合試驗的因素與水平。以牡丹花總黃酮提取率為響應(yīng)值，分別用A、B、C表示乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間3個自變量，每個變量的低中高水平分別以-1、0、1進行編碼。中心組合設(shè)計的因素與水平見表1。

1. 3 統(tǒng)計分析

采用最小顯著差數(shù)法（LSD）對單因素試驗進行比較分析，Box-Benhnken 8.0對響應(yīng)面試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 單因素試驗結(jié)果

2. 1. 1 乙醇體積分數(shù)對牡丹花總黃酮提取率的影響

由圖1可知，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，牡丹花總黃酮提取率逐漸提高，當乙醇體積分數(shù)為50%時，牡丹花總黃酮提取率最高，乙醇體積分數(shù)繼續(xù)增大，總黃酮提取率呈顯著下降趨勢（P<0.05，下同）。從節(jié)省能源角度考慮，選擇50%為單因素試驗最佳乙醇體積分數(shù)。

2. 1. 2 液料比對牡丹花總黃酮提取率的影響 由圖2可知，隨著液料比的增加，牡丹花總黃酮提取率逐漸升高；當液料比達40∶1后，繼續(xù)提高液料比，牡丹花總黃酮提取率略微下降。這是由于提取劑使用量越大，溶液滲透壓越大，越有利于牡丹花黃酮類化合物的滲出，且較大提取劑量能夠增加牡丹花黃酮類化合物與溶液的接觸面積；當液料比達到一定值后，牡丹花黃酮類化合物的提取量趨于穩(wěn)定，提取劑的繼續(xù)增加對其影響不明顯，且過高的液料比會給后續(xù)的濃縮等工作帶來一定壓力。從節(jié)能和效率的角度考慮，選擇40∶1為單因素試驗最佳液料比。

2. 1. 3 提取時間對牡丹花總黃酮提取率的影響 由圖3可知，隨著提取時間的延長，牡丹花總黃酮提取率逐漸提高，當提取時間達到40 min時，提取率最高，超過40 min后，提取率變化不顯著（P>0.05，下同）。時間過長，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，因此，選擇40 min為單因素試驗最佳提取時間。

2. 2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2. 2. 1 模型建立及其顯著性檢驗 根據(jù)Box-Behnken 8.0設(shè)計原理，設(shè)計17個處理組合，試驗設(shè)計及結(jié)果見表3。根據(jù)表3結(jié)果，利用Design-Expert 8.0.6建立牡丹花總黃酮提取率對乙醇體積分數(shù)、液料比、提取時間的二次方程模型為：Y=5.81+0.29A+0.13B+0.30C+

0.24AB+0.45AC+0.24BC-0.50A2-1.42B2-0.61C2。

對該模型進行方差分析，結(jié)果見表4。由表4可知，模型的F=49.78和P<0.01，表明該模型顯著。模型失擬項P=0.2902>0.05，相關(guān)系數(shù)R2=0.9846>0.8000，即模型失擬項不顯著，表明該模型具有極顯著的統(tǒng)計學意義。由回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知，該模型一次項A、C和二次項A2、B2、C2極顯著（P<0.01，下同），但一次項B不顯著。交互項AC對總黃酮提取率的影響極顯著，交互項AB、BC對提取率的影響顯著。3個因素對牡丹花總黃酮提取率影響的排序為提取時間>乙醇體積分數(shù)>液料比。

2. 2. 2 因素交互作用分析 乙醇體積分數(shù)、液料比和提取時間3個因素間的交互作用對牡丹花總黃酮提取率影響的三維空間響應(yīng)面圖如圖4～圖6所示。從響應(yīng)面的最高點及等高線可以看出，在所選的范圍內(nèi)存在極值，既是響應(yīng)面的最高點，又是底面上等值線最小橢圓的中心點。

圖4顯示提取時間與液料比的交互作用對牡丹花總黃酮提取效果的影響，其3D圖曲線陡，等高線接近橢圓形，即提取時間與液料比的交互效應(yīng)顯著；圖5顯示液料比與乙醇體積分數(shù)的交互作用對牡丹花總黃酮提取效果的影響，其3D圖曲線較陡，等高線橢圓弧度較大，即液料比與乙醇體積分數(shù)的交互效應(yīng)較顯著；圖6顯示提取時間與乙醇體積分數(shù)的交互作用對牡丹花總黃酮提取效果的影響，其3D圖曲線最陡，等高線橢圓弧度最大，即提取時間與乙醇體積分數(shù)的交互效應(yīng)最顯著。這與表4方差分析結(jié)果一致。

2. 2. 3 驗證試驗結(jié)果 響應(yīng)面優(yōu)化得到的提取工藝條件為：乙醇體積分數(shù)55.24%、液料比41.28∶1（mL/g）、提取時間44.58 min，在此條件下，牡丹花總黃酮提取率的預測值為5.96%。為檢驗響應(yīng)面法所得結(jié)果的可靠性，考慮到實際操作的便利，將提取工藝參數(shù)修正為：乙醇體積分數(shù)55%、液料比41∶1（mL/g）、提取時間45 min，實際測得牡丹花總黃酮提取率為6.08%，與理論預測值相比，其相對誤差為2.01%。說明該方程和實際情況比較相符，試驗結(jié)果充分驗證了模型的正確性，響應(yīng)面法對牡丹花總黃酮提取工藝的優(yōu)化結(jié)果有效。

3 討論

本研究以牡丹花為原料，通過單因素試驗與Box-Behnken 8.0試驗設(shè)計的響應(yīng)面試驗對牡丹花總黃酮提取工藝條件進行優(yōu)化，試驗模型擬合程度較好，可用此模型對試驗進行模擬和預測。響應(yīng)面優(yōu)化得到最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)55%、液料比41∶1 （mL/g）、提取時間45 min，在此條件下實際測得牡丹花總黃酮提取率為6.08%，較劉娟等（2012）采用閃式法提取牡丹花粉總黃酮所用乙醇體積分數(shù)（90%）低，較馮紀南等（2013）利用超聲波輔助提取臭牡丹中黃酮類化合物得到的提取率（2.653%）高，也較李佩艷等（2016）用酶法提取牡丹葉總黃酮所需時間（4 h）短。說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化牡丹花黃酮類化合物提取工藝具有所需試劑少、提取時間短、易操作等優(yōu)點。

響應(yīng)面法不僅能確保理論預測值與試驗實際值偏差小，還可分析各影響因素之間的交互作用（吳婧婧等，2014）。本研究考察乙醇體積分數(shù)、液料比和提取時間3個因素對牡丹花總黃酮提取率的影響，結(jié)果表明，乙醇體積分數(shù)、提取時間及其二者的交互作用對牡丹花總黃酮提取率有極顯著影響，乙醇體積分數(shù)與液料比、液料比與提取時間的交互作用對其有顯著影響，與馮紀南等（2013）的研究結(jié)果基本一致。

黃酮類化合物具有清除氧自由基、抗氧化、抗菌、抗癌等多種生理和藥理活性（周先艷等，2014；李樹立和劉玉衡，2015；況偉等，2015），但有關(guān)總黃酮清除亞硝酸鹽的研究報道較少，如何利用牡丹為總黃酮的工業(yè)化生產(chǎn)提供新來源，并開發(fā)有效實用的亞硝酸鹽天然清除劑有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的乙醇提取牡丹花總黃酮工藝具有所需試劑少、提取時間短、易操作等優(yōu)點，有較高的可行性。

參考文獻：

陳思勤，朱克儉，程曉燕，陳四明. 2012. 臭牡丹化學成分及其藥理作用研究進展[J]. 湖南中醫(yī)雜志，28（2）：141-142.

Chen S Q， Zhu K J， Cheng X Y， Chen S M. 2012. Research progress on chemical constituents and pharmacological effects of peony[J]. Hunan Journal of Traditional Chinese Medicine，28（2）：141-142.

馮紀南，黃海英，余瑞全，趙麗萍，鄧斌. 2013. 臭牡丹中黃酮類化合物的超聲輔助提取工藝研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，24（4）：850-852.

Feng J N，Huang H Y，Yu R Q，Zhao L P，Deng B. 2013. Study on the ultrasonic-assisted extraction process of flavonoids from Clerodendrum bungei[J]. Lishizhen Medicine and Materia Medica Research，24（4）：850-852.

高黎明，魏小梅，何仰清. 2003. 臭牡丹化學成分的研究[J]. 中國中藥雜志，28（11）：1042-1044.

Gao L M，Wei X M，He Y Q. 2003. Studies on chemical constituents in of Clerodendrum bungei[J]. China Journal of Chinese Materia Medica，28（11）：1042-1044.

況偉，劉志偉，張晨，陳丹. 2015. 艾草抗氧化活性物質(zhì)的提取分離[J]. 中國食品添加劑，（6）：109-113.

Kuang W，Liu Z W，Zhang C，Chen D. 2015. Extraction and pre-

liminary isolation of antioxidant ingredients from Artemisia argyi[J]. China Food Additives，（6）：109-113.

劉娟，李楠，王昌濤. 2012. 牡丹花粉黃酮的提取及抗氧化性研究[J]. 食品研究與開發(fā)，33（10）：39-44.

Liu J，Li N，Wang C T. 2012. Research on extraction method of flavonoids from peony pollen and its antioxidative activity[J]. Food Research and Development，33（10）：39-44.

李佩艷，韓四海，羅登林，趙勝娟，劉建學，尹飛. 2016. 牡丹葉黃酮的酶法提取條件優(yōu)化及其對亞硝酸鹽的清除作用[J]. 食品科學，37（6）：77-81.

Li P Y，Han S H，Luo D L，Zhao S J，Liu J X，Yin F. 2016. Optimization of enzymatic extraction and nitrite scavenging capacity of flavonoids from peony leaves[J]. Food Science，37（6）：77-81.

李樹立，劉玉衡. 2015. 毛藥忍冬花蕾抗氧化活性部位化學成分研究[J]. 廣西植物，35（4）：586-589.

Li S L，Liu Y H. 2015. Chemical constituents with antioxidative activity from the flower buds of Lonicera serreana[J]. Guihaia，35（4）：586-589.

王曉，耿巖玲，李福偉，王萍，程傳格，劉建華. 2005. 酶法提取牡丹花總黃酮[J]. 山東科學，18（4）：14-18.

Wang X，Geng Y L，Li F W，Wang P，Cheng C G，Liu J H. 2005. Enzymatic extraction of total flavonoids from Paeonia suffruticosa Andr. flowers[J]. Shandong Science，18（4）：14-18.

吳婧婧，梁貴秋，陸春霞，周曉玲，董桂清，李全，陸飛. 2014. 響應(yīng)面法對桑果醋發(fā)酵工藝的優(yōu)化[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報，45（2）：278-284.

Wu J J，Liang G Q，Lu C X，Zhou X L，Dong G Q，Li Q，Lu F. 2014. Optimization of fermentation process for mulberry vinegar by response surface methodology[J]. Journal of Sou-

thern Agriculture，45（2）：278-284.

吳震生，侯昌，毛文岳. 2013. 牡丹花蕊中總黃酮的提取與測定[J]. 食品與藥品，15（5）：344-345.

Wu Z S，Hou C，Mao W Y. 2013. Extraction and determination of total flavonoids from peony stamens and pistils[J]. Food and Drug，15（5）：344-345.

袁亞光，王成忠，饒鴻雁. 2013. 牡丹花中黃酮類化合物的研究進展[J]. 山東輕工業(yè)學院學報（自然科學版），27（4）：31-38.

Yuan Y G，Wang C Z，Rao H Y. 2013. Research progress of flavonoids in peony flowers[J]. Journal of Shandong Institute of Light Industry（Natural Science Edition），27（4）：31-38.

周紅林，劉建新，周俐，周青，連其深. 2006. 臭牡丹提取物抗炎鎮(zhèn)痛抗過敏作用的實驗研究[J]. 中國新藥雜志，15（23）：2027-2029.

Zhou H L，Liu J X，Zhou L，Zhou Q，Lian Q S. 2006. Anti-inflammatory，analgesic and anti-hypersensitive actions of extracts from Clerodendron bungei[J]. Chinese Journal of New Drugs，15（23）：2027-2029.

周先艷，朱春華，沈正松，楊雪，龔琪，岳建強. 2014. 檸檬抗癌活性成分研究進展[J]. 江西農(nóng)業(yè)學報，26（6）：49-53.

Zhou X Y，Zhu C H，Shen Z S，Yang X，Gong Q，Yue J Q. 2014. Research progress in anticancer active constituents of lemon[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，26（6）：49-53.

（責任編輯 羅 麗）