短期高溫脅迫對茄子主要生理指標及葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響

李艷艷 王俊青 李植良 孫保娟

摘 要 為了探討不同耐熱性茄子苗期短期高溫脅迫響應機制的差異，以茄子熱敏品系05-1和耐熱品系05-4為研究材料，研究不同時間（0、6、12、18 h）高溫脅迫對葉片細胞膜透性、AsA、GSH、可溶性糖含量變化和葉片解剖結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明：高溫脅迫后，耐熱品系的相對膜透性升高幅度明顯低于熱敏品系；同時耐熱品系較熱敏品系AsA和GSH含量高，而且耐熱品系GSH開始增加的時間早于熱敏品系；耐熱品系可溶性糖含量呈持續(xù)上升趨勢，而熱敏品系可溶性糖含量先上升后下降。從葉片解剖結(jié)構(gòu)來看，正常生長溫度下，耐熱品系要較熱敏品系茄子的葉肉細胞排列緊密；高溫脅迫后耐熱品系葉肉細胞和葉綠體發(fā)生膨大、變形的時間要遲于熱敏品系，與此同時，葉綠體淀粉類多糖顆粒呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

關鍵詞 茄子；高溫脅迫；生理指標；解剖結(jié)構(gòu)

中圖分類號 S641.1 文獻標識碼 A

Effects of Short Period of High Temperature on the Main

Physiological Index and Anatomical Structure of Leaves

in Eggplants with Different Thermo-tolerance

LI Yanyan1，2， WANG Junqing2， LI Zhiliang1，3， SUN Baojuan1，3 *

1 Vegetable Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou， Guangdong 510640， China

2 Pingdingshan University， Pingdingshan， Henan 467000， China

3 Guangdong Key Lab for New Technology Research of Vegetables， Guangzhou， Guangdong 510640， China

Abstract To study the different response mechanism to high temperature of different thermo-tolerance eggplant， thermo-tolerance eggplant inbreeding line 05-4 and thermo-sensitive inbreeding line 05-1 were used to investigate the changes in the membrane permeability， the concentrations of ascorbate（AsA）， glutathione（GSH）， soluble sugar， and anatomical structure under different period of high temperature stress（0， 6， 12， 18 h）. The results showed that the increase of the relative electrolyte leakage in 05-4 was evidently lower than that of 05-1 under high temperature stress. The concentrations of AsA and GSH in thermo-tolerance line were significantly higher than those of in thermo-sensitiveline， what's more， the starting time of GSH increase in thermo-tolerance line was much earlier than that of in thermo-sensitive line； Simultaneously， the soluble sugar concentrations in 05-4 continuously increased， but in 05-1 increased at 6h， then decreased rapidly. Compared with the thermo-sensitive line， it was observed that the mesophyll cells of the thermo-tolerance line 05-4 were more compact under normal temperature. The swell and deformation of the mesophyll cells and chloroplast in thermo-resistant line-4 was later than that of in thermo-sensitive line 05-1. Meanwhile， the particles of polysaccharide starch-like in the chloroplast decreased at the earlier stage of high temperature treatment， and slightly increased at the last two stages of high temperature stress.

Key words Eggplant； High temperature stress； Physiological index； Anatomical structure

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2016.09.019

茄子（Solanum melongema L.）為喜溫型蔬菜，在我國蔬菜生產(chǎn)上占有重要地位。茄子生長適宜溫度為22～30 ℃，在35 ℃以上生長發(fā)育各個階段都會表現(xiàn)出一定的高溫傷害癥狀，如葉片灼傷、花器官發(fā)育不良、座果率下降、畸形果增多，進而導致產(chǎn)量和品質(zhì)的下降[1-3]。高溫會引起植物葉片生理代謝紊亂和細胞結(jié)構(gòu)改變，對光合系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生破壞[4]。高溫脅迫對細胞的傷害之一是細胞膜透性提高，電解質(zhì)外滲，因而電解質(zhì)的滲漏率可以作為細胞受高溫脅迫傷害程度的指標，它可用相對電導率表示[5]。AsA（抗壞血酸）和GSH（谷胱甘肽）能清除葉綠體內(nèi)的活性氧，對葉綠體有一定的保護作用[6]，氧自由基動態(tài)平衡被破壞，植物的結(jié)構(gòu)與功能就可能受到損傷甚至出現(xiàn)死亡。滲透調(diào)節(jié)是植物忍耐和抵御高溫逆境的重要生理機制之一，可溶性糖是備受關注的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[7]。關于持續(xù)高溫脅迫對于茄子苗期生理指標的影響已有研究報道[3，8]，但是短期高溫脅迫對不同耐熱性茄子苗期主要生理指標以及葉肉細胞解剖結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。本實驗以熱敏茄子品系05-1和耐熱茄子品系 05-4為植物材料，通過測定短期高溫脅迫條件下葉片主要生理指標，結(jié)合觀察葉肉細胞解剖結(jié)構(gòu)，研究其對高溫脅迫的響應，比較耐熱和熱敏品系的變化差異，以期為探討茄子高溫脅迫響應機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

所用的茄子材料為廣東省農(nóng)業(yè)科學科院蔬菜研究所選育的苗期高溫脅迫鑒定及田間自然高溫開花結(jié)實鑒定均表現(xiàn)為耐熱的親本自交系05-4和熱敏感的親本自交系05-1[2-3]。其中05-4為華南特色紫紅長茄骨干系親本自交系，05-1為北方茄子類型中分離出來的自交系。

1.2 方法

1.2.1 植物材料的處理 供試品系的種子經(jīng)催芽后，采用穴盤育苗，待幼苗具4～5片真葉時放入人工智能光照培養(yǎng)箱，晝夜溫度為28 ℃/25 ℃，光/暗周期為12 h/12 h預培養(yǎng)3 d，濕度保持在70%～80%。然后，將材料分為兩組，一組進行高溫43 ℃處理，另一組仍在原培養(yǎng)條件下生長作對照，濕度保持不變。每處理3次重復，每個重復至少20株。分別在高溫脅迫0、2、6、12、18 h取材，取樣部位為植株莖端開始數(shù)第3片真葉。

1.2.2 相對電導率的測定 參照劉鴻先等[8]和賈開志等[9]的方法，略加修改，打孔器規(guī)格不一樣，但取的葉片面積是一樣的。幼苗經(jīng)高溫脅迫后，取相同部位葉片，用直徑1.0 cm打孔器在茄子葉片上取10個小圓片，放入試管中，加入蒸餾水20 mL，靜置2.5 h后，測定初始電導率（R1）；80 ℃水浴10 min，冷卻至初始溫度，測定電導率R2。兩次電導率的比值即為相對電導率（R'=R1/R2）。

1.2.3 AsA含量的測定 參照Kampfenkel等[10]Fe3+還原法。

1.2.4 GSH含量的測定 參照Ellman[11]的方法，稍加修改，在提取樣品的質(zhì)量和試劑體積上做了同等比例的縮小。取樣品液0.2 mL，加入150 mmol/L的NaH2PO4溶液（pH7.7）2.6 mL，混合后再加入DTNB試劑（75.3 mg DTNB 溶于30 mL、0.1 mol/L 的磷酸緩沖液，pH6.8），以加磷酸緩沖液代替DTNB試劑作空白，搖勻，于30 ℃保溫5 min，然后測定412 nm波長下的光吸收值。

1.2.5 可溶性糖含量的測定 采用蒽酮法[12]。

1.2.6 制片及解剖結(jié)構(gòu)觀察

（1）半薄切片法及甲苯胺藍染色。參照李正理[13]的方法。取高溫處理不同時間的茄子葉片（選取處理和對照植株從莖端開始數(shù)第3片葉，于葉片中部主脈與邊緣取約4 mm長，1 mm寬的小組塊），迅速固定于0.2 mol/L磷酸緩沖液（pH7.2）配制的4%戊二醛中，Epon812環(huán)氧樹脂包埋，奧地利Reichert-Jung超薄切片機切片，切片厚2 μm。用0.05%甲苯胺藍染色45 s，中性樹膠封片，Leica DMLB顯微鏡觀察，Leica DFC320數(shù)碼相機照相。

（2）多糖類的組織化學定位。參照匡海學[14]的方法。半薄切片采用高碘酸-席夫試劑（PAS）進行反應，在Leica DMLB顯微鏡下觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫對茄子幼苗葉片相對膜透性的影響

從圖1可知，在高溫脅迫過程中，05-1和05-4茄子幼苗葉片相對膜透性均表現(xiàn)出上升趨勢，高溫脅迫18 h相對膜透性都達到最大，但耐熱品系05-4比熱敏品種05-1提高幅度小，前者為43.4%，后者為71.7%，說明耐熱品系05-4細胞膜較穩(wěn)定，受熱害程度較輕。

2.2 高溫脅迫對茄子幼苗葉片AsA和GSH含量的影響

圖2表明，隨著高溫處理時間的延長，05-1和05-4茄子幼苗葉片AsA的含量達到最大后下降；與對照0 h相比，高溫脅迫6 h AsA含量在耐熱和熱敏品系中均升高，之后隨著脅迫時間的延長逐漸下降，且在整個高溫脅迫期間耐熱品系AsA含量保持著較熱敏品系高的趨勢。相對0 h而言，高溫脅迫6 h時GSH含量變化在05-1和05-4中相反，前者顯著降低，后者顯著升高；隨著高溫脅迫時間延長二者均表現(xiàn)緩慢上升，但耐熱品系一直顯著高于熱敏品系。上述結(jié)果說明短期高溫脅迫過程中耐熱品系05-4 AsA和GSH含量的升高可以降低氧化脅迫對細胞的破壞程度，從而表現(xiàn)出較好的耐熱性。

2.3 高溫脅迫對茄子幼苗葉片可溶性糖含量的影響

植物體內(nèi)的可溶性糖有利于降低細胞的滲透勢，減少水分的損失。從圖3可以看出，高溫脅迫初期，05-1和05-4可溶性糖含量都顯著增加，但熱敏品種隨高溫處理時間的延長出現(xiàn)了顯著下降的趨勢，而耐熱品系可溶性糖含量一直處于增加的趨勢，高溫脅迫12 h后，耐熱品系可溶性糖含量顯著高于熱敏品系。說明隨著脅迫時間的持續(xù)耐熱品系05-4的可溶性糖含量保持增加并最終高于熱敏品系05-1。因此推測高溫脅迫下可溶性糖含量變化趨勢與品種耐熱性存在一定的相關性。

2.4 高溫脅迫下茄子幼苗葉片組織結(jié)構(gòu)和葉綠體中貯存物質(zhì)的變化

從葉片形態(tài)上看，05-4與05-1相比，葉色濃綠，葉片較厚，具體表現(xiàn)為對用于電導率測定的1 cm孔徑的圓片稱重，05-4的每20個圓片重量為（0.434 8±0.000 8）g，05-1的每20個圓片重量為（0.384 4±0.000 3）g，二者差異顯著。從葉片半薄切片顯微觀察結(jié)果可見，茄子葉片上、下表皮各有一層細胞組成，在橫切面上成方形或長方形（圖4-A、B）；與熱敏品系05-1相比（圖4-B），耐熱品系05-4柵欄組織和海綿組織中的葉肉細胞排列都更加緊密整齊，胞間隙?。▓D4-A），這有利于保持水分，降低高溫失水傷害。

未高溫脅迫時，葉綠體緊密排列在葉肉細胞膜的周圍。在高溫脅迫2 h時，熱敏品系05-1葉肉細胞表現(xiàn)出輕微的質(zhì)壁分離，出現(xiàn)不同程度的細胞膨脹，葉綠體膨大變形，分布位置也發(fā)現(xiàn)了明顯變化，部分葉綠體轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中央（圖4-D），耐熱品系葉肉細胞也出現(xiàn)了膨脹，但細胞結(jié)構(gòu)正常，葉綠體依然沿細胞壁邊緣分布（圖4-C）。隨著高溫脅迫時間的延長，熱敏品系05-1葉片葉肉細胞的葉綠體膨脹程度加重，破壞的數(shù)量增多，且葉綠體排列出現(xiàn)無規(guī)則狀態(tài)；葉片柵欄組織細胞畸形，且因膨脹縮短加劇，且排列紊亂，并有海綿組織細胞垛疊的現(xiàn)象（圖4-F、H、J）；耐熱品系高溫脅迫12 h內(nèi)葉肉細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)變化并不顯著，且葉綠體排列變化不大（圖4-E、G），18 h時葉肉細胞的變形程度加重（圖4-I）。

高碘酸-席夫試劑（PAS）反應可對不溶性多糖進行定位，細胞內(nèi)的糖原或多糖會形成紅色染料而沉積于細胞中，顏色深淺與多糖含量成正比。淀粉是在葉綠體或淀粉體中通過一系列酶促反應合成的。在正常生長溫度下，茄子葉肉細胞葉綠體和細胞質(zhì)內(nèi)可以觀察到淀粉顆粒的存在（圖5-A、B），而且耐熱品系的密度高于熱敏品系；高溫脅迫2 h后，耐熱品系和熱敏品系葉肉細胞內(nèi)的淀粉顆粒密度均降低且淀粉顆粒變?。▓D5-C、D），耐熱仍高于熱敏；高溫脅迫6 h時，耐熱品系和熱敏品系葉肉細胞內(nèi)都基本觀察不到淀粉顆粒的存在（圖5-E、F）；高溫脅迫12 h和18 h后淀粉顆粒又有上升的趨勢（圖5-G、H、I、J）。

3 討論與結(jié)論

高溫脅迫的本質(zhì)就是氧化脅迫，在正常情況下細胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生與清除處于動態(tài)平衡，不會引起植物細胞傷害，但在高溫脅迫條件下，活性氧積累會導致植物代謝失活、細胞死亡、光合作用速率下降[15-16]。溫度逆境對植物的傷害涉及到一系列生理生化變化，而由高低溫導致的活性氧積累及其所引起的氧化脅迫被認為是植物受冷熱傷害的重要原因[17]，高溫逆境對植物細胞的傷害多為膜系統(tǒng)受損，直觀表現(xiàn)為電解質(zhì)泄漏，電導率上升[18]。本研究表明，在短期高溫脅迫處理過程中，耐熱品系05-4相對膜透性較熱敏品系05-1低，孫保娟等[19]在持續(xù)高溫脅迫對不同耐熱性茄子膜相對透性的影響中也得到了相同的結(jié)果。在植物葉綠體和細胞質(zhì)中，AsA主要通過抗壞血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH）循環(huán)清除H2O2[20]，從而在維護膜結(jié)構(gòu)的完整性和防御膜脂過氧化中起著重要作用。高AsA含量不僅能提高作物的品質(zhì)，而且增加了對逆境的抗性[21-22]。從本研究結(jié)果來看，高溫脅迫初期，耐熱品系05-4 GSH含量顯著上升，同時相同處理條件下，05-4較熱敏品系05-1 AsA含量高。由于較高含量AsA 增強了細胞清除活性氧自由基的能力，所以不但減輕了其對膜系統(tǒng)的攻擊與破壞，也維持正常的細胞膜透性。高溫脅迫初期耐熱品系茄子葉片GSH含量表現(xiàn)出先上升，原因可能是由于脅迫初期其合成能力增強，對逆境響應迅速，但隨著脅迫加劇，因為在清除逆境導致的活性氧積累中起主要作用的AsA-GSH循環(huán)需要大量GSH的參與[23-24]，導致脅迫后期GSH水平變化不大。而熱敏品系05-1高溫脅迫下GSH含量表現(xiàn)出先下降但隨后上升，說明熱敏品系中GSH對逆境響應遲鈍，而后期GSH含量上升可能是高溫損傷的結(jié)果?？傮w表現(xiàn)出熱敏品系對高溫逆境的適應能力明顯較弱。

另外還觀察到，耐熱品系的葉肉細胞排列緊密，這一結(jié)構(gòu)特點均與保持水分、避免高溫失水傷害相適應。這些特征表明在高溫下不易造成葉片水分過度蒸發(fā)而發(fā)生細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化，造成葉片損傷。這些都體現(xiàn)了旱生植物葉片的結(jié)構(gòu)特征[25]來抵御熱傷害。高溫脅迫引起植物體各個細胞和亞細胞結(jié)構(gòu)紊亂，從而對植物產(chǎn)生傷害，特別是光合作用的主要器官葉片對高溫脅迫較為敏感[26]。高溫脅迫下葉肉細胞出現(xiàn)不同程度細胞膨脹變形，這與病菌侵染的葉肉細胞觀察結(jié)果相似[27]，且熱敏品系比耐熱品系的較早出現(xiàn)，這也證明了前面測定耐熱品種較高含量的AsA和GSH對細胞膜的完整性和細胞正常功能的保護作用。

高溫脅迫下耐熱和熱敏茄子品系葉片中葉綠體淀粉顆粒減少，這與豇豆（Vigna unguiculata）的組織培養(yǎng)細胞、菜豆幼苗和番茄花期高溫脅迫處理時觀察到質(zhì)體內(nèi)淀粉顆粒變化一致[28-29]。同時測定耐熱品系比熱敏品系可溶性糖的含量有增高的趨勢，推測此方式有利于增強抗高溫的能力。熱敏品系在高溫脅迫12 h出現(xiàn)淀粉顆粒的大量積累，耐熱品種出現(xiàn)則相對較晚，進而后者表現(xiàn)出相對強的抗性。淀粉顆粒減少累積的原因可能是高溫脅迫影響葉片光合作用， 在處理初期，光合產(chǎn)物形成少，而呼吸作用加劇消耗大；而隨著高溫脅迫時間的增長，光合同化物的利用率下降或呼吸作用降低所致淀粉顆粒增大，或者是它們共同作用的結(jié)果，張潔等[30]認為是植株韌皮部胼胝體增多，堵塞維管束，影響同化產(chǎn)物在韌皮部的運輸，這一原因有待研究。

綜上所述，不同耐熱性茄子在高溫脅迫下有關生理指標和解剖結(jié)構(gòu)的變化是不同的，這些不同在一定程度上揭示了茄子耐熱生理和結(jié)構(gòu)特征的基礎。

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