一株產(chǎn)聚-β-羥基脂肪酸酯嗜鹽菌的篩選與鑒定1)

王海飆　劉長(zhǎng)莉　劉潤(rùn)澤　常樂　王珺

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

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一株產(chǎn)聚-β-羥基脂肪酸酯嗜鹽菌的篩選與鑒定1)

王海飆劉長(zhǎng)莉劉潤(rùn)澤常樂王珺

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040)

摘要以大慶地區(qū)鹽堿土壤為樣品經(jīng)蘇丹黑B染色、尼羅藍(lán)染色分離出6株具有聚-β-羥基脂肪酸酯(PHA)合成能力的菌株，選取產(chǎn)量較高的DQ-4進(jìn)行鑒定，通過細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定、16S rRNA分析并結(jié)合其生理生化特性，將菌株DQ-4鑒定為嗜鹽單胞菌(Halomonas sp.)。GC-MS分析表明，菌株DQ-4合成的聚合物具有與PHA標(biāo)樣相似的峰值。FT-IR分析顯示，菌株DQ-4合成的聚合物在1 726、2 980、2 934、2 876 cm-1處出現(xiàn)了PHA的特征性吸收峰。因此，將其產(chǎn)物確定為PHA類化合物。菌株DQ-4的最適生長(zhǎng)條件，溫度38 ℃、pH值=9、轉(zhuǎn)速160 r·min-1、500 mL錐形瓶的裝液量為100 mL，此條件下菌株DQ-4的PHA產(chǎn)量可達(dá)5.88 g·L-1。

關(guān)鍵詞聚-β-羥基脂肪酸酯；嗜鹽菌；紅外光譜

分類號(hào)Q939.99

Isolation and Identification of A PHA-accumulating Halophilic Bacterium and Its Growth Characteristics//

Wang Haibiao, Liu Changli, Liu Runze, Chang Le, Wang Jun

(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：97-100，107.

Six PHA-accumulating strains were isolated with the usage of Sudan black stain, Nile blue staining from saline soil in the region of Daqing, China. Impressing on bacteria morphology salinity resistance, combined with the analysis of the 16S rRNA, a higher strain named DQ-4 was identified asHalomonassp.. The product of strain DQ-4 was similar with PHA standard by GC-MS. The FT-IR spectra of strain DQ-4 had a characteristic sharp absorption band around 1 726, 2 980, 2 934 and 2 876 cm-1. The optimal growth conditions for strains of DQ-4 are 38 ℃ temperature, pH value of 9, the speed of 160 r·min-1, and the fluid volume of 100/500 mL in flask with the PHA synthesis of 5.88 g·L-1.

KeywordsPHA; Halomonas; FT-IR

隨著人類社會(huì)的快速發(fā)展，以石油等化石能源為原料的塑料制品被大量使用，帶來了巨大的環(huán)境問題，同時(shí)化石燃料的不斷枯竭，尋找一種環(huán)境友好的、可降解的新型塑料成為科研熱點(diǎn)。聚-β-羥基脂肪酸酯(PHA)是一種能夠自然降解的環(huán)境友好型生物塑料高分子化合物，近年來發(fā)展迅速并被重點(diǎn)關(guān)注。同時(shí)，PHA也是微生物體內(nèi)的碳源和能源貯藏物質(zhì)[1]，其某些熱力學(xué)性質(zhì)與傳統(tǒng)的熱塑性材料如聚丙烯等極其相似[2]，又因其可以通過糖、脂肪酸等可再生資源進(jìn)行合成，因此又被稱為“21世紀(jì)的綠色材料”。

目前已經(jīng)驗(yàn)證可以合成PHA及其系列化和物的菌株主要有：真養(yǎng)產(chǎn)堿桿菌、重組大腸桿菌[3]、巨大芽孢桿菌[4]、拜氏固氮菌[5]、嗜鹽菌[6]等數(shù)十種微生物。在實(shí)際工業(yè)生產(chǎn)中，為了降低生產(chǎn)成本，篩選出低成本的PHA合成菌株成為研究的主要方向。

嗜鹽菌是一類常見的嗜極微生物，能夠適應(yīng)較高的滲透壓，即在鹽質(zhì)量濃度>3.5 g·L-1的超鹽質(zhì)量濃度下生活[7]。而且在較高的鹽質(zhì)量濃度下，其他微生物難以生長(zhǎng)，因此可以利用嗜鹽菌的嗜鹽特性抑制其他微生物生長(zhǎng)。采用嗜鹽菌作為聚-β-羥基脂肪酸酯的生產(chǎn)平臺(tái)能夠省去滅菌環(huán)節(jié)，進(jìn)而大幅降低生產(chǎn)成本。

1材料與方法

1.1土壤樣品

土樣采集自黑龍江省大慶市紅崗區(qū)杏四排路北的鹽堿地。

1.2培養(yǎng)基

初篩培養(yǎng)基(PCS培養(yǎng)基)：羧甲基纖維素鈉5.0 g，牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉1.0 g，NaCl 60.0 g·L-1，瓊脂20.0 g。

發(fā)酵培養(yǎng)基：選用礦物鹽培養(yǎng)基[3]，葡萄糖60.0 g·L-1，NaCl 60.0 g·L-1，以NaOH調(diào)節(jié)pH值為9。

1.3產(chǎn)PHAs嗜鹽菌株的篩選與鑒定

初篩。將稀釋后的土壤樣品涂布于初篩培養(yǎng)基上，將獲得的菌株進(jìn)行尼羅藍(lán)染色和蘇丹黑B染色觀察。

復(fù)篩。分別將初篩的菌株挑入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37 ℃、170 r·min-1震蕩培養(yǎng)48 h，用次氯酸鈉/氯仿法[8]提取PHAs，并進(jìn)行產(chǎn)量測(cè)定。

菌株形態(tài)及生理生化特征鑒定。對(duì)菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色和鞭毛染色。利用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管對(duì)菌株進(jìn)行硝酸鹽培養(yǎng)基生長(zhǎng)、糖發(fā)酵產(chǎn)酸、淀粉水解、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽還原等生理生化試驗(yàn)，依據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[9]和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)(第9版)》[10]進(jìn)行常規(guī)生理生化鑒定。

細(xì)菌16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。菌株基因組采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取(北京莊盟試劑公司)，以細(xì)菌總DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-GGTTACCTGTTACGT-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系及條件參照說明書。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和特異性。PCR產(chǎn)物純化后，用膠回收試劑盒回收目的片段，并與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coliJM109，然后在含有氨芐霉素(AMP)的培養(yǎng)基中挑取白色單菌落(陽性轉(zhuǎn)化子)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將陽性克隆子送至北京金唯智公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序所獲序列信息提交GenBank，利用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選擇高同源性序列，采用MEGA5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分支穩(wěn)定性用Bootstrap分析，重復(fù)1 000次。

1.4菌株DQ-4的發(fā)酵條件優(yōu)化

培養(yǎng)溫度對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響。分別在26、28、30、32、34、36、38、40 ℃條件下利用發(fā)酵培養(yǎng)基(pH=7)搖瓶發(fā)酵DQ-4，搖床轉(zhuǎn)速為160 r·min-1，裝液量為100 mL(500 mL錐形瓶中)。培養(yǎng)60 h后測(cè)得菌體干質(zhì)量及PHA合成量。

初始pH值對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響。設(shè)置pH梯度為7、8、9、10，在36 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為160 r·min-1的條件下，按裝液量為100 mL(500 mL錐形瓶中)進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。培養(yǎng)60 h后測(cè)定菌體干質(zhì)量及PHA合成量。

搖床轉(zhuǎn)速對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響。在菌株DQ-4發(fā)酵過程中選用不同轉(zhuǎn)速(100、120、140、160、180 r·min-1)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為36 ℃，培養(yǎng)基pH值為9。培養(yǎng)60 h測(cè)定菌體干質(zhì)量及PHA合成量。

裝液量對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響。分別于500 mL錐形瓶中加入50、100、150、200 mL培養(yǎng)基，pH值為9，轉(zhuǎn)速160 r·min-1，培養(yǎng)60 h后測(cè)定菌體干質(zhì)量及PHA合成量。

對(duì)上述數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，通過描述統(tǒng)計(jì)以及方差分析對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，采用Duncan檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較。

1.5菌株DQ-4的產(chǎn)物分析

GC-MS分析。分別稱取一定量PHA標(biāo)準(zhǔn)物(Sigma)和提取出的聚合物于酯化管中，加入2 mL體積分?jǐn)?shù)為15%的濃硫酸的甲醇溶液和2 mL氯仿(含0.5 g·L-1苯甲酸甲酯)，100 ℃加蓋密封反應(yīng)3 h。反應(yīng)結(jié)束冷卻后，加入1 mL去離子水，振蕩均勻，離心分層(3 500 r·min-1、10 min)。取下層氯仿相進(jìn)行氣質(zhì)聯(lián)機(jī)分析。

進(jìn)樣量為1 μL；氣化室溫度為260 ℃，檢測(cè)器溫度為300 ℃；初始柱溫80 ℃，停留1.5 min后，以30 ℃·min-1的速度升溫至240 ℃，停留2 min；載氣為高純氦氣，流速為30 mL·min-1，分流比為30∶1。

FT-IR分析。參照文獻(xiàn)[11]，取提純的聚合物樣品，以KBr壓片，利用美國(guó)PerkinElmer公司的Spectrum100型傅立葉紅外光譜儀測(cè)定紅外吸收光譜(FT-IR)。

2結(jié)果與分析

2.1產(chǎn)PHAs菌株篩選

初篩。將從土壤樣品中分離的菌落接入初篩培養(yǎng)基，經(jīng)蘇丹黑染色，在光學(xué)顯微鏡下，以視野內(nèi)黑色顆粒聚集多寡為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。選取細(xì)胞中黑色顆粒大、數(shù)量多的菌株移入尼羅藍(lán)培養(yǎng)基培養(yǎng)，在紫外燈下挑取具有熒光的單菌落，獲得6株具有PHAs合成能力的菌株。

復(fù)篩。將上述6株菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，48 h后測(cè)定PHAs干質(zhì)量比，結(jié)果見表1。經(jīng)過比較后，選取菌株DQ-4進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1　產(chǎn)PHAs菌株的復(fù)篩結(jié)果

2.2菌株鑒定

2.2.1菌株的形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定

菌株DQ-4在光學(xué)顯微鏡下可見桿狀，在PCS固體培養(yǎng)基上可見菌落呈乳白色，邊緣整齊，細(xì)菌革蘭氏染色為陰性。利用電鏡對(duì)菌株進(jìn)行觀察，菌株DQ-4呈桿狀、無鞭毛，長(zhǎng)約500 nm。菌株DQ-4能夠利用葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖，還可利用酵母抽提物以及羧甲基纖維素鈉(CMC)，證明其有一定的纖維素分解能力。菌株DQ-4的丙二酸鹽、西蒙氏枸緣酸鹽試驗(yàn)呈陽性，不能還原硝酸鹽、不能產(chǎn)生H2S，不能液化明膠，嗜鹽性試驗(yàn)陽性。以上特征與嗜鹽菌相符。

2.2.2菌株DQ-4的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)菌株DQ-4進(jìn)行16S rDNA鑒定，獲得了1條1 354 bp的序列，將測(cè)序所獲序列信息提交GenBank，獲取登錄號(hào)為KT961118。利用BLAST程序進(jìn)行比對(duì)，選擇高同源性序列，采用MEGA5.2軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。進(jìn)化樹分支穩(wěn)定性用Bootstrap分析，重復(fù)1 000次。獲得進(jìn)化樹(圖1)。由圖1可以看出，菌株DQ-4與Halomonaselongata處在同一分支，結(jié)合生理生化分析、細(xì)菌形態(tài)將菌株DQ-4鑒定為嗜鹽單胞菌(Halomonassp.)。

圖1　菌株DQ-4的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3菌株DQ-4的生長(zhǎng)特性

2.3.1培養(yǎng)溫度對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響

如表2所示，菌株DQ-4在26～40 ℃均可生長(zhǎng)。在26～38 ℃，隨培養(yǎng)溫度的升高菌株DQ-4的生長(zhǎng)及PHA的積累量均有所升高。方差分析表明，溫度對(duì)PHA的合成量有極顯著影響(F=89.674，顯著性p<0.001)。Duncan檢驗(yàn)表明，在38 ℃時(shí)，PHA的合成量顯著高于其余溫度水平，此時(shí)PHA合成量占菌體干質(zhì)量的60.46%，隨溫度的繼續(xù)上升，細(xì)菌的生長(zhǎng)量及PHA積累量開始下降。

表2　培養(yǎng)溫度對(duì)菌株DQ-4的生長(zhǎng)及PHA積累的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3.2pH值對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響

嗜鹽菌一般具有耐堿性，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，如表3所示，菌株最高可在pH為11時(shí)生長(zhǎng)，但是菌株生長(zhǎng)情況欠佳且PHA積累量極低，說明過高的pH值抑制了菌株對(duì)PHA的積累。方差分析表明，pH值對(duì)PHA合成量的影響差異極顯著(F=436.568，p<0.001)。經(jīng)過Duncan檢驗(yàn)可知，在pH值為9時(shí)，最適于PHA的合成，此時(shí)細(xì)菌生長(zhǎng)量和PHA積累量同步達(dá)到最大。

表3　初始pH值對(duì)菌株DQ-4的生長(zhǎng)及PHA積累的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3.3轉(zhuǎn)速對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響

由表4所示，在100～180 r·min-1，搖床轉(zhuǎn)速的升高可以促進(jìn)菌株生長(zhǎng)。方差分析表明，搖床轉(zhuǎn)速對(duì)PHA合成量有極顯著影響(F=160.204，p<0.001)。經(jīng)過Duncan檢驗(yàn)可知，轉(zhuǎn)速為160 r·min-1時(shí)PHA的積累差異性最明顯，此時(shí)PHA的積累量為4.71 g·L-1，占菌體干質(zhì)量的70.6%，較轉(zhuǎn)速為100 r·min-1時(shí)提高了34.92%。

表4　搖床轉(zhuǎn)速對(duì)菌株DQ-4的生長(zhǎng)及PHA積累的影響

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.3.4裝液量對(duì)DQ-4生長(zhǎng)的影響

如表5所示，隨裝液量的升高菌株的生長(zhǎng)量逐漸降低。較低的裝液量有利于氧氣的供應(yīng)，這表明了菌株DQ-4的好氧性。但過低的裝液量導(dǎo)致菌株徒長(zhǎng)而不利于PHA的積累。方差分析表明，裝液量對(duì)PHA合成量的影響差異極顯著(F=72.708，p<0.001)。經(jīng)過Duncan檢驗(yàn)可知，在100 mL(500 mL錐形瓶中)進(jìn)行發(fā)酵時(shí)PHA的值顯著高于其余裝液量水平的值。此時(shí)菌體的PHA積累量達(dá)4.30 g·L-1，占菌體干質(zhì)量的58.12%。

表5　不同裝液量下菌株DQ-4的生長(zhǎng)及PHA積累情況

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；同列數(shù)字后不同字母表示差異顯著(p<0.05)；裝液量指500 mL錐形瓶中的液體體積。

2.3.5優(yōu)化發(fā)酵條件下菌株DQ-4的生長(zhǎng)曲線及PHA合成特征

按上述試驗(yàn)結(jié)果，調(diào)整培養(yǎng)基初始pH為9，裝液量為100 mL(500 mL錐形瓶中)，在38 ℃、160 r·min-1的條件下培養(yǎng)DQ-4，獲得如圖2所示的菌株生長(zhǎng)曲線及PHA合成量變化情況。菌株DQ-4在接種后的6 h處于延滯期，16 h后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，同時(shí)開始積累PHA，在48 h后處于穩(wěn)定生長(zhǎng)期，細(xì)菌到達(dá)穩(wěn)定生長(zhǎng)期后，PHA合成能力仍進(jìn)一步上升，至60 h處PHA積累量達(dá)到最大，達(dá)5.88 g·L-1，隨后PHA積累量有小幅下降，可能與細(xì)菌大量生長(zhǎng)，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不足而分解PHA有關(guān)。

圖2　菌株DQ-4的生長(zhǎng)及PHA積累曲線

2.4FT-IR分析

傅立葉紅外光譜結(jié)果(圖3)顯示，菌株DQ-4合成的聚合物在1 726 cm-1處強(qiáng)吸收峰，此處出現(xiàn)的峰值代表了聚酯的羰基(CO)特征性吸收峰，在2 980、2 934、2 876 cm-1出現(xiàn)的吸收峰代表了甲基和次甲基的C—H伸縮振動(dòng)，Hong K et al.[11]證明了這2個(gè)基團(tuán)是PHAs類物質(zhì)的特征基團(tuán)。在1 050～1 350 cm-1出現(xiàn)了大量的吸收峰，這與C—O—C的對(duì)稱和不對(duì)稱振動(dòng)有關(guān)。FT-IR結(jié)果顯示，菌株DQ-4合成的聚合物具有PHA類化合物的特征，結(jié)合與PHA樣品比對(duì)，基本確定菌株DQ-4合成的化合物為PHA。

圖3PHA標(biāo)樣(a)及菌株DQ-4合成的聚合物(b)的紅外光譜

3結(jié)論與討論

以大慶地區(qū)鹽堿地土壤為樣品，分離篩選得到1株合成PHA能力較強(qiáng)的菌株，對(duì)菌株進(jìn)行生理生化分析及16S rRNA序列比對(duì)，確定菌株為嗜鹽單胞菌，命名為HalomonasDQ-4。菌株經(jīng)尼羅藍(lán)染色在紫外燈下呈熒光，菌株合成產(chǎn)物經(jīng)GC-MS分析具有PHA相似結(jié)構(gòu)，傅立葉紅外光譜掃描顯示其產(chǎn)物在1 726 cm-1處有較強(qiáng)吸收峰，而此處為PHA系列化合物的特征峰。綜合以上，確認(rèn)該菌株具有PHA合成能力。利用礦物鹽培養(yǎng)基進(jìn)行搖瓶發(fā)酵特性探究，菌株DQ-4在培養(yǎng)基初始pH為9，按裝液量為100 mL(500 mL錐形瓶中)，在38 ℃、160 r·min-1的條件下發(fā)酵，菌株DQ-4的PHA積累能力最強(qiáng)。在上述條件下，HalomonasDQ-4在48 h處達(dá)到生長(zhǎng)最大值，在60 h菌株合成PHA量達(dá)到最大，產(chǎn)量可達(dá)5.88 g·L-1。

嗜鹽菌作為常見的嗜極微生物，因其具有多方向的PHA合成能力而受到人們的廣泛研究。Guzmánetal.[12]利用Halomonasboliviensis菌株同步合成了PHB和四氫甲基嘧啶羧酸；Kawataetal.[13]利用Halomonassp.KM-1菌株合成P3HB量達(dá)15.2g·L-1；Tanetal.[14]利用篩選出的HalomonasTD-01菌株采取“饑餓-豐盛”培養(yǎng)模式使PHB合成量達(dá)到64.00g·L-1。以上研究說明，嗜鹽菌經(jīng)進(jìn)一步馴化、開發(fā)可以作為高產(chǎn)PHA生產(chǎn)平臺(tái)而被廣泛應(yīng)用，同時(shí)嗜鹽菌能夠發(fā)揮高鹽高堿條件下的耐受性而抑制其他微生物生長(zhǎng)，據(jù)此可省去滅菌環(huán)節(jié)，實(shí)現(xiàn)開放培養(yǎng)，進(jìn)而大幅降低生產(chǎn)成本。此外，在本研究中篩選的菌株還具有纖維素分解能力，其利用纖維素合成PHA的能力值得后續(xù)深入研究。

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收稿日期：2016年1月13日。

第一作者簡(jiǎn)介：王海飆，男，1992年1月生，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，碩士研究生。E-mail：wanghaibiao@yeah.net。通信作者：劉長(zhǎng)莉，東北林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，副教授。E-mail：609849343@qq.com。

1)國(guó)家自然科學(xué)基金資助(J1210053)。

責(zé)任編輯：程紅。