大花四照花種子休眠解除過(guò)程中種皮和胚乳結(jié)構(gòu)變化1)

周健　代松　錢存夢(mèng)　蘇友誼　李淑嫻

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

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大花四照花種子休眠解除過(guò)程中種皮和胚乳結(jié)構(gòu)變化1)

周健代松錢存夢(mèng)蘇友誼李淑嫻

(南京林業(yè)大學(xué)，南京，210037)

摘要為探討種皮、胚乳對(duì)大花四照花種子萌發(fā)的影響，以不同解除休眠處理后大花四照花種子為材料，開(kāi)展了種皮透水性試驗(yàn)，并分別對(duì)其種皮和胚乳進(jìn)行了掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)觀察。結(jié)果表明：大花四照花種皮存在透水性障礙。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其種皮由外到內(nèi)依次為表皮層、柵欄層、薄壁細(xì)胞層以及纖維細(xì)胞層。表皮層由多層排列緊密的厚壁細(xì)胞組成。柵欄層則由單層緊密排列的長(zhǎng)柱狀大石細(xì)胞構(gòu)成，柵欄層可能是阻礙種子吸水的主要原因。酸蝕和低溫層積對(duì)種皮結(jié)構(gòu)都會(huì)產(chǎn)生一定影響。低溫層積處理能破壞種皮表層結(jié)構(gòu)，同時(shí)還能改變內(nèi)部柵欄層細(xì)胞結(jié)構(gòu)，種子低溫層積90 d后，種皮出現(xiàn)裂縫直達(dá)內(nèi)部薄壁細(xì)胞層。透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，低溫層積過(guò)程中，胚乳細(xì)胞內(nèi)大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)不斷降解，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝速度逐漸加快，低溫層積90 d，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本降解，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等細(xì)胞器相繼出現(xiàn)，種子休眠解除。濃硫酸酸蝕能加快大花四照花種皮結(jié)構(gòu)的改變和胚乳細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝，促進(jìn)該種子休眠的解除。

關(guān)鍵詞大花四照花；種子休眠；種皮；胚乳；細(xì)胞結(jié)構(gòu)

分類號(hào)S722.1

Ultrastructure Changes of Seed Coat and Endosperm onCornusfloridaSeed during Dormancy Breaking//

Zhou Jian, Dai Song, Qian Cunmeng, Su Youyi, Li Shuxian

(Nangjing Forestry University, 210037 Nanjing, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(5)：34-38.

In order to investigate the effect of seed coat and endosperm on the germination ofCornusfloridaseeds, the ultrastructure of seed coat and endosperm ingredients ofC.floridaseed with different treatments was systematically investigated by using scanning electron microscope (SEM) and transmission electron microscope (TEM), combining with the study of water permeability. Results of water uptake revealed the seed coat ofC.floridcould retard water uptake. By SEM images, from the exterior to the interior, the seed coat ofC.floridconsisted of four layers: the epidermal layer, the palisade layer, the parenchymatous layer and the fibrocyte layer. The epidermal layer consisted of multilayer sclerenchymatous cell. The palisade layer consisted of a monolayer macrosclereids with thick walls elongated longitudinally, and it may be the main barrier controlling the entrance of water through seed coat. Both of cold stratification and acid etching could change the seed coat structure ofC.florid. The epidermal layer and the palisade layer ofC.floridseed coat were damaged after treated by concentrated sulphuric acid. Cold stratification could destroy the out layer ofC.floridseed coat and change the structure of palisade layer to some extent. When seeds were cold stratified at 5 ℃ for 90 d, the cracks were appearing through the epidermal layer and the palisade layer. By TEM, with theC.floridseed dormancy released, macromolecule nutrients in the endosperm gradually decomposed and metabolism boosted. When seeds were cold stratified for 90 d, nutrients in the endosperm gradually decomposed, mitochondria, endoplasmic reticulum, golgi apparatus appeared, and its dormancy was broken. In addition, proper sulfuric acid treating could accelerate the break ofC.floridseed dormancy by expediting the change of seed coat structure and the metabolism of endosperm cell.

KeywordsCornus florida; Seed dormancy; Seed coat; Endosperm; Cell structure

大花四照花(Cornusflorida)為山苵萸科(Cornacease)山茱萸屬(Cornus)四照花亞屬落葉喬木，又名多花梾木，多花狗木。大花四照花原產(chǎn)于北美洲東部，喜濕潤(rùn)半陰的環(huán)境，早春開(kāi)花，傘形花序，野生種外面的4個(gè)苞片剛開(kāi)始開(kāi)放時(shí)為綠色，后逐漸變?yōu)榘咨?，為適應(yīng)觀賞的需要，又培育出苞片為粉紅色或大紅色的品種。其葉片光亮，入秋變紅，留存樹(shù)上達(dá)1月有余。秋天果實(shí)呈鮮紅色，因此，大花四照花是集觀花、觀葉、觀果于一體的園林綠化樹(shù)種[1-3]。

大花四照花種子具有深休眠習(xí)性。以往的研究表明，種皮吸水障礙是四照花類植物種子休眠主要原因之一[4-5]，低溫層積處理、濃硫酸酸蝕均利于該類種子休眠的解除[6-9]，如Liu et al.[10]在研究中發(fā)現(xiàn)，采用赤霉素浸泡后再低溫層積90 d或先用濃硫酸酸蝕10 min，再結(jié)合赤霉素浸種、低溫層積60 d的處理，能有效解除大花四照花種子休眠。種子休眠解除過(guò)程中種皮結(jié)構(gòu)和胚乳細(xì)胞內(nèi)含物均會(huì)發(fā)生一系列的變化[11-12]，但目前還沒(méi)有從細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化的角度對(duì)大花四照花種子休眠解除的機(jī)理進(jìn)行研究。本研究擬對(duì)大花四照花種子休眠解除過(guò)程中種皮和胚乳細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察與分析，從微觀的角度探討該種子休眠破除機(jī)制及濃硫酸對(duì)種子休眠解除的影響，為更好的解除其休眠提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

試驗(yàn)所用種子從美國(guó)田納西州進(jìn)口，購(gòu)回后保存于冰箱0～5 ℃。

種皮透水性測(cè)定：隨機(jī)數(shù)取30粒供試種子，3個(gè)重復(fù)，將其置于裝有清水的燒杯中浸種，每12 h取出種子，擦干表面水分，用千分之一天平稱質(zhì)量后重新浸入水中，重復(fù)之前的操作，直至種子吸水飽和，按下式計(jì)算種子的吸水率，繪制吸水曲線。

解除種子休眠：參考Liu et al.[10]的方法解除大花四照花種子的休眠，具體步驟為取供試種子先用500 mg·L-1的赤霉素溶液浸種72 h，再將V(種子)∶V(濕沙)=1∶3混合后低溫(0～5 ℃)層積，每30 d取出部分種子進(jìn)行電鏡觀察直至層積90 d；將種子放入濃硫酸中酸蝕10 min，浸泡過(guò)程中不斷攪拌種子，結(jié)束后用流水沖洗24 h，再在500 mg·L-1赤霉素溶液中浸種72 h，低溫層積60 d后取出進(jìn)行電鏡觀察。處理過(guò)程中赤霉素溶液每12 h需更換1次；以未經(jīng)任何處理的種子作為對(duì)照。

不同處理后種皮結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察：隨機(jī)數(shù)取上述各不同處理的種子，借助掃描電鏡(SEM)對(duì)種皮表面和縱切面進(jìn)行觀察，具體方法如下：

樣品用70% FAA固定液固定→乙醇系列脫水(30%-50%-70%-90%-100%)→臨點(diǎn)干燥儀(EMITECH K850)干燥→粘樣、離子濺射儀(Hitachi E-1010)噴金→置于FEI Quanta 200掃描電鏡下觀察并拍照。

不同處理后胚乳組織的透射電鏡觀察：隨機(jī)數(shù)取上述各不同處理的種子，去除種皮，取近胚根部胚乳，按朱莉偉等[13]的方法對(duì)胚乳細(xì)胞進(jìn)行透射電鏡(TEM)觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1種子透水性測(cè)定結(jié)果

大花四照花種子吸水緩慢，浸種12 h時(shí)吸水率為6.73%，浸種72 h時(shí)種子吸水基本飽和，但此時(shí)的吸水率也僅為12.17%。說(shuō)明該種子的種皮存在透水障礙，對(duì)種子萌發(fā)會(huì)產(chǎn)生一定的影響。

2.2種子表面及縱切面掃描電鏡觀察

由圖1可知，大花四照花的種皮較厚，骨質(zhì)，且高度木質(zhì)化(圖1a)，種皮的表面較為平整，局部有凹陷(圖1b)。由圖1c可知，大花四照花種皮主要由四部分組成，由外向內(nèi)依次為表皮層、柵欄層、薄壁細(xì)胞層、纖維細(xì)胞層。其中，表皮層細(xì)胞角質(zhì)化且凹凸不平，柵欄層則由一層長(zhǎng)柱狀且排列緊密的柵欄細(xì)胞組成，是水分進(jìn)入種子的主要屏障，同時(shí)增加了種皮的厚度和硬度[14]。薄壁細(xì)胞層與纖維細(xì)胞層之間沒(méi)有明顯的分界線。柵欄層細(xì)胞的長(zhǎng)軸多與種子表皮層垂直，而薄壁細(xì)胞長(zhǎng)軸則平行于表皮層。角質(zhì)化表皮層和柵欄層的存在以及柵欄細(xì)胞與薄壁細(xì)胞這種交錯(cuò)排列可能是造成大花四照花種皮透水性差的主要原因。

以往的研究表明，酸蝕和低溫層積處理均能對(duì)種皮結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響[15-16]。大花四照花種子經(jīng)低溫層積30 d后，種皮表面出現(xiàn)破損(圖1d)，種皮內(nèi)部結(jié)構(gòu)并沒(méi)有明顯變化(圖1e)。低溫層積60 d后，種子表面破損加劇并出現(xiàn)明顯裂縫(圖1f，圖1g)，且裂縫直達(dá)柵欄層，此時(shí)柵欄層細(xì)胞排列相對(duì)疏松，纖維細(xì)胞出現(xiàn)破裂(圖1h)。低溫層積90 d后，種皮柵欄層出現(xiàn)裂縫直達(dá)薄壁細(xì)胞層(圖1i)，薄壁細(xì)胞中包含有晶體物質(zhì)(圖1j)。濃硫酸酸蝕10 min并經(jīng)赤霉素浸泡后再低溫層積60 d的種子，種皮表面也出現(xiàn)明顯破損(圖1k)，表皮層被完全腐蝕，柵欄層也遭到一定程度的破壞，柵欄細(xì)胞排列相對(duì)疏松(圖1l)，而濃硫酸對(duì)柵欄層一定程度的破壞可能是這一處理能促進(jìn)大花四照花種子萌發(fā)的主要原因。

2.3不同處理后大花四照花種子胚乳細(xì)胞內(nèi)含物觀察

不同處理后大花四照花種子胚乳細(xì)胞內(nèi)含物變化如圖2所示。未處理的大花四照花種子胚乳細(xì)胞內(nèi)脂滴含量較多，充盈著整個(gè)細(xì)胞，脂滴之間存在較大塊狀的高電子致密物質(zhì)，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)，核仁明顯，細(xì)胞間存在明顯的胞間連絲，為細(xì)胞間的物質(zhì)運(yùn)輸和信息傳遞提供了保障(圖2a、圖2b)。種子經(jīng)低溫層積30 d后，高電子致密物質(zhì)基本降解，脂滴呈塊狀或顆粒狀，細(xì)胞核清晰可見(jiàn)(圖2c)，此時(shí)細(xì)胞中已有少量線粒體存在(圖2d)。低溫層積60 d后，胚乳細(xì)胞中脂類物質(zhì)繼續(xù)降解消融形成較大塊狀，并且由于脂滴的不斷降解，形成了很多明顯的空洞，細(xì)胞壁扭曲(圖2e)，細(xì)胞中線粒體數(shù)量明顯增多(圖2f)。種子低溫層積90 d時(shí)，胚乳細(xì)胞中儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)基本降解，胞間連絲、細(xì)胞核依然清晰可見(jiàn)(圖2g)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、線粒體等細(xì)胞器增多，結(jié)構(gòu)更加完整(圖2h)，表明此時(shí)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)代謝活動(dòng)加強(qiáng)，種子休眠基本解除，這與Liu et al.[10]的發(fā)芽試驗(yàn)結(jié)果相一致。濃硫酸酸蝕10 min，再在500 mg·L-1赤霉素中浸種72 h后再低溫層積60 d的種子，部分胚乳細(xì)胞中脂滴已降解融合成較大塊狀，部分細(xì)胞中脂滴已完全降解(圖2i)，其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解程度明顯大于直接赤霉素浸泡后低溫層積60 d的種子。胚乳細(xì)胞中細(xì)胞核、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等清晰可見(jiàn)(圖2j)。

Ep.表皮層；Pl.柵欄層；P.薄壁細(xì)胞層；F.纖維細(xì)胞層；Cr.晶體物質(zhì)；a.對(duì)照組種子縱剖結(jié)構(gòu)(bar=4 mm)；b.對(duì)照組種皮表面(bar=100 μm)；c.對(duì)照組種子縱剖結(jié)構(gòu)(bar=500 μm)；d.赤霉素浸種72 h后低溫層積30 d種子表面(bar=100 μm)；e.赤霉素浸種72 h后低溫層積30 d種子縱剖面(bar=500 μm)；f、g.赤霉素浸種72 h后低溫層積60 d種子表面(bar=4 mm、bar=100 μm)；h.赤霉素浸種72 h后低溫層積60 d種子縱剖面(bar=500 μm)；i、j.赤霉素浸種72 h后低溫層積90 d種子縱剖面(bar=400 μm、bar=100 μm)；k.濃硫酸酸蝕10 min，赤霉素浸種72 h后低溫層積60 d種子表面(bar=100 μm)；l.濃硫酸酸蝕10 min，赤霉素浸種72 h后低溫層積60 d種子縱剖面(bar=500 μm)。

圖1不同處理后四照花種子種皮表面及縱切面結(jié)構(gòu)

3結(jié)論與討論

種子萌發(fā)必須經(jīng)過(guò)水分吸收、酶活化以及胚生長(zhǎng)三個(gè)階段，其中一個(gè)或幾個(gè)階段受到影響便可能引起種子休眠[17]，而種皮結(jié)構(gòu)會(huì)影響種子對(duì)水分的吸收，進(jìn)而影響種子的正常萌發(fā)[18]。物理性休眠便是由于種皮對(duì)水分和氧氣的不透性造成的，而種皮的不透性主要是因?yàn)榉N皮的柵欄狀厚壁細(xì)胞和角質(zhì)層的存在[19-20]。本次種子吸水測(cè)定結(jié)果顯示，大花四照花種皮存在透水性障礙。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，該種子的種皮堅(jiān)硬厚實(shí)，存在較厚的角質(zhì)化表皮層和致密的柵欄層，這增加了種皮的厚度和硬度，同時(shí)也阻礙了種子對(duì)外界水分的吸收。因此，種皮效應(yīng)是引起大花四照花種子休眠的原因之一。

N.細(xì)胞核；P.胞間連絲；BG.高電子致密物質(zhì)；L.脂滴；CW.細(xì)胞壁；M.線粒體；Er.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；G.高爾基體；a、b.對(duì)照組種子胚乳細(xì)胞透射電鏡(bar=50 μm、bar=10 μm)；c、d.赤霉素浸種72 h后低溫層積30 d種子胚乳細(xì)胞透射電鏡(bar=100 μm、bar=10 μm)；e、f.赤霉素浸種72 h后低溫層積60 d種子胚乳細(xì)胞透射電鏡(bar=100 μm、bar=10 μm)；g、h.赤霉素浸種72 h后低溫層積90 d種子胚乳細(xì)胞透射電鏡(bar=50 μm、bar=10 μm)；i、j.濃硫酸酸蝕10 min再經(jīng)赤霉素浸泡72 h后低溫層積60 d種子胚乳細(xì)胞透射電鏡(bar=100 μm、bar=50 μm)。

圖2不同處理后大花四照花種子胚乳細(xì)胞內(nèi)含物觀察

種子休眠解除是一個(gè)復(fù)雜的形態(tài)和生理變化過(guò)程，在這一過(guò)程中，種皮結(jié)構(gòu)和胚乳細(xì)胞內(nèi)含物均會(huì)發(fā)生顯著變化，而這種變化可能直接影響到種子休眠的解除[21]。本研究結(jié)果顯示，隨著低溫層積時(shí)間的延長(zhǎng)，大花四照花種子種皮表皮層逐漸破損并出現(xiàn)明顯裂縫，柵欄層細(xì)胞排列也越來(lái)越疏松，種子休眠解除后，種皮裂縫繼續(xù)加大并直達(dá)種皮內(nèi)部薄壁細(xì)胞層，說(shuō)明低溫層積能有效解除大花四照花種皮的機(jī)械障礙，促進(jìn)種子的萌發(fā)。以往研究表明，濃硫酸處理能增加種皮透性，利于種子萌發(fā)[22-23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，大花四照花種子先用濃硫酸酸蝕10 min，再采用赤霉素浸種并結(jié)合低溫層積60 d的處理，其種皮表皮層已被完全腐蝕，柵欄層也遭到一定程度的破壞，細(xì)胞排列也較為疏松，與低溫層積60 d的種子相比較可知，濃硫酸能明顯促進(jìn)該種子種皮結(jié)構(gòu)的變化，加快其種皮障礙的解除，進(jìn)而促進(jìn)種子萌發(fā)。

胚乳是一種營(yíng)養(yǎng)組織，其細(xì)胞中積累了大量的碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[24]。在種子休眠解除過(guò)程中，為提供種子萌發(fā)所必須的養(yǎng)分，種子體內(nèi)貯存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如淀粉會(huì)逐漸水解減少，脂類物質(zhì)也會(huì)消融降解[25]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，未處理的大花四照花種子胚乳細(xì)胞中含有較多脂滴和高電子致密物質(zhì)，在低溫層積過(guò)程中，高電子致密物質(zhì)逐漸降解消失，脂滴也逐漸降解消融，各細(xì)胞器則逐漸出現(xiàn)，表明胚乳細(xì)胞中物質(zhì)代謝活動(dòng)加強(qiáng)，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)不斷分解，為種子萌發(fā)提供必需的養(yǎng)分。同時(shí)，經(jīng)濃硫酸酸蝕并低溫層積60 d的種子，胚乳細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解程度明顯大于直接低溫層積60 d的種子，表明濃硫酸酸蝕10 min能加快大花四照花種子休眠的解除。

種子休眠是植物為適應(yīng)周邊復(fù)雜的環(huán)境條件而形成的一種生理生態(tài)特征，種子休眠的解除也會(huì)伴隨著一系列復(fù)雜的生理生化變化，如植物激素含量、酶活性、含水量等。本次僅從種皮結(jié)構(gòu)和胚乳細(xì)胞內(nèi)含物的變化這一角度對(duì)大花四照花種子休眠解除過(guò)程進(jìn)行了研究，旨在了解其種子萌發(fā)進(jìn)程，為今后該種子休眠機(jī)理的研究以及更好的解除其休眠提供一定的理論依據(jù)。

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收稿日期：2015年9月22日。

第一作者簡(jiǎn)介：周健，1990年12月生，南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，碩士研究生。E-mail：z_jian646896@163.com。通信作者：李淑嫻，南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，教授。E-mail:shuxianli@njfu.com.cn。

1)國(guó)家自然科學(xué)基金(31270711)、江蘇省青藍(lán)工程創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)、江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目(PAPD)。

責(zé)任編輯：任俐。