比較佐太、朱砂與汞化合物對胎、幼、孕和老年鼠的腎臟毒性

李文楷,侯瑋鈺,吳　青,羅　婭,岑語燕,陸遠富,劉　杰,魏立新

(1.遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室,貴州 遵義　563099;2.遵義醫(yī)學院 藥學院, 貴州 遵義　563099;3.遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院,貴州 遵義　563099;4.中國科學院西北高原生物研究所 藏藥研究重點實驗室, 青海 西寧　810001)

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基礎(chǔ)醫(yī)學研究

比較佐太、朱砂與汞化合物對胎、幼、孕和老年鼠的腎臟毒性

李文楷1,侯瑋鈺1,吳青2,羅婭3,岑語燕3,陸遠富1,劉杰1,魏立新4

(1.遵義醫(yī)學院 基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點實驗室,貴州 遵義563099;2.遵義醫(yī)學院 藥學院, 貴州 遵義563099;3.遵義醫(yī)學院 公共衛(wèi)生學院,貴州 遵義563099;4.中國科學院西北高原生物研究所 藏藥研究重點實驗室, 青海 西寧810001)

[摘要]目的 比較佐太、朱砂和汞化合物對胎、幼、孕和老年鼠的腎毒性。方法 采用孕19 d的胎鼠、母孕鼠、剛斷奶的幼鼠和15月的老年鼠(均為SD大鼠), 口服給于藏藥佐太(30 mg/kg)、朱砂(HgS, 30 mg/kg), 以及等汞量的氯化汞(HgCl2, 33.6 mg/kg)和1/10等汞量的甲基汞(MeHg, 3.1 mg/kg), 連續(xù)7 d, 觀察動物的體重和一般情況, 末次給藥24 h后取腎臟, 觀察腎病理改變、腎汞蓄積和腎臟中腎損傷因子Kim-1 mRNA的表達。結(jié)果 連續(xù)給予佐太和朱砂7 d后, 大鼠未見明顯異常, 而氯化汞組體重明顯下降(P<0.05)。氯化汞引起明顯腎汞蓄積, 甲基汞組大鼠也有所升高。而佐太組和朱砂組僅輕微增加。母孕鼠和老年鼠氯化汞組的腎損傷尤為明顯, 甲基汞組也出現(xiàn)腎損傷, 而佐太和朱砂未見明顯腎病理改變。腎臟毒性敏感基因Kim-1的表達表明, 氯化汞組Kim-1的表達顯著升高(P<0.05),只有HgS 1/10等汞量的甲基汞也有所升高, 而佐太和朱砂與對照組無明顯差異。胎鼠對汞毒性不敏感, 幼鼠輕度敏感, 母孕鼠中度敏感, 而老年鼠顯著敏感。結(jié)論 在等汞量的基礎(chǔ)上, 藏藥佐太和朱砂的腎毒性遠小于氯化汞和1/10等汞量的甲基汞; 汞化合物的毒性隨鼠年齡而異, 胎鼠和幼鼠不敏感, 成年孕鼠尤其老年鼠易受汞所致的腎毒性。

[關(guān)鍵詞]藏藥佐太 ; HgS; HgCl2; MeHg; 腎毒性; 腎汞; 腎損傷因子1(Kim-1)

藏藥佐太即“佐塔”, 也叫“甘露精王”, 具有一定的鎮(zhèn)定安神、促進睡眠、抗驚厥、解熱、抗炎、增強免疫、延長雌性果蠅壽命、抑菌等藥理活性[1-2]。在炮制過程中, 水銀必須經(jīng)過與植物藥和動物藥煎煮, 煅燒, 炮制成灰入藥, 以保留藥效, 去除毒副作用[2]。現(xiàn)代化學分析表明, 佐太的主要成份為β-HgS[3]。而朱砂的主要成份為α-HgS[4]。2015年版的中國藥典第一部收集了上百種含佐太和朱砂的藏藥和中成藥方劑[5]。汞(Hg)是已知的重金屬, 而腎臟是其主要的毒性靶器官。但在討論汞化合物毒性時, 因不同汞化合物在體內(nèi)的代謝和其毒性靶器官相差懸殊[6], 所以必須考慮到其化學結(jié)構(gòu)和價態(tài)。我們近年的工作表明朱砂和含朱砂的安宮牛黃丸與常見的氯化汞(HgCl2)和甲基汞(MeHg)對腎臟的毒性相差很大[7]。長期用佐太也可引起可逆的腎臟應(yīng)激反應(yīng)[8]。雖然實驗研究以及臨床應(yīng)用表明, 服用佐太和含佐太的藏藥當佐未發(fā)現(xiàn)明顯的毒副作用[9], 但不同年齡人群對佐太和汞化合物的毒性是否有不同程度的敏感？佐太是否可以通過胎盤屏障影響到胎兒？這些都有待于進一步深入研究。目前研究最多、毒性最大的汞化合物是甲基汞, 可引起肝臟和腎臟損傷, 最嚴重的毒性是對中樞神經(jīng)系統(tǒng)的破壞, 而氯化汞主要損傷腎臟。比較佐太和朱砂與甲基汞和氯化汞的腎臟毒性的差異, 以及汞化合物對不同年齡動物的敏感性, 是對含汞中藥安全性評價的一個重要方面[6]。本試驗采用佐太、朱砂、等汞含量的氯化汞和1/10等汞含量的甲基汞對胎鼠、孕鼠、剛斷奶的幼鼠和老年鼠進行處理, 研究了不同汞形態(tài)對不同生育期大鼠腎臟毒性的差異。

1材料與方法

1.1儀器和試劑F732-VJ冷原子吸收測汞儀購自上海華光儀器儀表廠，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司，實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司，TU-1810紫外-可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責任公司，Eppendorf5417R臺式高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，BX43光學顯微鏡購自日本Olympus公司。

佐太(主要含β-HgS)由中國科學院西北高原生物研究所藏藥研究重點實驗室提供；朱砂(>96%，α-HgS),α-HgS、HgCl2和MeHg均購自美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為分析純。

1.2實驗動物健康成年SPF級Sprague-Dawley(SD)大鼠購自第三軍醫(yī)大學大坪實驗動物中心[合格證號: SCXK(渝)2012-0005], 飼養(yǎng)于遵義醫(yī)學院基礎(chǔ)藥理省部共建重點實驗室SPF動物房(合格證號#SYXK2014-003)。讓實驗大鼠自由攝食飲水, 攝食, 以使其適應(yīng)環(huán)境。雄雌交配后以見陰栓定為孕1 d, 將受孕雌鼠隨機分組, 每組3只。于孕11 d給藥7 d后的第2天(孕18 d)取胎鼠和母孕鼠腎臟。斷奶(21 d)幼鼠每組6只, 給藥7 d, 于第28天取腎臟。雄性老齡大鼠(15月)每組5只給藥7 d后取腎臟, 去除周邊結(jié)締組織, 稱重, 切取適當大小腎組織用于病理觀察, 另夾取約50 mg腎組織用于腎汞蓄積測定和腎損傷相關(guān)基因表達的研究。給藥期間觀察各大鼠的一般外觀形態(tài)、行為活動、進食飲水情況, 并進行每日稱重。

1.3試驗設(shè)計動物按體重每日口服給藥。藏藥佐太按臨床4倍用量(30 mg/kg), 朱砂(HgS)也按30 mg/kg給藥, 含等汞量的氯化汞為33.6 mg/kg和 1/10 等汞量的甲基汞(3.1 mg/kg)作為比較對照。各組動物均給藥7 d, 末次給藥24 h后取腎臟進行分析。

1.4腎臟病理觀察取腎組織以常規(guī)10%甲醛固定, 經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片、蘇木素-伊紅(HE) 染色, 光學顯微鏡下觀察其組織形態(tài)變化。

1.5腎汞蓄積量測定取50～100 mg腎組織, 用1 mL濃硝酸60 ℃消化48 h, 稀釋25倍, 使用F732-VJ冷原子吸收測汞儀檢測腎汞蓄積量。

1.6腎損傷基因Kim-1表達的測定按常規(guī)法用Trizol提取總RNA, NanoDrop檢測RNA濃度和純度。用High Capacity RT合成cDNA, 用IQTM SYBR Green Supermix (Bio-Rad)進行PCR擴增。用Primer3來設(shè)計探針,以β-actin做內(nèi)參基因。用2△△Ct值法計算其擴增效率, 比較不同組之間的基因表達差異?；蛞镉纱筮B寶生物工程有限公司設(shè)計并合成,β-actin同義鏈5′- TGACCGACGTGGCTACAG-3′, 反義鏈 5′-GGGCAACATAGCACAGCTTCT-3′;Kim-1 同義鏈 5'- TGGCACTGTGACATCCTCAGA-3′, 反義鏈 5′- GCAACGGACATGCCAACATA-3′。

2結(jié)果

2.1大鼠體重和腎重以幼鼠為例, 藏藥佐太和朱砂連續(xù)給藥7 d后, 對幼年鼠增重無明顯影響。而氯化汞組對幼年鼠增重遲緩, 甲基汞組的體重增加也有所下降(見圖1)。氯化汞影響下老年鼠體重下降可達40 g, 而佐太和朱砂組僅稍微降低, 與對照組比則無明顯差異。各給藥組胎鼠和孕母鼠體重無明顯差異。

2.2腎臟汞蓄積量在分別灌藏藥佐太和汞化合物后, 將幼鼠和老年鼠的腎臟移除, 用冷原子吸收法進行測定。氯化汞組汞含量達250 μg/g(腎), 甲基汞達30 μg/g(腎), 而佐太和朱砂僅有2 μg/g(腎)左右, 差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表1)。

佐太、HgS、HgCl2和MeHg的濃度分別為30.0、30.0、33.6和3.1 mg/kg。*: 與對照組相比,?！　D1　連續(xù)7 d口服佐太、HgS 、HgCl2和MeHg對幼鼠體重增長的影響

表1幼鼠和老年鼠的腎汞含量(μg/g)

組別幼鼠老年鼠對照0.67±0.050.89±0.05佐太1.26±0.19*1.53±0.09*HgS1.38±0.43*2.11±0.31*HgCl2248.00±21.00*283.00±33.90*MeHg26.60±2.50*34.40±1.80*

2.3腎臟病理結(jié)果佐太組和朱砂組老年鼠的腎臟中與對照組相比沒有明顯差異, 但相比之下, 在給予氯化汞和甲基汞的老年鼠腎臟中有明顯的腎小管上皮細胞的變性和壞死(見圖2)。

A: 對照; B: 佐太(30.0 mg/kg); C: 朱砂(30.0 mg/kg); D: HgCl2(33.6 mg/kg); E: MeHg(3.1 mg/kg)。圖2　佐太、HgS、HgCl2和MeHg對老年鼠腎臟病理的影響(HE，×200)

2.4腎臟中Kim-1 mRNA 的表達水平Kim-1是腎臟損傷的敏感生物標志分子, 與空白對照組相比, 佐太和HgS對其表達無明顯影響, 氯化汞顯著增加其表達, 以對老年鼠更為明顯(17倍), 其次為幼鼠(3.5倍), 孕母鼠(2.5倍), 而胎鼠對汞腎毒性不敏感。甲基汞可增加Kim-1在幼鼠的表達2.2倍,孕母鼠1.5倍, 但對老年鼠僅為1.3倍(見圖3)。

A：胎鼠；B：孕鼠；C：幼年大鼠；D：老年大鼠。與對照組相比, P<0.05。佐太、HgS、HgCl2和MeHg的濃度分別為30.0、30.0、33.6和3.1 mg/kg。圖3　佐太、HgS、HgCl2和MeHg對胎鼠、孕母鼠、幼鼠和老年鼠腎臟損傷分子Kim-1表達的影響

3討論

本實驗表明在等汞量的基礎(chǔ)上, 藏藥佐太和硫化汞的腎毒性遠小于氯化汞和1/10等汞量的甲基汞; 汞化合物的毒性隨鼠年齡而異, 胎鼠和幼鼠不敏感, 而成年孕鼠和老年鼠易受汞所致的腎毒所害。

近年來, 隨著國內(nèi)外對重金屬安全性問題的日益重視, 含汞成分制劑的臨床應(yīng)用受到極大限制。藏藥佐太在藏藥中最為貴重, 是藏藥之母本, 被雪域人民視為藏藥中的至寶, 被稱為“眾藥之王”[1-2]。而朱砂則為“安神鎮(zhèn)靜”中藥[4]。然而, 佐太和朱砂均為硫化汞, 汞為重金屬, 故其安全性問題尤為突出。腎臟是無機汞和有機汞的主要毒性靶器官[6]。我們近年的工作表明朱砂和含朱砂的安宮牛黃丸, 萬勝化風丹與氯化汞的腎毒性不能相提并論[7,10]。所以本實驗采用給予等汞量的藏藥佐太、朱砂、氯化汞和1/10等汞量的甲基汞連續(xù)給藥7 d進行腎毒性比較。結(jié)果顯示氯化汞的腎汞蓄積高達250 μg/g, 相伴最強的腎毒性。而甲基汞的腎汞蓄積也達30 μg/g, 其腎毒性也明顯。與之相比, 佐太和朱砂的腎汞蓄積只有2 μg/g, 故腎毒性低。因此不同汞化合物的胃腸道吸收不同, 分布并蓄積到腎臟的汞差異極大, 毒性相差懸殊,故不能把硫化汞與氯化汞、甲基汞相提并論。

腎損傷因子1(Kim-1)是一類I型跨膜蛋白, 屬于免疫球蛋白基因超家族。在受損后再生的近曲小管上皮細胞中表達顯著增強, 能迅速、靈敏、特異地反映各種腎臟疾病的損傷, 是檢測早期腎損傷的可靠生物學標記物[8,10-11]。本實驗結(jié)果顯示, 除胎鼠外各個年齡段氯化汞和甲基汞組腎臟Kim-1的表達均有不同程度增加, 尤其以氯化汞的作用最為明顯, 與文獻報道相符合[10-11]。這在分子生物學的基礎(chǔ)上, 進一步驗證了不同汞化合物對腎毒性的差異。

年齡是影響機體對汞毒性的一個重要因素。近期文獻報道表明, 老年鼠比年青鼠對氯化汞毒性更為敏感[11]。我們最近的實驗表明腎臟攝入轉(zhuǎn)運體的表達隨年齡而增加。腎臟攝入轉(zhuǎn)運體的表達增加與腎汞攝入和蓄積增加密切相關(guān), 這可能是老年大鼠對氯化汞敏感的原因之一。有趣的是老年大鼠主要對氯化汞敏感, 而對1/10等汞量的甲基汞敏感度次之。特別要引起注意的是, 胎鼠的Kim-1表達在各組中無差異, 其可能與胎盤屏障對胚胎發(fā)育的保護作用有關(guān)。給孕母鼠注射甲基汞[12]或氯化汞[13], 其胎盤和胎鼠均有不同程度的汞蓄積, 但其腎汞蓄積量僅為孕母鼠腎汞的1%, 這也是胎鼠對汞化合物毒性敏感性較低的一個主要原因。

藏藥佐太在本實驗中是按臨床4倍量(30 mg/kg)給藥[8], 在此實驗條件下連續(xù)給藥7 d, 未見明顯腎毒性。但是如連續(xù)給藥(17、33、67 mg/kg)180 d, 高劑量下能引起腎臟Kim-1有一定升高, 但停藥30 d后能恢復到正常表達水平[8]。朱砂在本實驗條件下(30 mg/kg, 給藥7 d)也未見明顯腎損傷。但是如給于朱砂50 mg/kg以上連續(xù)90 d, 或給以朱砂100 mg/kg, 連續(xù)30 d, 會出現(xiàn)輕度腎臟損傷[14]。但朱砂以1 g/kg的劑量連續(xù)給予大鼠8周, 腎毒性和Kim-1表達升高均會出現(xiàn)[15]。因此, 佐太和朱砂要小心使用, 千萬不要過量和長期服用。

綜上所述, 藏藥佐太和朱砂在臨床劑量范圍產(chǎn)生的腎毒性遠小于等汞量的氯化汞和1/10等汞量的甲基汞; 汞化合物的毒性隨鼠年齡而異, 胎鼠不敏感, 幼鼠輕度敏感, 孕母鼠敏感, 而老年鼠極易受汞所致的腎毒性。

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[收稿2016-03-16;修回2016-04-05]

(編輯：王靜)

Comparative study of Zuotai and Zhusha with HgCl2and MeHg on kidney injury in fetal, dam, weanling and aged rats

LiWenkai1,HouWeiyu1,WuQing2,LuoYa3,CenYuyan3,LuYuanfu1,LiuJie1,WeiLixin4

(1. Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 2. School of Pharmacy，Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. School of Public Health, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 4. Key Lab of Tibetan Medicine Research, Institute of Plateau Biology of Chinese Academy of Sciences, Xining Qinghai 810001, China)

[Abstract]Objective To compare the renal toxicity of the Tibetan medicine Zuotai and Chinese medicine Zhusha (HgS) with mercury chloride (HgCl2) and methylmercury(MeHg) in various ages from fetal (-2 d before born), weanling (21 d-old), dam (3 mo-old), and aged (15 mo-old) rats.Methods Rats were orally administered with Zuotai (30 mg/kg), Zhusha (HgS, 30 mg/kg), HgCl2 (33.6 mg/kg, equal Hg content of HgS), and MeHg (3.1 mg/kg, 1/10 Hg content of HgS) for 7 days.The body weight and the general health were observed. At the termination of the experiments, kidney pathology, renal Hg accumulation, and the expression of kidney injury molecule-1 (Kim-1) were examined.Results Repeated administration of Zuotai and Zhusha did not show abnormalities in all age groups, while HgCl2retarded body weight in weanling rats and decreased body weight in aged rats and MeHg slightly decreased rat body weight.Significant Hg accumulation was observed after HgCl2 treatment, and to a lesser extent after MeHg treatment, but renal Hg content was only slightly increased in Zuotai and Zhusha groups.Histologically, HgCl2 produced obviously renal injury and MeHg produced mild renal injury, while no apparent pathology was evident after Zuotai and Zhusha treatment.The expression of Kim-1 was dramatically increased after HgCl2treatment, followed by MeHg, especially in the aged rats and dam rats.In weanling rats and fetal rats, the expression of Kim-1 was not significantly affected.Conclusion Zuotai and Zhusha are much less nephrotoxic than HgCl2 and MeHg.Fetal rats and weanling rats are less sensitive to Hg toxicity, and the aged rats are sensitive to mercury toxicity.

[Key words]Zuotai; HgS; HgCl2; methyl mercury; nephrotoxicity; renal Hg; Kim-1

[中圖法分類號]R595.2; R961.1

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2016)02-0129-05

[通信作者]劉杰, 男, 教授, 碩士生導師, 研究方向: 中藥毒理,E-mail:Jielius@zmc.edu.cn。

[基金項目]國家“十二五”科技支撐計劃資助項目(NO: 2012BAI27B05); 國家自然科學基金資助項目(NO: 81460632); 貴州省研究生教育創(chuàng)新基地項目(NO: 黔教科2008-02)。