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    HPLC法測(cè)定復(fù)方石斛顆粒中黃酮類化學(xué)成分的含量

    2016-05-31 08:06:24徐小婷徐應(yīng)淑
    關(guān)鍵詞:槲皮素

    徐小婷,徐應(yīng)淑,楊 俊

    (遵義醫(yī)學(xué)院 藥劑學(xué)教研室,貴州 遵義 563099)

    ?

    技術(shù)與方法

    HPLC法測(cè)定復(fù)方石斛顆粒中黃酮類化學(xué)成分的含量

    徐小婷,徐應(yīng)淑,楊俊

    (遵義醫(yī)學(xué)院 藥劑學(xué)教研室,貴州 遵義563099)

    [摘要]目的 建立高效液相色譜法測(cè)定復(fù)方石斛顆粒中槲皮素、山奈素和異鼠李素含量的方法。方法 高效液相色譜法測(cè)定黃酮類化學(xué)成分槲皮素、山奈素和異鼠李素含量,色譜柱為Agilent ZORBAX Extend-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm),流動(dòng)相為甲醇-0.4%磷酸水溶液,采用梯度洗脫,流速1.0 mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm,柱溫為40 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果 槲皮素、山奈素和異鼠李素的進(jìn)樣量分別在5~80、5~80、1.875~30 μg/mL,該范圍內(nèi)與各自峰面積呈良好的線性關(guān)系,線性回歸方程分別為y=41.592x+34.684(R2=0.999 9)、y=40.24x+36.804(R2=0.999 9)和y=84.668x-44.102(R2=0.999 8);平均回收率分別為99.69%、100.26%和99.63%,RSD分別為1.59%、1.74%和2.08%(n=6)。結(jié)論 該方法分離良好、精密準(zhǔn)確,可用于復(fù)方石斛顆粒的質(zhì)量控制。

    [關(guān)鍵詞]復(fù)方石斛顆粒;槲皮素;山奈素;異鼠李素;HPLC

    復(fù)方石斛顆粒是由銀杏葉、山楂和金釵石斛等組成的復(fù)方制劑,研究表明其具有效調(diào)節(jié)大鼠血脂代謝水平,且能提高機(jī)體的抗氧化能力和改善肝組織脂肪變性,有補(bǔ)肝益腎、活血化瘀、化濁降脂的功效,適用于高脂血癥、高粘血癥和脂肪肝等病癥[1],對(duì)血脂代謝紊亂具有輔助治療作用。由于中藥制劑的藥材來源和提取方式不同等諸多方面的影響,都會(huì)對(duì)其效應(yīng)和產(chǎn)品質(zhì)量產(chǎn)生一定的影響[2],因而為復(fù)方石斛顆粒建立質(zhì)量控制方法及將來的工業(yè)化大生產(chǎn)具有現(xiàn)實(shí)意義。已有文獻(xiàn)[3-7]采用高效液相色譜法測(cè)定槲皮素、山奈素和異鼠李素的含量,但從環(huán)境保護(hù)、檢測(cè)效率提高的角度考慮,尚有必要進(jìn)一步優(yōu)化色譜條件。本文建立了HPLC法檢測(cè)復(fù)方制劑中黃酮類化學(xué)成分槲皮素、山奈素和異鼠李素含量的方法,為復(fù)方石斛顆粒的質(zhì)量控制提供安全、可靠的試驗(yàn)依據(jù)。

    1材料與方法

    1.1儀器與試劑Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司);電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司);HH-S6型恒溫水浴箱(鄭州長(zhǎng)城科工有限公司);SZ-93自動(dòng)雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);DL-820D型智能超聲波清洗器(上海之信儀器有限公司)。 復(fù)方石斛顆粒(遵義醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院自制,編號(hào):20150717、20150718、20150719);槲皮素對(duì)照品(150302,純度:99.73%)、山奈素對(duì)照品(140608,純度:99.24%)、異鼠李素對(duì)照品(141119,純度:98.57%)均購(gòu)自成都普菲德生物技術(shù)有限公司;甲醇、乙腈(色譜純)購(gòu)自美國(guó)TEDIA天地試劑有限公司;水為雙蒸水;其余試劑為分析純。

    1.2色譜條件與溶液配制

    1.2.1色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相A為甲醇,B為0.4%磷酸溶液;梯度洗脫,洗脫條件為0~12 min,20%~40% A;12~20 min,40%~43% A;20~27 min,43%~47% A;27~30 min,47%~65% A;流速1.0 mL/min,柱溫40 ℃,進(jìn)樣量10 μL,檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm。

    1.2.2對(duì)照品溶液配制取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h的槲皮素、山奈素和異鼠李素對(duì)照品制成含槲皮素80 μg/mL、山奈素80 μg/mL、異鼠李素30 μg/mL對(duì)照品混合溶液。

    1.2.3樣品溶液制備精密稱取復(fù)方顆粒粉末5.0 g,置索氏提取裝置中,加石油醚(60~90 ℃)100 mL加熱回流提取至提取液無色(約3 h),取出藥渣揮干,置具塞錐形瓶中;向瓶中加入甲醇100 mL,稱重,超聲處理(功率250 W,頻率45 kHz ) 40 min,放冷,再稱定重量,用甲醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過;精密量取續(xù)濾液24 mL,并加25%鹽酸溶液8 mL,稱重,搖勻,置85 ℃水浴中加熱回流90 min,迅速冷卻至室溫,再稱定重量,用溶液(甲醇∶25%鹽酸=3∶1)補(bǔ)足減失的重量,用微孔濾膜(0.45 μm)濾過,取續(xù)濾液,作為樣品溶液。

    1.2.4空白溶液另取按處方工藝配置的空白輔料適量,按同法配成空白溶液。

    2結(jié)果

    2.1方法學(xué)考察

    2.1.1專屬性考察取空白溶液、對(duì)照品溶液和樣品溶液,按己建立的色譜條件,取10 μL進(jìn)行HPLC分析,分別得色譜圖(見圖1)。槲皮素、山奈素和異鼠李素的保留時(shí)間分別為19.10、26.29和28.51 min。結(jié)果顯示,槲皮素、山奈素、異鼠李素的峰位置無雜質(zhì)峰出現(xiàn),輔料不干擾檢測(cè)樣本的測(cè)定,峰型良好。結(jié)果表明,本方法具有較高的專屬性。

    A:空白溶液;B:對(duì)照品溶液;C:樣品溶液。1:槲皮素;2:山奈素;3:異鼠李素。圖1 3種溶液的高效液相色譜圖

    2.1.2線性關(guān)系考察精密量取槲皮素(80 μg/mL)、山奈素(80 μg /mL)、異鼠李素(30 μg /mL)對(duì)照品混合溶液0.625、1.25、2.5、5.0、7.5 mL分別置于10 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,搖勻,進(jìn)樣。按上述色譜條件測(cè)定,記錄峰面積,以各對(duì)照品濃度(x)為橫坐標(biāo)坐標(biāo),峰面積(y)為縱坐標(biāo),得到槲皮素回歸方程為y=41.592x+34.684,R2=0.999 9;山奈素回歸方程為y=40.24x+36.804,R2=0.999 9;異鼠李素回歸方程為y=84.668x-44.102,R2=0.999 8,分別在5~80、5~80、1.875~30 μg/mL范圍內(nèi),峰面積與濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

    2.1.3精密度試驗(yàn)精密量取“1.2.2”項(xiàng)下槲皮素(40 μg /mL)、山奈素(40 μg /mL)、異鼠李素(15 μg /mL)的混合溶液10 μL,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。測(cè)得槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.41%、0.62%、0.45%,表明該儀器精密度較好。

    2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)取樣品溶液分別在配制0、2、4、6、12、24 h時(shí)進(jìn)樣,記錄峰面積,測(cè)得槲皮素、山奈素和異鼠李素峰面積的RSD分別為0.41%、0.62%、0.45%,表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

    2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)取同一批號(hào)(編號(hào):20150717)樣品,平行測(cè)定6份。測(cè)得槲皮素、山奈素和異鼠李素的峰面積RSD分別為1.82%、2.39%、2.97%(n=6),表明該方法重現(xiàn)性較好。

    2.1.6回收率試驗(yàn)精密稱取已測(cè)知含量的樣品6份,每份約2.5 g,分別精密加入一定量的槲皮素、山奈素、異鼠李素對(duì)照品溶液,按“1.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,再按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,記錄峰面積,并計(jì)算得加樣回收率及其RSD值(見表1)。

    表1復(fù)方石斛顆粒加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

    待測(cè)成分稱樣量(g)樣品含量(mg)加入量(mg)測(cè)得量(mg)加樣回收率(%)平均回收率(%)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD,%)槲皮素2.50071.04161.00002.0557101.4199.691.592.50151.04191.00002.017297.532.50091.04171.00002.033399.162.50141.04191.00002.0589101.702.50091.04171.00002.036599.482.50021.04141.00002.030098.86山奈素2.50071.49611.50003.0300102.26100.261.742.50151.49661.50002.957397.382.50091.49631.50003.0200101.582.50141.49661.50002.987099.362.50091.49631.50003.0002100.262.50021.49581.50003.0069100.74異鼠李素2.50070.31240.30000.6131100.2399.632.082.50150.31240.30000.6210102.872.50090.31240.30000.603797.102.50140.31240.30000.606898.132.50090.31240.30000.6147100.772.50020.31240.30000.608498.67

    2.2樣品含量測(cè)定取3個(gè)批號(hào)的復(fù)方石斛顆粒,研細(xì),分別精密稱定5 g,按樣品制備方法制備,按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定,記錄峰面積,計(jì)算得樣品含量(見表2)。

    表2復(fù)方石斛顆粒樣品中槲皮素、山奈素和異鼠李素含量測(cè)定結(jié)果(mg/g)

    樣品批號(hào)槲皮素山奈素異鼠李素201507170.43550.59870.1110201507180.44220.60400.1099201507190.43670.59970.1107

    3討論

    本文在脫脂方法與溶劑的選擇中,參照2015版《中國(guó)藥典》[8]中銀杏葉測(cè)定槲皮素、山奈素和異鼠李素的測(cè)定方法,即索氏提取器回流提取法。此方法雖較張玲等[9]測(cè)定補(bǔ)血草中槲皮素、山奈素和異鼠李素所用超聲法提取所用時(shí)間長(zhǎng),但超聲提取后的溶劑將直接揮發(fā)掉,造成溶劑的浪費(fèi)和環(huán)境的污染。但是藥典索氏提取器回流提取法中,采用的三氯甲烷毒性大,故本文選用比三氯甲烷毒性小的石油醚(60~90 ℃),作為復(fù)方石斛顆粒的脫脂溶劑。

    在植物體內(nèi)的黃酮類化合物常與糖結(jié)合成苷類或碳糖基的形式存在,因而為了準(zhǔn)確測(cè)定其苷元的含量,需對(duì)其進(jìn)行水解去糖。參閱文獻(xiàn)酸水解法[10-12],糖水解的關(guān)鍵因素有溫度、鹽酸含量、水解時(shí)間等。溫度過高將降低黃酮類物質(zhì)的含量,因此我們選取的溫度為85 ℃。對(duì)于鹽酸用量和水解時(shí)間我們進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)行比較,選取體積比為5∶1、4∶1、3∶1、2∶1的甲醇∶25%鹽酸進(jìn)行比較的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相同時(shí)間下當(dāng)甲醇與25%鹽酸體積比為3∶1時(shí),槲皮素、山奈素和異鼠李素的峰面積和已到達(dá)最大;以水解時(shí)間為30、60、90、120、150 min,甲醇與25%鹽酸體積比為3∶1,測(cè)定各條件下各成分峰面積之和的結(jié)果顯示,在水解時(shí)間90 min時(shí)峰面積之和達(dá)到最大,隨著時(shí)間的延長(zhǎng)峰面積之和反而減少,故水解時(shí)間90 min最為適宜。

    本文采用高效液相色譜法建立復(fù)方石斛顆粒中槲皮素、山奈素和異鼠李素的測(cè)定方法,結(jié)果表明該方法安全、可靠、可重復(fù)性強(qiáng),為復(fù)方石斛顆粒的質(zhì)量控制提供試驗(yàn)依據(jù)。該方法也可為其它中藥復(fù)方制劑中槲皮素、山奈素和異鼠李素的檢測(cè)提供參考。

    [參考文獻(xiàn)]

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    [收稿2016-01-13;修回2016-03-15]

    (編輯:王福軍)

    Simultaneous determination of the flavonoids in Compound Dendrobium particles by HPLC

    XuXiaoting,XuYingshu,YangJun

    (Department of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

    [Abstract]Objective To establish the HPLC method determination of quercetin, kaempferol and isorhamneyin in Compound Dendrobium particles. Methods HPLC method was adopted. The Agilent ZORBAX Extend - C18column (150 mm × 4.6 mm, 5 microns) was used with the mobile phase of methanol-0.4% phosphoric acid solution in the gradient elution at 1.0 ml/min. The detection wavelength was 360 nm. The column temperature was 40 ℃ and the volume was 10 μl. Results There was a between the amount of quercetin and peak area in the range of 5~80 μg/ml, kaempferol in the range of 5~80 μg/ml and isorhamneyin in the range of 1.875~30 μg/ml. The liner regression qequations were y=41.592x+34.684 (R2=0.999 9), y=40.24x+36.804 (R2=0.999 9) and y=84.668x-44.102 (R2=0.999 8), respectively. The average recoveries were 99.69% (RSD=1.59%), 100.26% (RSD=1.74%) and 99.63% (RSD=2.08%) with 6 sample in each group. Conclusion This method is well separated, precise and accurate, and could be used for the quality control of Compound Dendrobium particles.

    [Key words]Compound Dendrobium particles; quercetin; kaempferol; isorhamneyin; HPLC

    [中圖法分類號(hào)]R284.1

    [文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

    [文章編號(hào)]1000-2715(2016)02-0200-04

    [通信作者]徐應(yīng)淑,女,碩士,教授,研究方向:新藥研究與開發(fā),E-mail:527822816@qq.com。

    [基金項(xiàng)目]貴州省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目(NO:QZYY2012-52);貴州省赤水市科技局資助項(xiàng)目(NO:赤中藥科合[2013])。

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