絲素/泊洛沙姆復(fù)合水凝膠的藥物緩釋研究

鄧春閩，鐘天翼，左保齊

(1.蘇州大學(xué) 現(xiàn)代絲綢國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州唯特工程咨詢有限公司，江蘇 蘇州 215104)

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絲素/泊洛沙姆復(fù)合水凝膠的藥物緩釋研究

鄧春閩1,2，鐘天翼2，左保齊1

(1.蘇州大學(xué) 現(xiàn)代絲綢國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 蘇州 215123；2.蘇州唯特工程咨詢有限公司，江蘇 蘇州 215104)

摘要：選定不同分子量的表面活性劑泊洛沙姆，分別將它們與絲素溶液以不同的比例混合形成復(fù)合水凝膠，考察其對(duì)阿司匹林與吲哚美辛兩種藥物的體外緩釋性。利用掃描電鏡對(duì)絲素/泊洛沙姆水凝膠緩釋前后的形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了檢測(cè)，以及用紫外分光光度計(jì)分析不同條件下的藥物緩釋曲線。結(jié)果表明通過改變水凝膠的共混比例、泊洛沙姆的分子量和鏈段比可以調(diào)節(jié)兩種藥物的釋放速率，以達(dá)到藥物緩釋的目的。絲素/泊洛沙姆有望作為一種新的遞送載體用于藥物緩釋。

關(guān)鍵詞：絲素；泊洛沙姆；水凝膠；藥物緩釋

藥物的控制釋放是一門新的交叉學(xué)科，起源于20世紀(jì)60年代，隨著科學(xué)技術(shù)發(fā)展，藥物控制釋放已成為國內(nèi)外熱門研究領(lǐng)域之一。將藥物與載體制成制劑，通過適當(dāng)?shù)男问娇刂扑幬镌谌梭w內(nèi)釋放的過程就是藥物控制釋放技術(shù)。從方法上說，它可以分為時(shí)間控制釋放和分布控制釋放兩種，即一定的時(shí)間范圍內(nèi)在體內(nèi)以一定的模式釋放與在指定部位釋放。和傳統(tǒng)給藥方式相比，藥物控釋體系降低了藥物的毒副作用，減少了給藥次數(shù)，從而提高了藥物的療效，減少了病人痛苦。從劑型上分，藥物控制釋放可分為高分子包囊體系、凝膠體系、膠束體系、電紡絲超細(xì)纖維體系及脂質(zhì)體體系，本研究選用凝膠體系。

絲素蛋白來源于蠶絲，富含甘氨酸(G1y)、丙氨酸(Ala)和絲氨酸(Ser)等20種氨基酸[1]，無毒、無刺激，另外還具有優(yōu)良的物理機(jī)械性能[2]、降解性能[3]，并且降解產(chǎn)物不會(huì)引起炎癥反應(yīng)[4]。絲素水凝膠中含有大量水分的三維網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)使其具有良好的可透性和可塑性，可以被廣泛研究應(yīng)用于藥物和生長因子緩釋載體，骨填充材料和細(xì)胞培養(yǎng)支架等方面。而泊洛沙姆具有無毒、無抗原性、無致敏性、無刺激性、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不溶血和可控的親疏水性等優(yōu)點(diǎn)，在組織工程中，尤其是在骨組織工程和生長因子的釋放上有著明顯的優(yōu)勢(shì)。本文通過不同分子量泊洛沙姆與絲素制成共混水凝膠，考察其對(duì)阿司匹林與吲哚美辛的體外緩釋性，為其進(jìn)一步研究用于組織工程中生長因子的釋放做準(zhǔn)備。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)材料

無水碳酸鈉(Na2CO3)(化學(xué)純，上海興達(dá)化學(xué)試劑廠)；溴化鋰(LiBr·H2O)(化學(xué)純，上海恒信化學(xué)試劑有限公司)；桑蠶絲(浙江湖州)；不同分子量泊洛沙姆：泊洛沙姆P188(分子量1 800，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P338(分子量3 300，聚氧乙烯80%)，泊洛沙姆P407(分子量4 000，聚氧乙烯70%)(Sigma，美國)。

吲哚美辛(C19H16ClNO4，鄭州益康藥業(yè))；

阿司匹林(C9H8O4，鄭州益康藥業(yè))；

無水乙醇(C2H6O，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；

十二水合磷酸氫二鈉(Na2HPO4?12H2O，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；

磷酸二氫鉀(KH2PO4，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器

DKZ-2型恒溫振蕩水槽(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司) ；

DZF-1B型真空干燥烘箱(上海賀德實(shí)驗(yàn)股份有限公司)；

FD-1A-50冷凍干燥機(jī)(北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；

ISO 9001型分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

UV-2550型紫外分光光度計(jì)(日本Shimadzu公司)；

PB-10型精密pH計(jì)(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；

Hitach S-480掃描電子顯微鏡(日本Hitach公司)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法與測(cè)試

1.3.1絲素蛋白溶液

桑蠶絲用0.5%(質(zhì)量比)的碳酸鈉溶液脫膠，浴比1∶20，在沸水中煮30min，然后用去離子水洗滌，如此反復(fù)進(jìn)行3次。

將脫膠的桑蠶絲溶于LiBr∶C2H5OH=40∶60(質(zhì)量比)溶液中，恒溫(80±2)℃水浴攪拌溶解獲得再生絲素溶液，經(jīng)冷卻以后，將絲素溶液注入8 000～14 000道爾頓的透析袋中，用自來水流動(dòng)透析1d，再用去離子水透析2d，得到純SF水溶液。最后將絲素水溶液調(diào)控到3%濃度。

1.3.2載藥Poloxamer/SF水凝膠的制備

將泊洛沙姆與絲素溶液分別以P188∶SF=1∶1；P338∶SF=1∶1；P407∶SF=1∶1；P188∶SF=1∶3；P188∶SF=3∶1共混，再稱取0.005g的阿司匹林粉末，分別加入的Poloxamer/SF共混溶液中，充分?jǐn)嚢杌旌暇鶆蚝蠓盅b至10mL離心管，每個(gè)離心管含2mL載藥共混溶液，置于37℃水浴中待其完全形成凝膠，得到載藥量2.5mg/mL的載藥水凝膠。吲哚美辛載藥水凝膠的制備與阿司匹林相同。

1.3.3磷酸鹽緩沖液(PBS)的配制

分別稱取1/15mol/L濃度的Na2HPO4溶液和KH2PO4溶液，按照81.8∶18.2的比例混合，在37℃下，使用稀鹽酸和氯化鈉溶液微調(diào)，待溶液穩(wěn)定后，用精密pH計(jì)測(cè)量得到pH=7.4、濃度為0.1mol/L的PBS緩沖液，最后密封室溫保存。

1.3.4藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取0.5g阿司匹林，然后放到50mL容量瓶中，加50mL無水乙醇溶解，得到10mg/mL的溶液；然后吸取這5mL的濃溶液于50mL容量瓶中，加磷酸鹽的緩沖液50mL得到1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；用同樣的方法，再精密稱量適量標(biāo)準(zhǔn)溶液，加磷酸鹽緩沖液，濃度分別為1，5，10，20，30，50，100μg/mL。吲哚美辛標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和阿司匹林的方法相同。用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定吸光度(阿司匹林λ=302nm，吲哚美辛λ=320nm)，然后進(jìn)行回歸計(jì)算，得到兩種藥物的藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程[5-6]，以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1。

圖1　吲哚美辛和阿司匹林的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.5載藥Poloxamer/SF水凝膠的體外緩釋

分別加入8mL的PBS緩沖液到裝有2mL載藥共混水凝膠的離心管中，再將離心管放到燒杯中，37℃下在恒溫振蕩水槽中振蕩(頻率設(shè)為60r/min)，隔一段時(shí)間從離心管中取出4mL的釋放液，同時(shí)向離心管中加入4mL的PBS緩沖液。再用紫外分光光度計(jì)分別測(cè)定阿司匹林藥物λ=302nm，吲哚美辛藥物λ=320nm釋放液的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算釋放液的釋藥量及藥物濃度，隨著時(shí)間的增長，計(jì)算累積釋藥百分率，并繪制累積釋藥曲線。

2結(jié)果與討論

2.1載藥Poloxamer/SF水凝膠的研究

圖2　阿司匹林和吲哚美辛的分子式結(jié)構(gòu)

阿司匹林又稱乙酰水楊酸(圖2)。至今它仍是世界上應(yīng)用最廣泛的解熱，鎮(zhèn)痛及抗炎藥，是作為比較和評(píng)價(jià)其他藥物的標(biāo)準(zhǔn)制劑。其性狀為白色針狀或板狀結(jié)晶或粉末。熔點(diǎn)135℃，無臭或微帶醋酸臭，味微酸，在干燥空氣中穩(wěn)定，在潮濕空氣中緩緩水解成水楊酸和乙酸，微溶于水，在水里的溶解度大概為3.3mg/mL[7]。吲哚美辛(圖2)又名消炎痛，是一種白色或者微黃色的結(jié)晶性粉末，幾乎無臭，無味。在丙酮中溶解，在甲醇、乙醇、氯仿或乙醚中略溶，在苯中微溶，在甲苯中極微溶解，在水中幾乎不溶[8]。適用于活血化瘀、消腫止痛，可用于風(fēng)濕性、痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎及一些癌性疼痛，也可用于滑囊炎、腱鞘炎及關(guān)節(jié)囊炎等。根據(jù)兩種藥物在水里的溶解度，載阿司匹林藥物的釋放時(shí)間選定為20h，載吲哚美辛藥物的釋放時(shí)間選定為19d。

阿司匹林是一種偏酸性的藥物(圖3)。選擇P188、P338、P407三種不同分子量的非離子表面活性劑泊洛沙姆分別與SF以1∶1比例混合載阿司匹林得到共混水凝膠，如圖3(A)(B)(C)所示SEM圖，對(duì)載阿司匹林藥物后共混水凝膠的形貌進(jìn)行對(duì)比研究。與載藥前相比，加入阿司匹林藥物后，不同分子量的泊洛沙姆，其載藥后的水凝膠都為大的片層結(jié)構(gòu)。纖維之間的縫隙減少，變的較為致密。我們知道，絲素蛋白是一種含有大量正負(fù)電荷的兩性蛋白質(zhì)，其在水中的等電點(diǎn)約為4.5。在等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)分子以雙極離子存在，總凈電荷為零，顆粒無電荷間的排斥作用，易凝集成大顆粒，因而最不穩(wěn)定，溶解度也最小，易沉淀析出。而阿司匹林偏酸性，其結(jié)構(gòu)中含有大量的羧酸根(-COO-)，當(dāng)阿司匹林加入泊洛沙姆/絲素共混溶液中后，其溶解于水中，會(huì)釋放出大量的羧酸根，降低了溶液的pH值并接近等電點(diǎn)，從而絲素分子之間的電荷排斥作用減弱，聚集作用變強(qiáng)，進(jìn)而影響了水凝膠的結(jié)構(gòu)，片層結(jié)構(gòu)會(huì)變得更加緊密。圖3中(D)、(E)和(F)所示，是載阿司匹林藥物緩釋120h后水凝膠截面的SEM圖像，水凝膠變得脆弱且易碎，可以看出泊洛沙姆/絲素水凝膠表面孔壁均存在大量的細(xì)小孔洞。這是由于阿司匹林在PBS溶液中的不斷溶解釋放，而絲素分子中存在大量的極性氨基酸殘基，易與阿司匹林之間生成氫鍵結(jié)合，這些結(jié)合的位置就形成了細(xì)小的孔洞。

A、P188/SF 1∶1,B、P338/SF 1∶1,C、P407/SF 1∶1載阿司匹林藥物緩釋前；D、P188/SF 3∶1, E、P338/SF 1∶1, F、P407/SF 1∶1載阿司匹林藥物緩釋后圖3　共混水凝膠的掃描電鏡圖

圖4是載吲哚美辛緩釋前后的水凝膠形貌圖，其中A、B、C是載吲哚美辛后的水凝膠SEM圖像，與載阿司匹林后的水凝膠對(duì)比，不同分子量的泊洛沙姆載吲哚美辛后的水凝膠也是均勻的多片層結(jié)構(gòu)。不過這種片層變得更脆弱易斷，這可能是因?yàn)檫胚崦佬潦且环N疏水性藥物難溶于水，由于泊洛沙姆的存在，增加了吲哚美辛的溶解性，泊洛沙姆中的疏水性基團(tuán)將其包裹聚集在一起。但是這些疏水性藥物會(huì)使疏水性基團(tuán)的作用力減弱，從而這些片層結(jié)構(gòu)會(huì)更加脆弱。D、E、F為吲哚美辛緩釋14D后水凝膠截面的SEM圖像，可以觀察到膜的表面存在許多微小的孔洞。E是對(duì)水凝膠孔壁的進(jìn)一步放大的SEM圖像，這些大小不一的納米孔洞直徑分布約10～400nm。結(jié)合緩釋吲哚美辛前水凝膠的形態(tài)，可能是隨著時(shí)間的增加，吲哚美辛逐漸釋放出來形成的。

A、P188/SF 1∶1, B、P338/SF 1∶1, C、P407/SF 1∶1載吲哚美辛藥物緩釋前;D、P188/SF 3∶1, E、P338/SF 1∶1,F、P407/SF 1∶1載吲哚美辛藥物緩釋后;圖4　共混水凝膠的掃描電鏡圖

2.2不同種類泊洛沙姆對(duì)水凝膠體外緩釋行為的影響

圖5為不同分子量Poloxamer/SF水凝膠相同比例混合在37℃、pH=7.4的磷酸鹽中緩沖液的藥物釋放累積曲線?？梢钥闯鲚d阿司匹林水凝膠釋藥過程是先快后慢地釋放，而載吲哚美辛水凝膠釋藥過程是先快后慢再快地釋放。

A和C圖分別為P188、P338、P407載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率?？梢钥闯?，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率略有不同，對(duì)阿司匹林藥物來說，P407累計(jì)釋放藥物最少最快，而P338累計(jì)釋放藥物最多最慢。這可能是因?yàn)榘⑺酒チ制嵝?，其與絲素形成氫鍵，而P407的分子量最大，而親水性最弱，其在一定程度上減弱了氫鍵作用，所以藥物釋放會(huì)最快。而對(duì)于大多數(shù)藥物緩釋系統(tǒng)來說，主要涉及擴(kuò)散和降解溶蝕兩種作用。結(jié)合之前對(duì)載阿司匹林水凝膠的研究，阿司匹林與Poloxamer/SF共混水凝膠形成了致密的大片層結(jié)構(gòu)，阿司匹林?jǐn)U散到共混水凝膠中間，而釋放液不易進(jìn)入孔壁內(nèi)部，孔壁內(nèi)部的阿司匹林需通過擴(kuò)散作用到達(dá)孔壁表面再釋放，而P407與絲素溶液最快最容易形成水凝膠，所以阿司匹林也會(huì)更最不容易釋放，其累計(jì)釋放量也會(huì)最少。對(duì)于吲哚美辛藥物來說，藥物釋放速率差不多，不過P407的藥物釋放量最多，而P188的藥物釋放量最少。我們知道，泊洛沙姆具有增溶作用，分子量越大，疏水性作用越大，泊洛沙姆與吲哚美辛的結(jié)合也越容易，但隨著時(shí)間的增加，由于PBS緩沖液的加入，吲哚美辛藥物要釋放。而增溶作用藥物與泊洛沙姆結(jié)合的并不是那么緊密，所以會(huì)有更多藥物釋放出來。

a、P188∶SF=1∶1,b、P338∶SF=1∶1,c、P407∶SF=1∶1A、阿司匹林，C、吲哚美辛圖5　不同分子量Plolxamer/SF共混水凝膠的體外藥物釋放累積曲線

圖6為相同分子量不同共混比例P188/SF水凝膠在37℃、pH=7.4的磷酸鹽中緩沖液的藥物釋放累積曲線?？梢钥闯鲚d阿司匹林水凝膠釋藥過程也是先快后慢地釋放，而載吲哚美辛水凝膠釋藥過程也是先快后慢再快地釋放。

圖6中的B、D圖為同種泊洛沙姆與絲素以不同比例混合的釋藥累積速率?？梢钥闯?，隨著P188含量的的增加，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率都會(huì)有不同程度的降低。這是因?yàn)殡S著載藥量的增加，材料與藥物分子之間的相互作用增強(qiáng)，阿司匹林與絲素之間存在氫鍵作用，吲哚美辛與泊洛沙姆存在增溶作用，兩者均會(huì)使釋藥累積一定程度的下降。

a、P188:SF=1:1, b、p188:SF=1:3, c、p188:SF=3:1B、阿司匹林，D、吲哚美辛圖6　相同分子量Poloxamer/SF共混水凝膠的體外藥物釋放累積曲線

3結(jié)論

(1)當(dāng)阿司匹林加入共混溶液中后，會(huì)釋放出大量的羧酸根，降低了溶液的 pH值，使其接近絲素的等電點(diǎn)，同時(shí)易于和絲素之間以氫鍵結(jié)合，進(jìn)而影響了水凝膠的形態(tài)結(jié)構(gòu)，形成了大量大片層水凝膠。

(2)藥物吲哚美辛加入共混溶液中后，泊洛沙姆會(huì)對(duì)其發(fā)生增溶作用，形成含有大量載藥多片層水凝膠，但這種片層結(jié)構(gòu)比較脆弱。

(3)載阿司匹林水凝膠釋藥過程是先快后慢地釋放，而載吲哚美辛水凝膠釋藥過程則是先快后慢再快地釋放。隨著共混比例中絲素比例的下降或P188含量的的增加，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率都有不同程度的降低。

(4)對(duì)不同分子量的泊洛沙姆P188、P338、P407來說，載阿司匹林和吲哚美辛水凝膠的釋藥累積速率則略有不同；對(duì)阿司匹林藥物來說，P407累計(jì)釋放藥物最少最快，而P338累計(jì)釋放藥物最多最慢；對(duì)于吲哚美辛藥物來說，藥物釋放速率差不多，但是P407的藥物釋放量最多，而P188的藥物釋放量最少。

因此，可以通過改變共混比例、泊洛沙姆的分子量和鏈段比例，使載藥水凝膠能夠定量勻速的向外釋放藥物，從而達(dá)到控釋的目的。

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收稿日期：2016-01-05