楊梅素誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡及凋亡通路的研究

李有富，李　輝，韓　濤，丁楠楠

(湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，襄陽(yáng)　441021)

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楊梅素誘導(dǎo)人宮頸癌HeLa細(xì)胞凋亡及凋亡通路的研究

李有富，李輝*，韓濤，丁楠楠

(湖北文理學(xué)院附屬襄陽(yáng)市中心醫(yī)院，襄陽(yáng)441021)

摘要：目的研究楊梅素體外對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、凋亡及凋亡通路的影響。方法體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞，MTT和SRB法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，計(jì)算機(jī)分析細(xì)胞周期；Western Blot法檢測(cè)caspase-3、caspase-9和survivin含量。結(jié)果楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞的體外增殖具有抑制作用，并具有濃度和時(shí)間依耐性；楊梅素體外誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，并將細(xì)胞周期阻滯在S期；楊梅素促進(jìn)caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)，抑制survivin蛋白表達(dá)。結(jié)論楊梅素可抑制HeLa細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，其凋亡途徑同時(shí)涉及細(xì)胞內(nèi)途徑和細(xì)胞外途徑。

關(guān)鍵詞：楊梅素；HeLa細(xì)胞；增殖；凋亡；caspase-3；caspase-9；survivin

楊梅素(myricetin，Myr)化學(xué)名為 3，3，4，5，5，7-六羥基黃酮，異名為楊梅樹(shù)皮素、楊梅黃酮和楊梅酮，是多羥基黃酮類(lèi)化合物，主要存在于楊梅樹(shù)的樹(shù)皮中[1]?，F(xiàn)有的研究表明，楊梅素具有廣泛的藥理作用，包括降血糖、護(hù)肝、抗氧化、抗自由基、免疫調(diào)節(jié)以及抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[2-3]，近年來(lái)其抗腫瘤作用備受關(guān)注，但是目前國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)楊梅素的抗腫瘤活性及其機(jī)制研究較少。本研究主要觀察楊梅素對(duì)人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期和信號(hào)通路等方面的影響，考察其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，為其抗腫瘤治療奠定基礎(chǔ)。

1儀器與材料

1.1儀器Multiskan Ascent酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo Electron公司；CO2培養(yǎng)箱，法國(guó)JOUAN公司；SW-4J-1F凈化工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；TE2000-S型倒置顯微鏡，Nikow公司；TDL-5低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；96孔培養(yǎng)板，Coming公司。

1.2材料人宮頸癌HeLa細(xì)胞購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所，用含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)；楊梅素由本實(shí)驗(yàn)室制備所得，批號(hào)20130727，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為98.1%(HPLC)；RPMI 1640培養(yǎng)液，GIBCO公司；胰酶、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)和SRB試劑均購(gòu)于Sigma公司；survivin、caspase-3和caspase-9單克隆抗體購(gòu)于Abcam公司；Western及IP細(xì)胞裂解液、蛋白提取試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、GAPDH抗體和BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒均購(gòu)于北京碧云天生物科技有限公司。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)將人宮頸癌HeLa細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清、質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1的青霉素以及質(zhì)量濃度為0.05 g·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和95%的飽和濕度培養(yǎng)箱中，每隔3 d用胰蛋白酶消化后進(jìn)行傳代，用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)研究。

2.2體外抗腫瘤作用2.2.1MTT法檢測(cè)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響收集處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞稀釋成1×105個(gè)·mL-1的細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL，培養(yǎng)

24 h。將楊梅素溶解于1640培養(yǎng)液中，分別加入96孔培養(yǎng)板，使每組楊梅素終質(zhì)量濃度分別為10，20，40，80，160和320 μg·mL-1，每組有6個(gè)平行孔，空白對(duì)照組加入1640培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)24，48和72 h時(shí)各取出一板，按照MTT法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)：從各孔中吸取100 μL上清液，加入MTT 10 μL(終質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1)，再次培養(yǎng)4 h后，每孔加入DMSO 100 μL，微量振蕩器充分振蕩使其溶解，置于酶標(biāo)儀上570 nm處測(cè)定A值。按照“細(xì)胞平均抑制率(%)=(1-給藥孔平均A值/對(duì)照孔平均A值)×100%”計(jì)算，以劑量和抑制率繪制各板生長(zhǎng)曲線。

2.2.2SRB法檢測(cè)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響按照2.2.1項(xiàng)下方法將HeLa細(xì)胞接種于96孔板中培養(yǎng)，24 h后加入楊梅素，分別培養(yǎng)24，48和72 h后，進(jìn)行SRB法檢測(cè)：每孔加入預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為50%的三氯乙酸50 μL，固定，靜置5 min，將96孔板移至4 ℃下放置1 h；倒掉固定液，去離子水洗5遍，干燥后每孔加SRB液100 μL，室溫避光放置10 min；用10 mL·L-1的醋酸洗5遍，空氣干燥，加150 μL 10 mmol·L-1非緩沖Tris堿液(pH值為10.5)溶解，置于515 nm處測(cè)定A值。按照2.2.1項(xiàng)下方法繪制生長(zhǎng)曲線。

2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡和周期的影響將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞調(diào)整濃度至1×106個(gè)·mL-1，接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后隨機(jī)分為40，80和160 μg·mL-1的楊梅素組和陽(yáng)性對(duì)照順鉑組，對(duì)照組加1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中，48 h后消化洗滌細(xì)胞，用4 ℃冰箱中預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇將HeLa細(xì)胞固定。檢測(cè)凋亡前，先離心棄去上清液，用PBS洗滌細(xì)胞后置于檸檬酸緩沖液中放置1 h以上，調(diào)整濃度為1×106個(gè)·mL-1左右，置于流式細(xì)胞儀中檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，用計(jì)算機(jī)分析細(xì)胞周期。

2.4Western Blot法檢測(cè)對(duì)宮頸癌細(xì)胞survivin、caspase-3和caspase-9含量的影響將4個(gè)質(zhì)量濃度組(0，20，40和80 μg·mL-1)的楊梅素分別作用于細(xì)胞48 h后，用胰酶消化細(xì)胞，按照總蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求將消化后的HeLa細(xì)胞置于EP管中，加入100 μL細(xì)胞裂解液吹打使其均勻，置于冰上30 min，4 ℃ 以14 000 r·min-1離心10 min，取上清液，每管取30 μg總蛋白加入上樣緩沖液煮沸5 min，SDS/PAGE凝膠電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜，用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶封閉2 h，一抗(1∶1 000) 4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶500)室溫孵育2 h，采用二氨基聯(lián)苯胺顯色，結(jié)果進(jìn)行灰度掃描分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3結(jié)果

3.1對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響同時(shí)采用MTT法和SRB法 2種方法檢測(cè)楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的抑制作用，發(fā)現(xiàn)2種方法結(jié)果一致，楊梅素體外能抑制HeLa細(xì)胞的增殖，各劑量楊梅素作用的細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率與同板上空白對(duì)照組相比均具有顯著性差異(P<0.05)，不同板之間，同一質(zhì)量濃度組的抑制率隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)而增大。因此可見(jiàn)楊梅素體外可抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，并具有質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴(lài)性。見(jiàn)圖1。

圖1MTT法和SRB法檢測(cè)楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

A.MTT法;B.SRB法

Fig.1The impact of myricetin on proliferation of HeLa cells by MTT and SRB

A.MTT method;B.SRB method

3.2對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響各劑量組的楊梅素作用于HeLa細(xì)胞后，均能誘導(dǎo)其凋亡。質(zhì)量濃度為40，80和160 μg·mL-1的楊梅素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率分別為24.70%，29.25%和35.18%，明顯高于對(duì)照組，細(xì)胞凋亡率隨著劑量的增加而明顯增加。見(jiàn)表1。

表1楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響

Tab.1 The impact of myricetin on apoptosis of HeLa cells

±s，n=3)

注：與細(xì)胞對(duì)照組比較**P<0.01。

3.3對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響數(shù)據(jù)表明，楊梅素作用過(guò)的HeLa細(xì)胞，各細(xì)胞周期均發(fā)生變化，3組細(xì)胞的S期比例均有明顯增加，與對(duì)照組相比，P<0.05；S期所占比例隨藥物劑量的增加也增加；而G0～G1期和G2～M期比例則相應(yīng)減少，但與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著性差異。由此可推測(cè)，楊梅素通過(guò)將HeLa細(xì)胞周期阻滯于S期而抑制其增殖。見(jiàn)表2。

表2楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞周期的影響

Tab.2 The impact of myricetin on cell cycle of HeLa cells

±s，n=3)

注：與細(xì)胞對(duì)照組比較**P<0.01，*P<0.05。

3.4對(duì)survivin、caspase-3和caspase-9含量的影響見(jiàn)表3和圖2。結(jié)果顯示，楊梅素各組抑制survivin蛋白的表達(dá)，促進(jìn)caspase-3和caspase-9的表達(dá)，與對(duì)照組相比，結(jié)果均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05，0.01或0.001)，同時(shí)具有劑量依賴(lài)性。

圖2楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞survivin、caspase-3和caspase-9和蛋白表達(dá)的影響

Fig.2 The impact of myricetin on the expressions of survivin，caspase-3 and caspase-9 of HeLa cells

表3楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞survivin,caspase-3和caspase-9蛋白表達(dá)的影響

Tab.3 The impact of myricetin on the expressions of survivin，caspase-3 and caspase-9 of HeLa cells

組別劑量/μmol·L-1蛋白表達(dá)水平survivin/ng·L-1caspase-3/pmol·L-1caspase-9/pmol·L-1細(xì)胞對(duì)照—513.03±21.0923.58±1.4222.97±1.84順鉑40313.10±21.48***24.17±1.6030.69±1.39**楊梅素10497.32±11.5126.32±0.82*27.78±1.37*楊梅素40296.64±33.96***31.44±2.89*30.43±1.03**楊梅素160282.30±25.64***38.90±0.92***36.84±1.55***

注：與細(xì)胞對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

4討論

宮頸癌嚴(yán)重危害婦女的健康，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，其全球死亡率居女性腫瘤第2位[4]。宮頸癌的治療方法包括手術(shù)、放療、化療，但其不良反應(yīng)較嚴(yán)重。隨著中藥有效成分在惡性腫瘤的輔助治療中逐漸被臨床工作者應(yīng)用，越來(lái)越多的學(xué)者也致力于各種中藥有效成分抗腫瘤作用的研究[5-6]。楊梅素是廣泛存在于多種天然中草藥中的化學(xué)成分，具有抗腫瘤、提高免疫力、毒性低等優(yōu)點(diǎn)，可作為一種潛在的抗腫瘤輔助藥物。因此，本文主要從凋亡機(jī)制及通路等方面研究楊梅素對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。

本研究同時(shí)采用MTT法和SRB法2種方法觀察楊梅素對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，楊梅素能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)，并且具有良好的劑量和時(shí)間依賴(lài)性，2種方法相互印證，楊梅素具有體外抗腫瘤作用，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。而流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，楊梅素處理過(guò)的細(xì)胞凋亡率明顯增加，它將細(xì)胞阻滯于S期，提示楊梅素通過(guò)影響細(xì)胞周期從而抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)。

凋亡是細(xì)胞在外界的影響下為了更好地適應(yīng)在眾多基因調(diào)控下進(jìn)行的程序性死亡過(guò)程，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)[7-8]。細(xì)胞的增殖和凋亡在正常機(jī)體內(nèi)應(yīng)處于一種平衡狀態(tài)，若這種狀態(tài)被打破，可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。國(guó)內(nèi)外研究表明，機(jī)體可通過(guò)caspase依賴(lài)途徑以及非caspase依賴(lài)途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，caspase家族是引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行者。激活caspase家族又分為細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑(線粒體通路)和細(xì)胞外信號(hào)途徑(死亡受體通路)。細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑通過(guò)線粒體釋放促凋亡分子(如細(xì)胞色素C)進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，其與凋亡蛋白酶活化因子(Apaf-1)形成多聚復(fù)合體，激活caspase-9，導(dǎo)致DNA降解和染色體濃縮，從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[9]。細(xì)胞外信號(hào)途徑中細(xì)胞外部因子激活caspase家族中成員，無(wú)活性前體pro-caspase-3被激活剪切，形成活性片段cleaved caspase-3，再激活下游的caspase家族，最終引起細(xì)胞凋亡[10]。caspase-3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中主要的效應(yīng)因子，大多數(shù)細(xì)胞凋亡途徑均通過(guò)caspase-3誘導(dǎo)的信號(hào)傳遞過(guò)程[11]。survivin是重要的凋亡抑制蛋白，發(fā)揮抑制細(xì)胞凋亡的作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。survivin還可通過(guò)抑制凋亡終末效應(yīng)酶Caspase-3活性而減少caspase依賴(lài)途徑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，survivin基因表達(dá)水平下調(diào)還可增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性[12-13]。

本研究采用Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，楊梅素在誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的同時(shí)，能夠通過(guò)活化基因蛋白caspase-3、caspase-9，抑制survivin蛋白從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡，且具有劑量依賴(lài)性，提示楊梅素可同時(shí)通過(guò)細(xì)胞內(nèi)途徑和細(xì)胞外途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡。但是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過(guò)程極其復(fù)雜，可能還涉及其他的基因蛋白，還需進(jìn)一步研究。

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Effects of myricetin on apoptosis and apoptosis pathway of human cervical cancer HeLa cells

LI Youfu，LI Hui*，HAN Tao，DING Nannan

(Xiangyang Central Hospital Affiliated to Hubei University of Arts and Science，Xiangyang 441021，China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the activity of myricetin on proliferation，apoptosis and to study the apoptosis signaling pathway on human cervical cancer HeLa cells. MethodsHeLa cells were cultured in vitro，and MTT and SRB were performed to observe the proliferation. Flow cytometry was utilized to measure the apoptosis and analysis of the cell cycle. The expressions of caspase-3,caspase-9 and survivin were determined by Western Blot. ResultsMyricetin could inhibit the proliferation of HeLa cells in vitro，in a concentration and time-dependent manner. Myricetin could elevate the apoptosis rates，and cell cycle was blocked in S phase. Myricetin was able to promote the expressions of caspase-3 and caspase-9，inhibit the expression of survivin. Conclusion Myricetin could inhibit the proliferation of HeLa cells，induce apoptosis，and the apoptosis pathway propably involves both intracellular and extracellular pathways.

Key words:myricetin；HeLa cells；proliferation；apoptosis；caspase-3；caspase-9；survivin

(收稿日期：2015-07-01)

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1004-2407(2016)03-0270-05

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2016.03.015

*通信作者：李輝，女，主管藥師

作者簡(jiǎn)介：李有富，男，主管藥師