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      基于熒光探針的消渴安中DPP4抑制劑的篩選與鑒定

      2016-05-26 18:42:21吳雪莉王毅趙筱萍
      中國中藥雜志 2016年7期
      關(guān)鍵詞:知母皂苷人參

      吳雪莉 王毅 趙筱萍

      [摘要]基于小分子熒光探針的中藥活性成分篩選研究方興未艾。該研究應(yīng)用具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象(AIE)的新型小分子熒光探針,對中成藥消渴安中二肽基肽酶4(DPP4)抑制劑進(jìn)行篩選。采用系統(tǒng)分離法,從消渴安中分離和制備了43個化學(xué)組分;以抑二肽素A為陽性對照藥,對消渴安的43個組分進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)13個化學(xué)組分對DPP4的活性具有抑制作用;采用LCMS技術(shù)對這13個組分進(jìn)行定性分析,鑒定推斷出16個化合物。進(jìn)一步對其中14個化合物進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)5個化合物對DPP4具有較高的抑制作用,其中丹酚酸C、人參皂苷Rg5、知母皂苷AI在5~50 μmol·L-1呈良好的量效抑制關(guān)系。該研究為運(yùn)用小分子熒光探針技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)提供了成功實(shí)例。

      [關(guān)鍵詞]DPP4抑制劑; 消渴安; 2型糖尿病; 聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象; 熒光探針

      [Abstract]Fluorescent bioprobes have attracted increasing attentions in studies for screening bioactive compounds from traditional Chinese medicines In this study, a newtype fluorescent probe with the function of aggregationinduced emission (AIE) was used to screen dipeptidyl peptidase4 (DPP4) inhibitor from Xiaokean formula, which has been clinically used for the treatment of type 2 diabetes mellitus Potential DPP4 inhibitors were screened by the fluorescent probe, with diprotin A as the positive control; totally 43 components were isolated from Xiaokean formula by systematic separation The results showed that 13 components can exert inhibitory effects on DPP4 activity; 16 compounds were further identified by liquid chromatographymass spectrometry (LCMS) from those active components The inhibitory effects of 14 compounds were further verified, while five of them showed significant inhibition against DPP4 Salvianolicacid C, ginsenoside Rg5 and timosaponin AI inhibited DPP4 activity at the concentration of 550 μmol·L-1 in a dosedependent manner Thus, our study provided a successful example for screening bioactive compounds from traditional Chinese medicines by using a novelfluorescent probe

      [Key words]DPP4inhibitor; Xiaokean formula; type 2 diabetes mellitus; aggregationinduced emission; fluorescent probe

      doi:10.4268/cjcmm20160714

      二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase4,DPP4)是一種絲氨酸肽酶,可特異性識別具有促胰島素分泌作用的腸促胰島素N端第二位的丙氨酸,并切斷N端2個氨基酸,使腸促胰島素失活,胰島素分泌減少[12],血糖升高進(jìn)而引發(fā)糖尿病。因此,DPP4抑制劑已成為目前治療糖尿病的主要藥物之一。消渴安由人參、知母、丹參、地黃、玉竹、枸杞子、地骨皮和黃連組成,是治療2型糖尿病的臨床經(jīng)驗(yàn)方[36],但該方的主要化學(xué)成分是否具有DPP4抑制作用有待研究。

      本研究運(yùn)用具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光現(xiàn)象(aggregationinduced emission,AIE)的新型小分子熒光探針,考察消渴安主要化學(xué)組分對DPP4活性的抑制作用,并結(jié)合LCMS技術(shù),對活性組分進(jìn)行鑒定推斷,旨在明確消渴安中具有DPP4抑制作用的主要化合物,為闡明該方抗糖尿病作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。

      1材料

      11儀器TecanF200多功能酶標(biāo)儀(Tecan,澳大利亞);冷凍干燥機(jī)、FinniganLCQDecaXPplus離子阱質(zhì)譜儀(ThermoFinnigan,美國);Agilent Zorbax SBC18色譜柱(46 mm×250 mm,5 μm)、Agilent 1200高效液相色譜儀,配有四元泵,二極管陣列檢測器,自動進(jìn)樣器以及恒溫系統(tǒng)(Agilent,美國);島津制備液相(島津,日本);MilliQSynthesis超純水系統(tǒng)(Millipore,美國);MiniSpin離心機(jī)(Eppendorf,德國);XS105 DualRange分析天平(MettlerToledo,瑞士)。

      12試劑二肽基肽酶4(dipeptidyl peptidase4,DPP4,來源于豬腎臟)、抑二肽素A(diprotinA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)、HEPES(Sigma,美國);小分子熒光探針(上海淘普生物科技有限公司);乙腈、甲醇(色譜純,Merck,德國);甲酸(色譜純,Tedia,美國);乙醇(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。

      13藥物消渴安膠囊購自通化華夏藥業(yè)股份有限公司(批號1305021);知母皂苷BⅡ、知母皂苷C、人參皂苷Rc、知母皂苷AⅢ、表小檗堿、黃連堿、丹酚酸C、人參皂苷Rg5購自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司;新知母皂苷BⅡ、知母皂苷AⅠ購自上海源葉生物科技有限公司;人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd、小檗堿購自中國藥品生物制品檢定所;人參皂苷Ro購自成都曼斯特生物科技有限公司。

      2方法與結(jié)果

      21消渴安膠囊化學(xué)組分的制備取消渴安膠囊內(nèi)容物120 g,加入10倍量甲醇超聲提取1 h。過濾,50 ℃下旋蒸至浸膏狀,用100 mL超純水復(fù)溶。復(fù)溶液用大孔樹脂進(jìn)行分離,依次用水、40%乙醇和95%乙醇洗脫,分別得到B01,B02,B03組分。B02和B03組分進(jìn)一步用制備液相進(jìn)行分離。制備液相色譜條件:流動相水(A)乙腈(B),流速10 mL·min-1,柱溫30 ℃,B02組分梯度洗脫(0~40 min,5%~15% B;40~55 min,15%~20% B;55~60 min,20%~45% B;60~64 min,45%~100% B;64~70 min,100%B),B03組分梯度洗脫(0~60 min,30%~75% B;60~63 min,75%~85% B;63~65 min,85%~100% B;65~75 min,100%B),每個組分從第4 min開始接收樣品,每3 min為1個組分,共21個組分,其中第21個組分為64~70 min的洗脫液。B02制得的各組分編號分別為D01~D21,B03制得的各組分編號分別為C01~C21。

      22活性組分篩選由于組分B01和C16的制備量過少,無法滿足篩選需要,所以本研究實(shí)際篩選了43個組分。取適量各待篩組分,用DMSO溶解,配成50 g·L-1儲備液,臨用前用HEPES緩沖液(05 mmol·L-1,pH 70)進(jìn)行稀釋。

      本研究采用課題組建立的DPP4抑制劑篩選方法[7],對消渴安組分進(jìn)行篩選。實(shí)驗(yàn)分為空白組(含10 μmol·L-1小分子熒光探針)、對照組(含10 μmol·L-1小分子熒光探針和5 U·L-1 DPP4溶液)、樣品對照組(含10 μmol·L-1小分子熒光探針和25 mg·L-1待篩組分)和樣品組(含10 μmol·L-1小分子熒光探針、5 U·L-1 DPP4溶液和25 mg·L-1待篩組分),總反應(yīng)體積為100 μL,HEPES緩沖液(05 mmol·L-1,pH 70)為反應(yīng)溶劑,抑二肽素A作為陽性對照藥。37 ℃孵育30 min后,酶標(biāo)儀檢測各組熒光強(qiáng)度(λex=320 nm,λem=450 nm),按下式計(jì)算各組分對DPP4的抑制率,其中I表示熒光強(qiáng)度。

      DPP4抑制率=1-(I樣品-I樣品對照)/I樣品對照(I對照-I空白)/I空白×100%

      實(shí)驗(yàn)結(jié)果用±s表示。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在排除樣品對熒光探針的干擾后有13個組分對DPP4的活性具有抑制作用,見圖1。

      23活性組分LCMS分析采用LCMS技術(shù)對活性組分進(jìn)行鑒定分析。色譜條件為Agilent Zorbax SBC18色譜柱(46 mm×250 mm,5 μm),進(jìn)樣量5 μL,流速05 mL ·min-1,柱溫35 ℃,流動相05%甲酸水(A)05%甲酸乙腈(B),梯度洗脫(0~20 min,5%~20% B;20~25 min,20%~26% B;25~50 min,26%~33% B;50~60 min,33%~40% B;60~70 min,40%~80% B;70~80 min,80%~100% B)。經(jīng)過對13個組分的正負(fù)離子流圖分析,發(fā)現(xiàn)B03負(fù)離子流圖、C07正離子流圖、C08正離子流圖和C13正負(fù)離子流圖基本包括了主要化合物信息,4個組分的離子流圖見圖2。

      消渴安中對DPP4的活性具有抑制作用的13個化學(xué)組分,經(jīng)過LCMS分析,主要鑒定或推斷出16個化合物。其中化合物1,3~14通過與對照品的保留時(shí)間和質(zhì)荷比(m/z)比對進(jìn)行鑒定?;衔?6在負(fù)離子模式下,可檢測到[M-H] -和[M+HCOOH-H]-;在正離子模式下,可檢測到準(zhǔn)分子離子[M+H]+,因此推斷化合物16為人參皂苷Rg5。同理,推斷化合物2為新知母皂苷BⅡ,化合物15為丹酚酸C。具體信息見表1。

      24化合物對DPP4活性的抑制作用將23分析出的16個化合物中的14個化合物按22項(xiàng)下方法考察對DPP4活性的抑制作用(知母皂苷Ⅰ和巴馬汀由于沒有對照品,所以沒有進(jìn)行驗(yàn)證)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹酚酸C、人參皂苷Rg5、人參皂苷Ro、知母皂苷AI和知母皂苷AⅢ對DPP4有較強(qiáng)的抑制作用,抑制率分別為(9557±246)%,(9012±530)%,(5573±177)%,(5361±838)%,(4515±683)%,其中丹酚酸C、知母皂苷AⅠ和人參皂苷Rg5在5~50 μmol·L-1具有良好的量效抑制關(guān)系,見圖3。

      3討論

      腸促胰島素是一類由腸道內(nèi)分泌細(xì)胞分泌并對餐后胰島素的分泌具有調(diào)節(jié)作用的肽類物質(zhì),主要包括胰高血糖素樣肽1(glucagon like peptide1,GLP1)和葡萄糖依賴性促胰島素肽(glucosedependent insulinotropic polypeptide,GIP)[2]。2型糖尿病患者的GIP促胰島素分泌作用受損,雖然GLP1分泌不足,卻依然具有促胰島素分泌的作用[89],因此,GLP1是治療2型糖尿病的重要靶點(diǎn)之一。但由于GLP1在體內(nèi)極易被DPP4水解,使得這類藥物的臨床應(yīng)用受到很大限制。DPP4抑制劑可有效延長GLP1半衰期,降低糖化血紅蛋白、調(diào)節(jié)血脂、加快胰島β細(xì)胞增殖,并能提高肝臟和肌肉等組織對胰島素的敏感性[10]。所以,DPP4抑制劑已成為糖尿病藥物研發(fā)的熱點(diǎn)。

      目前,DPP4抑制劑常用篩選方法有熒光底物法[11]、發(fā)色底物法[12]和液質(zhì)聯(lián)用法[13],其中熒光底物法具有靈敏度高、耗時(shí)短的優(yōu)點(diǎn),是目前應(yīng)用最為廣泛的DPP4抑制劑篩選方法[14]。但由于大多熒光探針具有濃度猝滅效應(yīng)(concentration quenching effect,CQE)和聚集誘導(dǎo)熒光淬滅現(xiàn)象(aggregationcaused quenching,ACQ),限制了這些熒光探針的使用,而具有AIE現(xiàn)象的小分子熒光探針則可避免CQE和ACQ的產(chǎn)生[15]。在本研究中,運(yùn)用具有AIE特性的新型小分子熒光探針進(jìn)行DPP4抑制劑篩選,能夠避免中藥化合物所引起的紫外、熒光吸收;且由于該小分子熒光探針在反應(yīng)體系中自身不發(fā)熒光,當(dāng)DPP4切斷熒光探針的N端二肽后,殘基水溶性降低,發(fā)生聚集而產(chǎn)生熒光,因此該方法對DPP4的活性檢測具有較高靈敏度和特異性。

      本研究運(yùn)用具有AIE現(xiàn)象的新型小分子熒光探針對消渴安中DPP4抑制劑進(jìn)行篩選,發(fā)現(xiàn)丹酚酸C、人參皂苷Rg5和知母皂苷AI對DPP4具有抑制作用且在一定濃度范圍內(nèi)呈量效抑制關(guān)系。研究表明,人參總皂苷[16]和知母提取物[17]都能增加GLP1的分泌,可作為潛在GLP1激動劑。而在本研究中,發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg5和知母皂苷AI對DPP4具有抑制作用,推測消渴安既能抑制GLP1的水解,又能促進(jìn)GLP1的分泌,可從2個方面發(fā)揮治療糖尿病的作用。另外,人參皂苷Rg1和Rb1的抗糖尿病作用分別與Fas信號通路和Caspas3信號通路有關(guān)[18];知母提取物通過激活腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine5′monophosphateactivated protein kinase,AMPK)改善葡萄糖和脂質(zhì)代謝[19];丹參可溶性多糖通過降低氧化應(yīng)激水平改善胰島素抵抗[20]??梢娤拾仓委熖悄虿∈峭ㄟ^多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑而發(fā)揮作用的。但目前關(guān)于人參、知母和丹參中活性化合物抑制DPP4的研究還少見報(bào)道,所以對本研究篩選到的化合物,其抗糖尿病活性與作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

      [參考文獻(xiàn)]

      [1]Lambeir A M, Durinx C, Scharpé S, et al. Dipeptidylpeptidase IV from bench to bedside: an update on structural properties, functions, and clinical aspects of the enzyme DPP IV[J]. Crit Rev Clin Lab Sci,2003, 40(3): 209.

      [2]Drucker D J. The biology of incretin hormones[J]. Cell Metab, 2006, 3(3): 153.

      [3]Yang Z, Liu W, Zhang F, et al. Deciphering the therapeutic mechanisms of XiaoKeAn in treatment of type 2 diabetes in mice by a Fangjiomics approach[J]. Acta Pharmacol Sin, 2015, 36: 699.

      [4]Yang Z, Wang L, Zhang F, et al. Evaluating the antidiabetic effects of Chinese herbal medicine: XiaoKeAn in 3T3L1 cells and KKAy mice using both conventional and holistic omics approaches[J]. BMC Complement Altern Med, 2015, 15(1): 1.

      [5]南征, 南紅梅, 何澤, 等. 消渴安膠囊治療 2 型糖尿病 920 例臨床與實(shí)驗(yàn)研究[J]. 長春中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2005, 21(1): 13.

      [6]孫勝君, 趙金祥, 南紅梅, 等. 消渴安湯治療糖尿病減少胰島素用量的臨床研究[J]. 長春中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2010, 26(3): 6.

      [7]Wang Y, Wu X, Cheng Y, et al. Fluorescent switchable AIE probe for selective imaging of dipeptidyl peptidase4 in vitro and in vivo and its application in screening DPP4 inhibitors[J]. Chem Commun, 2016, 52(17):3478.

      [8]Nauck M A, Heimesaat M M, Orskov C, et al. Preserved incretin activity of glucagonlike peptide 1 [736amide]but not of synthetic human gastric inhibitory polypeptide in patients with type2 diabetes mellitus[J]. J Clin Invest, 1993, 91(1): 301.

      [9]Baggio L L, Drucker D J. Biology of incretins: GLP1 and GIP[J]. Gastroenterology, 2007, 132(6): 2131.

      [10]張石革. 二肽基肽酶4抑制劑的臨床療效和安全性評價(jià)[J]. 中國醫(yī)院用藥評價(jià)與分析, 2013, 13(4): 301.

      [11]Gotoh H, Hagihara M, Nagatsu T, et al. Activity of dipeptidyl peptidase IV and postproline cleaving enzyme in sera from osteoporotic patients[J]. Clin Chem, 1988, 34(12): 2499.

      [12]Nagatsu T, Hino M, Fuyamada H, et al. New chromogenicsubstrates for Xprolyl dipeptidylaminopeptidase[J]. Anal Biochem, 1976, 74(2): 466.

      [13]Liu J, Cheng X, Fu L. LCMS based assay method for DPPIV inhibitor screening and substrate discovery[J]. Anal Methods, 2012, 4(6): 1797.

      [14]張海枝, 劉鵬, 李川, 等. 酶抑制劑類抗糖尿病藥物的分子水平篩選方法研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代藥物與臨床, 2014 (8): 947.

      [15]趙躍智, 蔡敏敏, 錢妍, 等. 聚集誘導(dǎo)發(fā)光體系: 化合物種類, 發(fā)光機(jī)制及其應(yīng)用[J]. 化學(xué)進(jìn)展, 2013, 25(203): 296.

      [16]Liu C, Hu M, Zhang M, et al. Association of GLP1 secretion with antihyperlipidemic effect of ginsenosides in highfat diet fed rats[J]. Metabolism, 2014, 63(10): 1342.

      [17]Kim K H, Kim K S, Shin M H, et al. Aqueous extracts of Anemarrhena asphodeloides stimulate glucagonlike pepetide1 secretion in enteroendocrine NCIH716 cells[J]. Biochip J, 2013, 7(2): 188.

      [18]Chen F, Chen Y, Kang X, et al. Antiapoptotic function and mechanism of ginseng saponins in Rattus pancreatic βcells[J]. Biol Pharm Bull, 2012, 35(9): 1568.

      [19]Han J, Yang N, Zhang F, et al. Rhizoma Anemarrhenae extract ameliorates hyperglycemia and insulin resistance via activation of AMPactivated protein kinase in diabetic rodents[J]. J Ethnopharmacol, 2015, 172: 368.

      [20]Zhang W, Zheng L, Zhang Z, et al. Protective effect of a watersoluble polysaccharide from Salvia miltiorrhiza Bunge on insulin resistance in rats[J]. Carbohydr Polym, 2012, 89(3):890.

      [責(zé)任編輯孔晶晶]

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