MicroRNAs表達(dá)與藥物代謝酶CYP2C19活性相關(guān)性研究

唐千捷，鐘詩(shī)龍，林浩銘，李夏寅，何國(guó)東，韓雅玲，王來(lái)友

(1.廣東藥科大學(xué) 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)研究部，廣東 廣州 510080； 3.孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510120； 4.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

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MicroRNAs表達(dá)與藥物代謝酶CYP2C19活性相關(guān)性研究

唐千捷1，鐘詩(shī)龍2，林浩銘3，李夏寅2，何國(guó)東2，韓雅玲4，王來(lái)友1

(1.廣東藥科大學(xué) 藥科學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.廣東省人民醫(yī)院廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)研究部，廣東 廣州 510080； 3.孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院 肝膽外科，廣東 廣州 510120； 4.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 心血管內(nèi)科，遼寧 沈陽(yáng) 110000)

摘要:目的 探討肝組織MicroRNAs (miRNA)與CYP2C19代謝酶活性的相關(guān)性。方法 通過(guò)基于LC/MS/MS的“Cocktail”探針?biāo)幬锓z測(cè)人肝S9中CYP2C19等4種代謝酶活性；運(yùn)用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件選擇5個(gè)作用于CYP2C19 mRNA的miRNA以及1個(gè)作用于CYP3A4 mRNA的miRNA作為陰性對(duì)照，并用qRT-PCR方法檢測(cè)其在肝組織中的表達(dá)水平，分析miRNA表達(dá)量與酶活性的關(guān)系。結(jié)果 在6個(gè)miRNAs中，miR-130a(r=-0.476 2，P<0.05)和miR-142(r=-0.400 8，P<0.05)在肝臟中的表達(dá)水平與CYP2C19酶活性顯著負(fù)相關(guān)。結(jié)論 miRNA的表達(dá)水平可能是影響人群中CYP2C19酶活性變化差異的重要因素之一。

關(guān)鍵詞:miRNA； CYP2C19； “Cocktail”探針?biāo)幬锓ǎ?LC/MS/MS

細(xì)胞色素P4502C19(CYP2C19)是肝臟中P450多功能氧化酶系統(tǒng)的重要成員。CYP2C19參與了10%～15%臨床藥物的代謝過(guò)程[1-2]，包括質(zhì)子泵抑制劑奧美拉唑，抗抑郁藥如氟西汀、丙咪嗪，抗癲癇藥物如安定、丙戊酸，以及抗血小板藥物氯吡格雷和抗瘧藥利福平等[3]。對(duì)人體而言，CYP2C19蛋白由CYP2C19基因編碼[4]。大量的研究表明，遺傳變異、內(nèi)源性因素和環(huán)境因素影響了CYP2C19的表達(dá)和作用功能：在427例人群研究中發(fā)現(xiàn)，CYP2C19基因遺傳變異引起的CYP2C19 mRNA表達(dá)及其蛋白活性變化存在800倍的差異[5]。到目前為止，已發(fā)現(xiàn)CYP2C19*1～CYP2C19*35突變等位基因，致使CYP2C19酶的功能降低甚至缺失[6-7]。CYP2C19基因遺傳變異不僅調(diào)控CYP2C19酶活性，而且也影響它的抑制和誘導(dǎo)，為臨床精準(zhǔn)用藥帶來(lái)了很大困難。

然而，當(dāng)前的基因多態(tài)性等遺傳變異研究還不能充分解釋CYP2C19酶活性的多態(tài)性變化，表觀遺傳學(xué)MicroRNA(miRNA)轉(zhuǎn)錄后調(diào)控提供了研究者們新的關(guān)注視角。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，miRNA能夠直接或間接地影響編碼CYP450酶相關(guān)基因的表達(dá)，從而調(diào)控酶活性[9]。Pan等[10]研究證明miR-27b能直接作用于CYP3A4 mRNA 3′-UTR來(lái)調(diào)節(jié)CYP3A4代謝酶的活性。目前關(guān)于miRNA對(duì)CYP2C19活性影響的研究尚少，僅有Yu等[12]報(bào)道的miR-29b能夠調(diào)控CYP2C19 mRNA在肝細(xì)胞株和肝組織的表達(dá)。

除了已報(bào)道的miRNA外，還可能存在其他miRNA能夠?qū)YP2C19酶活性產(chǎn)生影響。本研究通過(guò)運(yùn)用課題組已研究過(guò)的“Cocktail”探針?biāo)幬锓z測(cè)獲得肝S9中CYP2C19活性，從生物信息學(xué)角度，在人體肝臟水平探討miRNA是否可以影響CYP2C19酶活性變化。

1儀器與試藥

1.1儀器

LC-20高效液相色譜儀(日本島津公司)；API 4000 Qtrap三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、電噴霧電離源ESI(美國(guó)AB Sciex公司)；Analyst 1.4.2 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(美國(guó)AB Sciex公司)；C18XB分析柱(3 μm，150×2.1 mm，大連依利特)；Beckman GS-6R離心機(jī)、Beckman-Coulter AllegraTM64R冷凍高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman 公司)；BP110S型電子分析天平(德國(guó)Sartorius公司)；Mili Q-plus 超純水凈化系統(tǒng)(美國(guó)Billerica公司)；NanoDrop2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)；MJ Research PTC-200 PCR儀(美國(guó)MJ Research公司)；Bio-Rad CFX Connect熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2主要試劑

標(biāo)準(zhǔn)品試劑：奧美拉唑、5-羥基奧美拉唑、氯唑沙宗、6-羥基氯唑沙宗、甲苯磺丁脲、4-羥基甲苯磺丁脲、α-羥基咪達(dá)唑侖、格列齊特標(biāo)準(zhǔn)品(均為99%)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；咪達(dá)唑侖標(biāo)準(zhǔn)品(98%)購(gòu)自江蘇恩華藥業(yè)；甲醇、乙腈為色譜純，購(gòu)自德國(guó)默克公司；水為超純水；乙酸乙酯及其他化學(xué)試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

miRNA提取定量試劑：GENMED組織清洗液及勻漿液購(gòu)自美國(guó)Genmed公司；Trizol Reagent購(gòu)自美國(guó)Life公司；RNase Free Water和RNAlater儲(chǔ)存液購(gòu)自德國(guó)Qiagen公司；逆轉(zhuǎn)錄PrimeScriptRTKit購(gòu)自日本Takara公司；iTaq Universl SYBR Green supermix購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；Bulge-LoopTMmiRNA引物購(gòu)自廣州銳博公司。

2方法

2.1肝組織樣本收集

收集2012年9月至2015年5月中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院25例肝臟標(biāo)本(其中包括13例肝癌標(biāo)本)，男性為18例，所有肝組織患者年齡范圍為32～70歲，并考察性別、年齡、苯巴比妥用藥、肝癌和乙肝疾病對(duì)結(jié)果的影響。樣本搜集嚴(yán)格遵循醫(yī)學(xué)倫理原則，獲醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均獲得患者家屬知情同意。在外科手術(shù)中取患者的部分肝組織，放入預(yù)裝1.5 mL RNAlater儲(chǔ)存液的離心管中，并于-80 ℃冰箱長(zhǎng)期保存。另外剩余肝組織剪碎后用GENMED清理液A清洗3～4次，裝入凍存管中置于液氮罐中備用。

2.2制備肝S9方法

從液氮罐中取出凍存的肝組織，迅速稱質(zhì)量，移入研缽中，倒入液氮研磨成粉末，移至預(yù)冷的玻璃勻漿器中，按1∶4(W∶V)加入GENMED勻漿液B，在冰上抽提勻漿，將液體轉(zhuǎn)移至離心管中，9 000 g、4 ℃離心20 min，取上清液，在冰上分裝至預(yù)冷的凍存管中，置液氮罐中保存。運(yùn)用Braford法對(duì)肝S9蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)。

2.3酶活性檢測(cè)孵育體系及樣品前處理(“Cocktail”探針?biāo)幬锓?

取人肝S9組分適量(1 mg/mL)，0.4 mol/L MgCl22 μL，1.65 mol/L KCl 2 μL，250 mg/mL 6-磷酸葡萄糖單鈉鹽(G-6-PNa)1.2 μL，100 mg/mL NADP 6 μL，100 U/mL 6-磷酸葡萄糖脫氫酶(G-6-PDH)2 μL，磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)100 μL，混合探針底物適量(氯唑沙宗/奧美拉唑/甲苯磺丁脲/咪達(dá)唑侖終質(zhì)量濃度均為50 ng/mL)，去離子水補(bǔ)足至200 μL。

孵育一定時(shí)間后加入1 000 μL乙酸乙酯終止反應(yīng)，再加入200 ng/mL格列齊特內(nèi)標(biāo)工作液10 μL，漩渦震蕩3 min，靜置10 min，在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，吸取上層有機(jī)相至另一離心管中，在真空干燥器中揮干。殘?jiān)?0%甲醇(V∶V)100μL復(fù)溶，渦旋1min，在4 ℃下12 000r/min離心5min，取上清加入96孔板，進(jìn)樣3μL。本實(shí)驗(yàn)對(duì)專屬性、準(zhǔn)確度、精密度、回收率、穩(wěn)定性和基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察。

2.4色譜和質(zhì)譜條件

色譜條件：正離子和負(fù)離子流動(dòng)相均為乙腈∶水(含0.1%甲酸)(80∶20，V∶V)，流速為0.25 mL/min，柱溫為20 ℃。分析時(shí)間均為5 min。質(zhì)譜條件：離子源為電噴霧電離源(ESI+或ESI-)；電噴霧電壓正離子模式為5 500 V，負(fù)離子模式為4 500 V；加熱毛細(xì)管溫度為450 ℃；鞘氣(N2)壓力為15 psi，輔助氣(N2)壓力為1 psi，碰撞氣(N2)壓力為1.0 mTorr；掃描峰寬為0.7 Th；掃描時(shí)間為200 ms，掃描方式為多反應(yīng)檢測(cè)掃描(MRM)。

2.5miRNA的預(yù)測(cè)和選擇

運(yùn)用TargetScan、miRanda、miRBase和RNA22計(jì)算機(jī)軟件庫(kù)預(yù)測(cè)到了具有潛在的靶向作用于CYP2C19的miRNA，并選擇hsa-miR-130a-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-206、hsa-371b-5p、hsa-miR-491-3p這5個(gè)miRNA作進(jìn)一步研究，同時(shí)選擇了靶向作用于CYP3A4 mRNA的miR-27b作為陰性對(duì)照。

2.6組織miRNA提取及定量方法

從RNAlater中取出1/3綠豆大小肝組織并經(jīng)液氮研磨后，用Trizol-氯仿法(5∶1)萃取上清，并加入等體積異丙醇，離心后用75%(φ)乙醇漂洗2次，晾干EP管，并用25 μL RNase free Water溶解即得。取2 μL RNA樣品進(jìn)行NanoDrop2000檢測(cè)，記錄濃度與A260/280。采用stem-loop qRT-PCR方法檢測(cè)miRNA表達(dá)水平，以sh RNA U6為內(nèi)參基因標(biāo)準(zhǔn)化不同組織樣品量差異。逆轉(zhuǎn)錄體系按照Takara RR037試劑盒說(shuō)明書，使用RNA 模版1 μg，于MJ Research PCR(PTC-200)儀上完成，程序?yàn)?2 ℃ 60 min，79 ℃ 10 min，4 ℃保存。熒光定量PCR體系為10 μL，其中iTaq Universl SYBR Green supermix 5 μL，F(xiàn)orward/Reverse Prime(5 μmol/L)各1 μL，cDNA1 μL，RNase Free Water 2 μL。Bio-Rad PCR儀反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s 40個(gè)循環(huán)，以及溶解曲線。miRNA相對(duì)表達(dá)量=2-△Ct，△Ct=Ct目的基因-CtU6。

2.7統(tǒng)計(jì)分析

應(yīng)用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Shapiro-Wilk normality test分析樣本數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)性分布，用多重線性回歸分析臨床基線資料與miR-130a、miR-142和CYP2C19活性的影響關(guān)系，運(yùn)用Sperman correlation分析變量之間是否具有相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

3.125例肝組織樣本臨床基線資料

表1顯示了25例肝組織病例臨床基線資料。多重線性回歸分析結(jié)果說(shuō)明，病例性別與年齡的變化與肝組織miR-130a、miR-142的表達(dá)水平?jīng)]有相關(guān)性(P>0.05)。服用巴比妥類藥物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有顯著影響(P>0.05)。另外，肝癌和乙肝疾病對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也無(wú)直接影響(P>0.05)。

3.2液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)酶活性結(jié)果

針對(duì)CYP2C19酶活性檢測(cè)，以反應(yīng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，以探針底物奧美拉唑的代謝產(chǎn)物5-羥基奧美拉唑濃度為縱坐標(biāo)，繪制反應(yīng)曲線，見圖1。奧美拉唑反應(yīng)速度由快減慢，5-羥基奧美拉唑生成量在0～120 min呈線性平穩(wěn)上升，之后反應(yīng)速率趨于穩(wěn)定。25例肝組織樣品間CYP2C19酶活性從0.46～16.2(nmol·min-1·mg-1)變化差異較大，其頻率分布直方圖見圖2。

表125例肝組織患者臨床基線資料以及其對(duì)miR-130a、miR-142表達(dá)和CYP2C19活性的影響

Table 1Relationship between general characteristics and miR-130a and miR-142 expression and CYP2C19 activity in 25 liver tissues

基本特征n(%)或x±smiR-130a表達(dá)BPmiR-142表達(dá)BPCYP2C19活性BP性別(男)18(72.0)-6.3460.81845.2060.3440.0050.869年齡50.68±10.3726.3970.085544.6490.619-0.0660.920使用苯巴比妥類藥物19(82.6)0.0660.99819.9030.636-0.0010.998肝癌13(52.0)-42.5670.15214.6570.769-0.0190.528乙肝11(78.6)10.6210.75912.3030.8820.0110.735

98765432102004006008000t/minBA76543210100150500ρ/(ng?mL-1)ρ/(ng?mL-1)

A. 0～720 min； B. 0～120 min。

圖15-羥基奧美拉唑的反應(yīng)曲線

Figure 1Response curve of 5-hydroxyomeprazole (n=5)

3.3miRNA表達(dá)與CYP2C19活性關(guān)系

所選的6個(gè)miRNAs都處于可檢測(cè)水平，但是miR-371、miR-206和miR-491的表達(dá)水平均低于其他miRNAs(見圖3)。在這6個(gè)miRNAs中，miR-130a和miR-142的表達(dá)水平與CYP2C19酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(miR-130a:r=-0.476 2，P<0.05，95%CI=-0.739 0～-0.087 45；miR-142:r=-0.400 8，P<0.05，95%CI=-0.693 6～0.005 761)。但是，miR-491、miR-206和miR-371的表達(dá)與CYP2C19酶活性關(guān)系相對(duì)穩(wěn)定，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陰性對(duì)照miR-27b在肝臟中表達(dá)量與CYP2C19酶活性關(guān)系相對(duì)穩(wěn)定，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

86420頻數(shù)101214161802468CYP2C19活性/(nmol?min-1?mg-1)

圖2CYP2C19酶活性頻數(shù)分布圖(n=25)

Figure 2Frequency distribution of CYP2C19 enzyme activity

20-2-4-6-8miRNA相對(duì)表達(dá)量miR-27b130a142371491206

圖3所選相關(guān)miRNAs在肝組織中的表達(dá)水平(n=25)

Figure 3Expression of selected relative miRNAs in human liver tissues

miRNA相對(duì)表達(dá)量2.01.51.00.50?10-42.01.51.00.50?10-5miRNA相對(duì)表達(dá)量4.03.02.01.00?10-50.150.100.050.00miR-142miR-491miR-27bmiR-371miR-206miR-130ar=-0.3138P>0.05r=-0.4762P<0.05r=-0.4008P<0.05r=-0.2223P>0.05r=-0.3423P>0.05r=-0.2223P>0.052.52.01.51.00.50?10-22.01.51.00.50?10-2CYP2C19酶活性05101520CYP2C19酶活性05101520CYP2C19酶活性05101520

圖4miRNA與CYP2C19酶活性的相關(guān)性分析結(jié)果

Figure 4Correlation between miRNA expression and CYP2C19 enzyme activity (n=25)

4討論

細(xì)胞色素P450是人體內(nèi)最重要藥物代謝酶系，目前關(guān)于miRNA與P450酶作用的相關(guān)分析尚不充分。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)并選擇檢測(cè)靶向作用于CYP2C19基因的miRNA，是首次在中國(guó)人群中進(jìn)行miRNA與肝藥酶CYP2C19活性的相關(guān)研究。

對(duì)25例肝組織樣本的臨床基線資料統(tǒng)計(jì)分析，說(shuō)明了本研究納入的病例患者年齡、性別、苯巴比妥用藥、肝癌和乙肝疾病因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均無(wú)影響。肝組織體外代謝奧美拉唑的產(chǎn)物5-羥基奧美拉唑反應(yīng)曲線顯示，在0～120 min孵育時(shí)間內(nèi)，60 min時(shí)反應(yīng)速率最快，因此體外孵育的最佳反應(yīng)時(shí)間為60 min。所有肝組織CYP2C19酶活性變化存在35倍差異，頻數(shù)分布較分散，反映了肝組織病例間CYP2C19代謝酶活性個(gè)體差異較大。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miR-130a和miR-142與CYP2C19酶活性呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示了miRNA可能是影響CYP2C19酶活性差異的重要因素之一。TargetScan數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)顯示，miR-130a和miR-142能分別與CYP2C19 mRNA 3′-UTR(ENST00000371321.3)2371-2377和2555-2561位點(diǎn)的種子序列結(jié)合，可能通過(guò)引起mRNA切割或翻譯抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后水平干擾CYP2C19靶基因的蛋白質(zhì)，對(duì)CYP2C19酶活性起到負(fù)調(diào)節(jié)作用。而且，有研究稱miR-130b可能抑制CYP2C19蛋白的表達(dá)，而miR-130a與miR-130b屬于同家族miRNA，具有高度的同源性，可能對(duì)它們的靶基因和蛋白具有共同的抑制作用[13]。

另外，miR-371、miR-206和miR-491與CYP2C19酶活性無(wú)顯著相關(guān)性，可能是由于它們?cè)诟闻K的表達(dá)水平均遠(yuǎn)低于其他miRNA，對(duì)CYP2C19酶活性產(chǎn)生的抑制作用較弱，因此與其活性的相關(guān)性低。而作為陰性對(duì)照的靶向作用于CYP3A4 mRNA的miR-27b的表達(dá)與CYP2C19酶活性無(wú)顯著相關(guān)性，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效可靠。但本研究仍然存在一定的局限性，今后的實(shí)驗(yàn)應(yīng)該收集納入更多的樣本，并進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA對(duì)CYP2C19基因和蛋白表達(dá)的作用機(jī)制。

綜上所述，在人體肝組織中的miR-130a、miR-142與CYP2C19代謝酶活性具有負(fù)相關(guān)作用，miRNA的表達(dá)水平可能是影響人群中CYP2C19酶活性變化差異的重要因素之一。

明確CYP2C19代謝酶的遺傳缺失因素，將有利于臨床上個(gè)體化用藥，減少藥物不良反應(yīng)，預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物的反應(yīng)性，從而提供最安全有效的精準(zhǔn)藥物治療。

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(責(zé)任編輯：幸建華)

Relationship between microRNAs expression and drug metabolism enzyme CYP2C19 activity

TANG Qianjie1,ZHONG Shilong2,LIN Haoming3,LI Xiayin2,HE Guodong2,HAN Yaling4,WANG Laiyou1(1.SchoolofPharmacy,GuangdongPharmaceuticalUniversity;GuangdongMetabolicDiseasesResearchCenterofIntegratedChineseandWesternMedicine,Guangzhou510006,China; 2.MedicalResearchCenterofGuangdongGeneralHospital,GuangdongAcademyofMedicalSciences,Guangzhou510080,China; 3.DepartmentofHepatobiliarySurgery,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China; 4.CardiovascularMedicineofGeneralHospitalofShenyangMilitaryRegion,Shenyang110000,China)

Abstract:Objective To investigate the correlation between miRNAs expression and cytochrome CYP2C19 enzyme activity in liver tissues. Methods The activities of four metabolic enzymes in liver S9 fraction including CYP2C19 were determined by cocktail drug probe approach based on LC/MS/MS. Five potential miRNAs targeting CYP2C19 mRNA and one negative miRNA targeting CYP3A4 mRNA were chosen by bioinformatics software. The levels of these miRNAs in liver were determined by qRT-PCR. The relevance between miRNAs expression and metabolic enzyme activities was analyzed. Results Among the six miRNAs,miR-130a (r=-0.476 2,P<0.05) and miR-142 (r=-0.400 8,P<0.05) levels were negatively associated with the activity of CYP2C19. Conclusion miRNAs could be one of key factors that influence CYP2C19 activity in populations.

Key words:miRNA; CYP2C19; “cocktail” approach; LC/MC/MC

DOI:10.16809/j.cnki.1006-8783.2015112602

中圖分類號(hào):Q554

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

文章編號(hào):1006-8783(2016)02-0243-07

作者簡(jiǎn)介：唐千捷(1991—)，女，2013級(jí)碩士研究生；通信作者：王來(lái)友，男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師，主要從事藥物代謝動(dòng)力學(xué)與代謝性疾病藥物研究，Email: wanglaiyou@gdpu.edu.cn。

基金項(xiàng)目：“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAI11B07)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81373486)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B021800157)；廣州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201510010236)；廣東省教育廳特色創(chuàng)新項(xiàng)目(自然科學(xué)類)(2105KTSCX073)

收稿日期：2015-11-26

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-03-29 10:16網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/44.1413.R.20160329.1016.002.html