斑馬魚抗podocin抗體的制備、鑒定及在足細(xì)胞損傷模型中的應(yīng)用

汪 玲 侯 慶 朱小東 秦衛(wèi)松 曾彩虹 陳朝紅 劉志紅

斑馬魚抗podocin抗體的制備、鑒定及在足細(xì)胞損傷模型中的應(yīng)用

汪 玲 侯 慶 朱小東 秦衛(wèi)松 曾彩虹 陳朝紅 劉志紅

目的：利用合成的podocin多肽制備針對(duì)斑馬魚podocin的多克隆抗體，鑒定其特異性，并應(yīng)用于斑馬魚足細(xì)胞損傷研究中。 方法：(1)設(shè)計(jì)、合成斑馬魚podocin抗原多肽，將合成后的多肽與鑰孔血藍(lán)蛋白(KLH)偶聯(lián)，免疫新西蘭大白兔制備抗血清，protein A親和純化得到抗podocin多克隆抗體；(2)ELISA和免疫組化檢測(cè)抗體效價(jià)及組織特異性；(3)構(gòu)建足細(xì)胞特異性表達(dá)硝基還原酶(NTR)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mCherry)，NTR/MTZ(甲硝唑)系統(tǒng)特異性地誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷；用podocin反義寡核苷酸阻斷正常斑馬魚胚胎podocin mRNA的翻譯過(guò)程，利用抗podocin抗體對(duì)上述兩種疾病模型進(jìn)行免疫熒光染色以驗(yàn)證合成的podocin抗體能否應(yīng)用于斑馬魚足細(xì)胞研究中。 結(jié)果：(1)化學(xué)合成的多肽純度為92.6%，達(dá)到免疫用抗原標(biāo)準(zhǔn)；(2)ELISA和免疫組化染色結(jié)果表明抗體效價(jià)分別達(dá)1∶ 5.12×105和 1∶ 106；(3)免疫熒光染色表明無(wú)論在斑馬魚前腎還是中腎，podocin均特異性地表達(dá)于足細(xì)胞，且沿著毛細(xì)血管袢呈連續(xù)、線性分布，表明抗體具有良好的組織特異性；(4)MTZ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷24h后見(jiàn)podocin呈粗糙的顆粒狀分布，48h后陽(yáng)性表達(dá)面積占整個(gè)腎小球面積比值明顯下降；(5)顯微注射podocin反義寡核苷酸的斑馬魚胚胎出現(xiàn)心包水腫、體軸彎曲的表型，第3天時(shí)幾乎無(wú)Podocin表達(dá)，隨后逐漸恢復(fù)至正常，第5天時(shí)表達(dá)與正常組無(wú)異。 結(jié)論：所制備的斑馬魚抗podocin抗體效價(jià)高、組織特異性強(qiáng)，能夠反應(yīng)足細(xì)胞損傷情況，是斑馬魚足細(xì)胞研究的有力工具。

斑馬魚 podocin 足細(xì)胞

近年來(lái)，模式動(dòng)物斑馬魚已廣泛應(yīng)用于足細(xì)胞相關(guān)疾病的研究[1]。但目前尚缺乏足細(xì)胞特異性的抗體，僅從尿蛋白水平反應(yīng)足細(xì)胞損傷程度。制備斑馬魚足細(xì)胞特異性的高效價(jià)的抗體是利用斑馬魚平臺(tái)研究足細(xì)胞疾病相關(guān)基因功能的首要前提。podocin是腎小球足細(xì)胞列孔隔膜復(fù)合體的重要組成部分，其編碼基因?yàn)镹PHS2,NPHS2突變可導(dǎo)致常染色體隱性激素抵抗型腎病綜合癥[2]。研究顯示，podocin表達(dá)改變可反應(yīng)足細(xì)胞損傷情況[3]。Agrawal等[4]發(fā)現(xiàn)在微小病變及原發(fā)性局灶節(jié)段硬化腎病綜合癥的患者腎組織內(nèi)podocin的表達(dá)明顯減少，且與蛋白尿程度相關(guān)。在嘌呤霉素誘導(dǎo)大鼠足細(xì)胞損傷模型中，podocin的表達(dá)也明顯下降，同時(shí)伴廣泛的足突融合[5]。

斑馬魚前腎足細(xì)胞在36hpf(hours post fertilization)即可檢測(cè)到podocin的表達(dá)[6]，其功能與哺乳動(dòng)物具有高度保守性[7]。本研究制備抗斑馬魚podocin抗體，利用免疫熒光等技術(shù)驗(yàn)證其特異性。此外，利用該抗體觀察斑馬魚足細(xì)胞損傷模型中podocin的變化情況，分析podocin表達(dá)改變與足細(xì)胞損傷的相關(guān)性。

材料和方法

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 野生型斑馬魚(AB品系)、轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(pod:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)，飼養(yǎng)溫度28.5℃，14h/10h交替照明。斑馬魚胚胎在28.5℃培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)[8]。

主要試劑 免疫組化EnVision試劑盒(英國(guó)Novocastra)、Alexa Fluor488驢抗兔IgG(H+L)(美國(guó)invitrogen)、甲硝唑(美國(guó)Sigma)、podocin ATG反義寡核苷酸(美國(guó)Gene Tools)。

實(shí)驗(yàn)方法

多肽抗原的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的zebrafish podocin氨基酸序列信息，綜合考慮親疏水性、抗原性、結(jié)合位點(diǎn)及氨基酸的帶點(diǎn)性等理化性質(zhì)，利用Mac Vestor軟件確定要合成的多肽序列為CDGSDDGTKDSPM。將此序列交由南京金斯瑞公司合成。

多克隆抗體的制備和純化 用EDC法連接半抗原與載體蛋白(mcKLH)，鹽脫柱脫鹽，純化載體蛋白-多肽連接物，將連接好的半抗原-載體蛋白混合物與等體積的佐劑混合，采用常規(guī)微量多次免疫法免疫清潔級(jí)新西蘭大白兔(抗原100 μg/只)，第一次免疫使用完全福氏佐劑，并于4周后進(jìn)行第二次免疫(第2次及以后使用不完全福氏佐劑)，以后每?jī)芍苊庖咭淮?，于?次免疫后1周直視下心臟采血收集血清?？寡褰?jīng)蛋白A純化得到抗podocin純化抗體。

間接ELISA檢測(cè)抗血清效價(jià) 4 μg/ml podocin多肽包被96孔板，100 μl/孔4℃過(guò)夜；以30 g/L BSA-PBS 300 μl/孔，37℃封閉1h；PBS稀釋抗血清，依次從1∶ 103到1∶ 5.12×105，50 μl/孔，37℃孵育1h；免疫前兔血清同樣稀釋作為陰性對(duì)照.HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體(1∶ 104)，100 μl/孔，37℃孵育1h，TMB顯色系統(tǒng)顯色，酶標(biāo)儀450 nm處讀取A值。計(jì)算待測(cè)樣本(S)與空白對(duì)照(B)A值得比值S/B>=2.1 (D450 nm)判為陽(yáng)性結(jié)果。

轉(zhuǎn)基因斑馬魚質(zhì)粒 podocin啟動(dòng)子序列通過(guò)PCR從斑馬魚基因組中擴(kuò)增所得，Gal4從質(zhì)粒pGMGal4-Lu擴(kuò)增。用podocin啟動(dòng)子替換pTol2-lysC:EGFP質(zhì)粒(國(guó)家斑馬魚資源中心)lysC序列，構(gòu)成pTol2-pod:EGFP。用Gal4序列替換pTol2-pod:EGFP中EGFP序列，構(gòu)成pTol2-pod:Gal4，序列經(jīng)測(cè)序鑒定。UAS:NTR-mCherry轉(zhuǎn)基因魚質(zhì)粒由密西根大學(xué)Weibin Zhou惠贈(zèng)。

顯微注射 Tol2轉(zhuǎn)座酶mRNA體外轉(zhuǎn)錄模板是用限制性內(nèi)切酶XbaI將pT3TS-Tol2(Pdb600)線性化，體外轉(zhuǎn)錄成轉(zhuǎn)座酶mRNA，回收體外轉(zhuǎn)錄的mRNA。將轉(zhuǎn)座酶mRNA(25 ng/ul)和轉(zhuǎn)基因魚表達(dá)質(zhì)粒(20 ng/ul)共同顯微注射入野生型AB斑馬魚胚胎單細(xì)胞。0.5 nmol podocin ATG MO注射入1～4細(xì)胞期的胚胎中。

MTZ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷 將Tg(pod:Gal4)與Tg(UAS:NTR-mCherry)雜交，3dpf于熒光顯微鏡下篩選出足細(xì)胞紅色熒光陽(yáng)性的胚胎用于實(shí)驗(yàn)，野生型胚胎作為對(duì)照組。用100 μmol/L MTZ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷。

免疫組化染色 石蠟包埋、切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇入水，經(jīng)微波修復(fù)10 min，10%小牛血清室溫封閉10 min，一抗室溫孵育2h，二抗室溫孵育30min，DAB-H202顯色，蘇木素復(fù)染，封片。

全包埋免疫熒光染色及定量 80%甲醇+20%DMSO 固定，梯度甲醇入水，PBSTx(PBS+0.5% Triton X-100)洗滌，含10%山羊血清和1%DMSO的PBSTx室溫封閉2h，一抗(podocin 1∶ 100 000)4℃孵育過(guò)夜，二抗Alexa Fluor488/633驢抗兔IgG(美國(guó)invitrogen)室溫孵育2h，甘油封片。共聚焦顯微鏡(Carl Zeiss，German)Z軸掃描、拍照。所有掃描參數(shù)及曝光時(shí)間設(shè)置相同。每組隨機(jī)選取5～10個(gè)腎小球，用共聚焦軟件生成最大密度投影[9](Maximum intensity projection，1 000X)，應(yīng)用Image-Pro-Plus6.0 計(jì)算podocin表達(dá)平均熒光強(qiáng)度和陽(yáng)性面積比，以各組的均值進(jìn)行比較[10]。

電鏡檢查 3.75%戊二醛固定，2%鋨酸固定，丙酮脫水、浸透，包埋、切片，染色，Hitachi 7500透射電鏡觀察。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

podocin多肽抗原的設(shè)計(jì)與合成 斑馬魚podocin開(kāi)放閱讀框由1 173個(gè)堿基組成，編碼391個(gè)氨基酸，分子量約為43 kD，與人的podocin大小相近(42 kD)。斑馬魚podocin氨基酸序列與人、大鼠和小鼠的一致性分別為45.1%、44.9%和45.4%(圖1)。本研究化學(xué)合成的多肽為C端序列CDGSDDGTKDSPM，共包含13個(gè)氨基酸?？傎|(zhì)量為15 mg，經(jīng)質(zhì)譜分析，相對(duì)分子質(zhì)量為1 327.36，合成后經(jīng)高效液相色譜純化后純度為92.6%，達(dá)到免疫用抗原標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 斑馬魚、人、大鼠和小鼠podocin 氨基酸比對(duì)結(jié)果A:黑色標(biāo)記斑馬魚、人、大鼠和小鼠之間podocin的保守氨基酸序列；B：斑馬魚與人、大鼠和小鼠之間podocin的同源性比較

ELISA和免疫組織化學(xué)檢測(cè)抗血清效價(jià) 以S/B >=2.1所對(duì)應(yīng)的最大稀釋倍數(shù)為陽(yáng)性血清的抗體效價(jià)，檢測(cè)結(jié)果表明抗體效價(jià)達(dá)到1∶ 5.12×105(表1)。免疫組織化學(xué)染色將抗體分別稀釋2 000、5 000、104、105和106倍后發(fā)現(xiàn)抗體在1∶ 106時(shí)其背景最弱，腎小球特異性染色信號(hào)最強(qiáng)(圖2A)。

表1 ELISA法檢測(cè)免疫前血清和純化抗體

起始稀釋度1∶ 1 000(相當(dāng)于1 μg/ml) ；效價(jià)以信號(hào)/空白≥2.1所對(duì)應(yīng)的最大稀釋位數(shù)表示

圖2 斑馬魚中腎腎小球podocin的表達(dá)分布A：成魚免疫組化染色，(A1～A5)抗體稀釋度分別為1∶ 2 000、1∶ 5 000、1∶ 104、1∶ 105和1∶ 106(IH,A1～4:×600；A5：×1 000)；B:Tg(pod:GFP)pococin表達(dá)分布(IF,×1 000)

正常斑馬魚中腎腎小球podocin的表達(dá)分布 成魚腎組織石蠟切片免疫組化染色示podocin在腎小球表達(dá)強(qiáng)陽(yáng)性，而腎小管及間質(zhì)表達(dá)陰性(圖2A5)。轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(pod:EGFP)的podocin啟動(dòng)子能驅(qū)動(dòng)足細(xì)胞特異性地表達(dá)GFP蛋白，使其足細(xì)胞胞體和足突被標(biāo)記為綠色。為進(jìn)一步探究podocin在斑馬魚腎小球中的分布，我們顯微鏡下分離出Tg(pod:EGFP)成魚腎臟行免疫熒光染色，發(fā)現(xiàn)podocin沿腎小球毛細(xì)血管袢呈連續(xù)線性分布，與EGFP足突重合，胞體不重合(圖2B)。

正常斑馬魚前腎腎小球podocin的表達(dá)分布 為探究斑馬魚幼魚腎組織中podocin的表達(dá)情況，我們將轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(pod:Gal4)和Tg(UAS:NTR-mCherry)雜交，3dpf時(shí)挑選出足細(xì)胞表達(dá)紅色熒光的幼魚， 4dpf時(shí)進(jìn)行全包埋免疫熒光染色，結(jié)果顯示斑馬魚前腎中podocin表達(dá)與中腎一樣，沿著毛細(xì)血管袢呈連續(xù)線性分布(圖3)。

圖3 斑馬魚前腎腎小球組織中podocin的表達(dá)分布(IF,×1 000)

MTZ誘導(dǎo)斑馬魚足細(xì)胞損傷后podocin的表達(dá)變化 為動(dòng)態(tài)地觀察足細(xì)胞損傷過(guò)程中podocin的表達(dá)變化，本研究構(gòu)建足細(xì)胞上特異性表達(dá)硝基還原酶(NTR)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(pod:Gal4;UAS:NTR-mCherry)，并利用NTR/MTZ(甲硝唑)系統(tǒng)誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷[14]。以野生型斑馬魚為對(duì)照組。經(jīng)MTZ處理48h后可見(jiàn)胚胎眼周、心包及卵黃囊出現(xiàn)水腫(圖4A2)，對(duì)照組無(wú)明顯改變(圖4A1)。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，經(jīng)MTZ處理24h后，podocin表達(dá)呈非連續(xù)、顆粒狀(圖4B2)，半定量結(jié)果顯示單位陽(yáng)性染色區(qū)域內(nèi)平均熒光強(qiáng)度及陽(yáng)性面積率無(wú)明顯改變(圖4C)。然而當(dāng)處理48h后， podocin表達(dá)明顯減少，其陽(yáng)性面積率較對(duì)照組明顯降低(圖4B3、4C)。

圖4 MTZ誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷后水腫及podocin表達(dá)變化A:MT2處理48h后出現(xiàn)水腫(箭頭示眼球和卵黃囊水腫)；B：MTZ處理24h和48h后podocin表達(dá)分布；C免疫熒光半定量示結(jié)果；**P<0.01

圖5 podocin morpholino顯微注射入斑馬魚胚胎后對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響及podocin表達(dá)改變過(guò)程PO：足細(xì)胞；EN：內(nèi)皮細(xì)胞；A:(A1～5)顯微注射 MO1、2、3、5和7d后斑馬魚胚胎表型改變，(A6～10)對(duì)應(yīng)天數(shù)的正常野生型斑馬魚胚胎，箭頭指示卵黃囊和心包水腫；B:低倍鏡下顯微注射podocin MO后3、4、5和7d后podocin蛋白表達(dá)情況(IF,×300)；C:高倍鏡下podocin MO組(C1～4)和正常野生型(C5～8)斑馬魚3、4、5和7dpf podocin表達(dá)情況(IF,×1 000)；D:podocin MO組(D1～4)和正常野生型(D5～8)斑馬魚3、4、5和7dpf濾過(guò)屏障超微結(jié)構(gòu) (EM,×30 000)

MO podocin表達(dá)的影響 本研究設(shè)計(jì)了兩條針對(duì)podocin mRNA翻譯起始位點(diǎn)的反義寡核苷酸，下調(diào)podocin基因的表達(dá)，觀察表型的改變，并利用合成的抗體進(jìn)行了免疫熒光染色,同時(shí)用透射電鏡觀察超微結(jié)構(gòu)改變。顯微注射MO 1d后其生長(zhǎng)發(fā)育明顯遲于正常野生型斑馬魚，胚胎尚未脫殼，且出現(xiàn)卵黃囊水腫(圖5A1中箭頭)、體軸彎曲等表型，部分胚胎畸形、死亡。2天后水腫達(dá)到最高峰且心包開(kāi)始水腫(圖5A2中箭頭)，持續(xù)至第5天。隨后表型開(kāi)始消退，水腫和體軸彎曲的程度較前明顯減輕，至第7天時(shí)基本恢復(fù)(圖5A4、A5)。podocin免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)注射MO 3d后podocin表達(dá)陰性(圖5B1、C1)，而第4天時(shí)podocin表達(dá)開(kāi)始逐漸恢復(fù)，但熒光強(qiáng)度仍低于野生型(圖5B2、C2)。至第5d時(shí)，podocin分布形態(tài)和強(qiáng)度與對(duì)照組已無(wú)明顯差別(圖5B3、C3)。超微結(jié)構(gòu)顯示注射podocin MO 3天后可見(jiàn)發(fā)育正常的內(nèi)皮細(xì)胞和足細(xì)胞，但無(wú)明顯的基底膜和足突形成(圖5D1)，而正常野生型的斑馬魚在發(fā)育至第3d可見(jiàn)足突可基膜已發(fā)育相對(duì)成熟(圖5D5)，表明podocin MO胚胎發(fā)育相對(duì)延遲。Podocin MO 4d后足突和基膜形成，但足突融合(圖5D2),正常對(duì)照組4d可見(jiàn)典型的濾過(guò)屏障結(jié)構(gòu)(圖5D6)。podocin MO 5d 和7d可見(jiàn)足突結(jié)構(gòu)已逐漸恢復(fù)正常(圖5D3、D4)

討 論

為研究足細(xì)胞的功能，近年來(lái)，斑馬魚以其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)越來(lái)越受人們的青睞。Zhou等[11]構(gòu)建了腎臟足細(xì)胞特異性表達(dá)硝基還原酶(NTR)的轉(zhuǎn)基因斑馬魚,并利用甲硝唑(MTZ)成功地誘導(dǎo)出了斑馬魚足細(xì)胞損傷模型。此外，l-fabp:VDBP-EGFP和pod：NTR-mCherry雙轉(zhuǎn)基因斑馬魚可用于檢測(cè)蛋白尿[11]。然而，由于缺乏特異性的斑馬魚足細(xì)胞相關(guān)抗體，目前的研究方法僅局限于原位雜交和RT-PCR技術(shù)，如何在蛋白水平上評(píng)估足細(xì)胞損傷是我們迫切需要解決的問(wèn)題。

podocin是足細(xì)胞裂孔隔膜相關(guān)蛋白的重要組成部分，其編碼基因?yàn)镹PHS2。當(dāng)NPHS2基因突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致家族性激素抵抗型腎病綜合癥[12]。Nphs2-/-小鼠會(huì)出現(xiàn)蛋白尿，電鏡下可見(jiàn)廣泛足細(xì)胞足突融合和SD的缺乏[13]。嘌呤霉素腎病大鼠足細(xì)胞podocin分布不連續(xù)且表達(dá)強(qiáng)度顯著下降[10]。同樣，當(dāng)阻斷斑馬魚podocin表達(dá)時(shí)會(huì)引起足突的破壞、SD的缺乏、大分子物質(zhì)的漏出及致命的水腫[6]。以上研究表明podocin是SD蛋白復(fù)合體的重要組成部分，在維持腎小球?yàn)V過(guò)功能上具有重要作用，且物種間具有高度保守性。本研究正是考慮podocin蛋白的重要功能，從而選擇合成該抗原多肽以制備抗斑馬魚足細(xì)胞特異性的多克隆抗體，為今后利用斑馬魚模型研究足細(xì)胞疾病提供蛋白標(biāo)記物。

本研究合成的抗原多肽位于podocin氨基酸序列C端的胞外區(qū)，多克隆抗體純度高，達(dá)到92.6%，效價(jià)高達(dá)1∶ 512 000。在驗(yàn)證抗體組織特異性方面，我們利用轉(zhuǎn)基因斑馬魚腎臟足細(xì)胞自帶熒光的特點(diǎn)，進(jìn)行podocin熒光染色。其主要優(yōu)勢(shì)包括：(1)我們能借助熒光顯微鏡快速地定位、分離腎小球；(2)在缺乏斑馬魚足細(xì)胞特異性標(biāo)記抗體的情況下，這起到了雙色免疫熒光套染的作用，可以通過(guò)觀察兩者的重疊度，判斷抗體的組織特異性及分布形態(tài)。目前，對(duì)于斑馬魚腎臟的研究多集中在前腎，而本研究制備的抗podocin抗體在前腎和中腎足細(xì)胞中均具有良好的組織特異性，podocin在斑馬魚足細(xì)胞的分布與哺乳動(dòng)物相似，均沿毛細(xì)血管袢呈連續(xù)線性分布，進(jìn)一步在形態(tài)學(xué)上證明斑馬魚與哺乳動(dòng)物腎臟具有高度保守性。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，隨著MTZ誘導(dǎo)的時(shí)間延長(zhǎng)，轉(zhuǎn)基因斑馬魚Tg(podocin:GFP)腎臟組織中GFP熒光強(qiáng)度逐漸下降[14]。本研究首次從蛋白水平上觀察MTZ處理后其足細(xì)胞特異性標(biāo)志物podocin表達(dá)、分布變化。我們發(fā)現(xiàn)，MTZ誘導(dǎo)后podocin最先發(fā)生的是分布形狀的改變，隨后蛋白表達(dá)明顯降低。這提示足細(xì)胞損傷后可能首先出現(xiàn)podocin表達(dá)位置的改變，隨著損傷的持續(xù)，其podocin表達(dá)缺失。免疫電鏡也發(fā)現(xiàn)在PAN腎病大鼠中podocin可能以囊泡的形式從SD轉(zhuǎn)移到足細(xì)胞胞體[15]。我們觀察到誘導(dǎo)48h后水腫才開(kāi)始出現(xiàn)，而此時(shí)podocin表達(dá)已經(jīng)下降，這表明以podocin為代表的SD相關(guān)蛋白的分布改變及表達(dá)減少是導(dǎo)致蛋白尿的始動(dòng)因素。

morpholinos是目前斑馬魚研究中應(yīng)用較為廣泛的一項(xiàng)基因沉默技術(shù)，然而適用于斑馬魚的抗體很有限，MOs對(duì)靶基因的下調(diào)作用很難在蛋白水平得到評(píng)估，并且經(jīng)顯微注射的MOs會(huì)隨著胚胎的生長(zhǎng)發(fā)育而逐漸被稀釋。本研究顯微注射podocin MO 3d后，podocin不表達(dá)，進(jìn)一步證明所制備的抗體是特異性針對(duì)于podocin抗原的。該抗體不僅能正確反應(yīng)podocin morpholino后其蛋白表達(dá)狀態(tài)，還能檢測(cè)其時(shí)效性。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn)podocin MO的作用可持續(xù)1～4d，至第5天時(shí)podocin的表達(dá)基本恢復(fù)正常，這與Fukuyo等[7]的研究結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究成功地制備了抗斑馬魚podocin抗體，抗體純度高、效價(jià)強(qiáng)、特異性好，并且能成功地應(yīng)用于疾病模型中，準(zhǔn)確地反映了病理過(guò)程，為今后的斑馬魚足細(xì)胞相關(guān)研究提供了良好的蛋白標(biāo)記物。

1 Boucher RC，Zhou W.Zebrafish Models of Podocytopathies//ZH Liu,JC He.Podocytopathy.Contrib Nephrol.Basel:Karger,2014,224-234.

2 Boute N,Gribouval O,Roselli S,et al.NPHS2,encoding the glomerular protein podocin,is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephrotic syndrome.Nat Genet,2000,24(4):349-354.

3 Ding WY,Saleem MA.Podocyte injury in FSGS//ZH Liu,JC He.Podocytopathy.Contrib Nephrol.Basel:Karger,2014:112-121.

4 Agrawal V,Prasad N,Jain M,et al.Reduced podocin expression in minimal change disease and focal segmental glomerulosclerosis is related to the level of proteinuria.Clin Exp Nephrol,2013,17(6):811-818.

5 Zheng CX,Chen ZH,Zeng CH,et al.Triptolide protects podocytes from puromycin aminonucleoside induced injury in vivo and in vitro.Kidney Int,2008,74(5):596-612.

6 Kramer-Zucker AG,Wiessner S,Jensen AM,et al.Organization of the pronephric filtration apparatus in zebrafish requires Nephrin,Podocin and the FERM domain protein Mosaic eyes.Dev Biol,2005,285(2):316-329.

7 Fukuyo Y,Nakamura T,Bubenshchikova E,et al.Nephrin and Podocin functions are highly conserved between the zebrafish pronephros and mammalian metanephros.Mol Med Rep,2014,9(2):457-465.

8 Westerfield M.The zebrafish book.A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).4th ed.Eugene:Univ of Oregon Press,2000,46-53.

9 Caster AH,Kahn RA.Computational method for calculating fluorescence intensities within three-dimensional structures in cells.Cell Logist,2012,2(4):176-188.

10 Guan N,Ding J,Deng J,et al.Key molecular events in puromycin aminonucleoside nephrosis rats.Pathol Int,2004,54(9):703-711.

11 Zhou W,Hildebrandt F.Inducible podocyte injury and proteinuria in transgenic zebrafish.J Am Soc Nephrol,2012,23(6):1039-1047.

12 Jain V,Feehally J,Jones G,et al.Steroid-resistant nephrotic syndrome with mutations in NPHS2 (podocin):report from a three-generation family.Clin Kidney J,2014,7(3):303-305.

13 Roselli S,Heidet L,Sich M,et al.Early glomerular filtration defect and severe renal disease in podocin-deficient mice.Mol Cell Biol,2004,24(2):550-560.

14 Huang J,McKee M,Huang HD,et al.A zebrafish model of conditional targeted podocyte ablation and regeneration.Kidney Int,2013,83(6):1193-1200.

15 Fukuda H,Hidaka T,Takagi-Akiba M,et al.Podocin is translocated to cytoplasm in puromycin aminonucleoside nephrosis rats and in poor-prognosis patients with IgA nephropathy.Cell Tissue Res,2015,360(2):391-400.

(本文編輯 加 則)

Development and preliminary application of anti-zebrafish podocin antibody

WANGLing,HOUQing,ZHUXiaodong,QINWeisong,ZENGCaihong，CHENZhaohong,LIUZhihong

NationalClinicalReaearchCenterofKidneyDiseases,JinlingHospital,NanjingUniversitySchoolofMedicine,Nanjing210016,China

CHENZhaohong(E-mail:czh4@sina.com);LIUZhihong(E-mail：liuzhihong@nju.edu.cn)

Objective：To prepare a polyclonal antibody against zebrafish podocin and evaluate podocyte injury with immunofluorescence using an in vivo zebrafish model of inducible podocyte injury. Methodology：(1) Zebrafish podocin peptides as antigen were designed and synthesized to immunize New Zealand white rabbits after coupling with keyhole limpet hemocyanin (KLH). The polyclonal antibody in rabbit sera was purified by protein A column. (2) Titer and specificity of the polyclonal antibody was determined by ELISA and immunohistochemistry. (3) Transgenic zebrafish Tg (pod;gal4;UAS:NTR-mCherry) was generated as an inducible podocyte injury model in vivo by nitroreductase (NTR)/metronidazole (MTZ) system. Morpholino antisense oligonucleotides (MO) was designed against translation of zebrafish embryo podocin mRNA. The synthesized podocin antibody was used to evaluate podocyte injury in the two podocyte injury models with immunofluorescence. Results：(1)The purify of synthesized podocin peptides was 92.6%, which met the immunogen standard. (2)The ELISA and immunohistochemistry showed that the titers of anti-podocin antibody reached up to 1∶ 5.12×105and 1∶ 106. (3) The staining of podocin was revealed as fine contiguous linear-like pattern along the glomerular capillary loop both in normal pronephros and mesonephros of zebrafish. (4)After 24hrs of MTZ treatment, the distribution of podocin became coarse granular pattern. The expression of podocin was significantly reduced at 48h after MTZ treatment. (5)Podocin morpholino-injected embryos exhibited pericardial edema and body-axis curvature. The expression of podocin was remarkably decreased and only barely visible 3dpf. However, the expression and distribution of podocin was recovered gradually and completely restored to normal at 5dpf. Conclusion：The anti-zebrafish podocin antibody we prepared possesses high titer and specificity, and is correlated with the severity of podocyte injury, suggesting a great potential of using podocin antibody for podocyte researches in zebrafish model.

zebrafish podocin podocyte

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.02.009

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃課題(2012CB517600，2012CB517606)，國(guó)家自然科學(xué)基金(81470943)，江蘇省六大人才高峰(WSN-079-2013)

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬金陵醫(yī)院(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院)腎臟科 碩士研究生(汪 玲)，國(guó)家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 全軍腎臟病研究所(南京，210016)

陳朝紅(E-mail：czh4@sina.com),劉志紅(E-mail：liuzhihong@nju.edu.cn)

2015-12-08

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