慢性腎臟病患者血清人附睪蛋白4與疾病進展的關(guān)系

楊曉霞 柏 明 劉麗敏 張 磊 張玉明 孫世仁

慢性腎臟病患者血清人附睪蛋白4與疾病進展的關(guān)系

楊曉霞1柏 明1劉麗敏2張 磊1張玉明1孫世仁1

目的：探討人附睪蛋白4(HE4)在慢性腎臟病(CKD)患者血清中的表達水平及其與CKD進展的關(guān)系。 方法：前瞻性收集了112例CKD患者的臨床資料及血清標本，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法對血清HE4水平進行檢測。 結(jié)果：CKD組血清HE4明顯高于正常對照組[(82.42±46.29) pmol/Lvs(29.85±15.18) pmol/L，P<0.001]。CKD各分期之間血清HE4的表達水平有顯著差異(P<0.01)，但在各病因之間血清HE4水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。HE4表達水平與估算的腎小球濾過率(eGFR)呈負相關(guān)(r=-0.712，P<0.001)，與患者年齡、肌酐、尿素氮、胱抑素C及腎間質(zhì)纖維化的比例呈正相關(guān)(r=0.377，r=0.476，r=0.561，r=0.612，r=0.487，P<0.01)。生存曲線分析表明循環(huán)中較高水平的HE4與較低的腎臟存活率相關(guān)。多因素分析可知，血清HE4水平為CKD獨立的預后因子(HR=1.032，P=0.001)。 結(jié)論：血清中高表達的HE4與CKD患者的腎臟不良預后相關(guān)，表明HE4可能是CKD進展的一個血清生物學標志物。

慢性腎臟病 人附睪蛋白4 血清 預后

慢性腎臟病(CKD)起病隱匿，發(fā)病率高，知曉率低，已成為一個全球性的公共健康問題[1-2]。各種原因引起的CKD，隨著病程的進展最終都會引起膠原蛋白和細胞外基質(zhì)的過多集聚，導致腎臟纖維化，尤其是腎間質(zhì)纖維化[3-4]。血清肌酐水平、腎小球濾過率及蛋白尿水平是臨床中常用的對CKD進展監(jiān)測及反映疾病嚴重性的指標[5-6]，然而這些指標并不足夠敏感可以早期反映疾病進展的跡象[5]。盡管很多研究已經(jīng)表明Snail蛋白、結(jié)締組織生長因子、α平滑肌動蛋白可作為腎臟纖維化及疾病進展的生物學標志[7-9]，然而要用于臨床實踐還需要大量的研究數(shù)據(jù)支持[10]。因此，積極尋找早期、無創(chuàng)、靈敏的血清生物學指標對CKD進展監(jiān)測、治療及預后仍然有著極其重要的作用。

人附睪蛋白4(HE4)蛋白為WAP-4-二硫化物核心結(jié)構(gòu)域2(WAP four-disul-fide coredomains-2，WFDC2)基因編碼的產(chǎn)物，其分子量約為25 kD，WFDC2是乳清酸性蛋白(WAP)的結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)家族的一員[11]。HE4是一種蛋白酶抑制劑，通過其重復的4-二硫化物核心結(jié)構(gòu)域或WAP基序發(fā)揮自然免疫作用，并在生長和分化中發(fā)揮重要作用[12]。近年研究表明，在纖維化的腎臟組織中HE4表達上調(diào)，可編碼絲氨酸蛋白激酶抑制劑，在不同的小鼠腎臟病模型中注入HE4中和抗體，可抑制腎臟纖維化，延緩CKD的進展[13]。然而，HE4在CKD患者循環(huán)中的水平及其與疾病進展的關(guān)系并不清楚。本研究用ELISA法檢測CKD患者血清中HE4的表達水平，探討其能否作為CKD進展及預后的血清生物學標志物。

對象和方法

研究對象 選取2011年1月～2012年1月在第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院腎臟內(nèi)科病房就診的CKD患者。診斷符合K/DOQI指南[14]規(guī)定，有下面一項異常即能診斷CKD：(1)腎臟損傷(血、尿成分異常、或影像學檢查異常、或病理學檢查異常) ≥3個月，有或無估算的腎小球濾過率(eGFR)異常；(2) eGFR<60 ml/(min·1.73m2)≥3 個月，有或無腎臟損傷證據(jù)。

納入標準：符合CKD的診斷標準并且經(jīng)活檢病理證實腎臟有纖維化改變(腎小管間質(zhì)纖維組織增生≥5%標本總面積)。排除標準：(1)合并嚴重感染或者嚴重的免疫功能缺陷；(2)伴嚴重的心腦血管疾??；(3)合并惡性腫瘤。符合入組條件者共112例，作為CKD組。選取同期體檢的健康人60例作為對照組，對照組腎功能正常[eGFR>90 ml/(min·1.73m2)],均無高血壓、糖尿病、心腦血管等疾病。

方法 所有對象均清晨空腹靜脈采血3 ml，以3 000 r/min離心20 min后分離血清樣本于凍存管中，-80 ℃保存待檢。采用ELISA法檢測血清HE4含量，檢測試劑盒由北京誠林生物科技有限公司提供，具體操作嚴格按說明書進行。eGFR的計算采用CKD流行病學合作研究(CKD-EPI)公式[15]。

隨訪 臨床對本組所有患者進行電話隨訪或者門診隨訪，隨訪時間為5～48個月。隨訪終點為腎功能下降：eGFR下降≥基線值的30%或者患者進入終末期腎病階段(需要透析或腎移植等替代治療)。所有患者隨訪至2015年5月，如果隨訪期間患者失訪或者死亡，則采用末次隨訪所記錄的信息。

統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17．0軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料用均數(shù)±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗，樣本均數(shù)多組間的比較采用方差分析(ANOVA)。Spearman法分析其濃度與臨床腎功能指標及組織學參數(shù)的相關(guān)性。Kapla-Meier(KM)法生存曲線評估了腎臟的長期存活率，曲線間的差異用Log-rank分析。COX比例風險回歸模型用來評估獨立預后因素。以α=0.05為檢驗水準，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義，P<0.01為統(tǒng)計學差異顯著。

結(jié) 果

一般臨床情況 CKD組112例，平均年齡(43.2±16.8)歲。其中IgA腎病46例，特發(fā)性膜性腎病18例，狼瘡性腎炎14例，過敏性紫癜性腎炎6例，其他28例(淀粉樣變性5例、糖尿病腎病5例、乙型肝炎相關(guān)性腎炎5例、IgM腎病4例、ANCA相關(guān)性系統(tǒng)性血管炎性腎損害5例、結(jié)締組織病腎損傷4例)。根據(jù)K/DOQI指南[16]將CKD分為5期，其中CKD 1～2期共62例，CKD 3期32例，CKD 4～5期共18例。對照組60例，平均年齡(38.0±9.4)歲。兩組在年齡及性別方面差異無統(tǒng)計學意義。

兩組受檢者血清HE4水平的比較 CKD患者組血清HE4水平為(82.4±46.3) pmol/L，顯著高于正常對照組(29.9±15.2) pmol/L，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖1A)。

不同臨床病理類型CKD患者血清HE4水平比較 IgA腎病、膜性腎病、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎的血清HE4水平分別為(85.1±55.5) pmol/L、(79.2±32.2) pmol/L、(113.2±46.0) pmol/L、(79.4±44.6) pmol/L,顯著高于健康人(29.9±15.2) pmol/L，但是各種病理類型之間并無統(tǒng)計學差異(表1)。

表1 血清HE4的表達水平與CKD不同病理類型的關(guān)系

*：淀粉樣變性腎病、糖尿病腎病、乙型肝炎相關(guān)性腎炎、IgM腎病等

不同臨床分期CKD患者血清HE4水平比較 不同分期的CKD患者隨著病情的進展，血清HE4水平升高，CKD 1～2期、3期及4～5期的血清HE4水平分別為(56.6±24.3) pmol/L、(91.1±36.1) pmol/L及(155.8±36.0) pmol/L。3期及4～5期的血清HE4水平明顯高于1～2期，差異有統(tǒng)計學意義(圖1B)。

血清HE4水平與CKD患者臨床腎功指標的相關(guān)性 為了說明HE4參與或者在CKD進展中發(fā)揮作用，我們對其在血清中的表達水平與臨床腎功指標進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，HE4的表達水平與eGFR呈明顯的負相關(guān)(圖2A)，與年齡、血清肌酐、尿素氮、胱抑素C呈正相關(guān)(r=0.377,P=0.004；r=0.476,P<0.000；r=0.487，P<0.001；r=0.612，P<0.001，圖2B,C)。但是，HE4的表達水平與血壓及尿蛋白定量間并無明顯的相關(guān)性(表2)。

血清HE4濃度與腎小管間質(zhì)纖維化的關(guān)系 CKD患者血清HE4濃度與腎小管間質(zhì)纖維化的比例呈正相關(guān)(r=0.514，P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義(圖2D)。

圖1 A：CKD患者及健康對照組血清HE4濃度；B：CKD各期血清HE4濃度及其與健康對照組的比較CKD：慢性腎臟病；HE4：人附睪蛋白4；**:P<0.01；***:P<0.001

圖2 CKD患者血清HE4濃度與eGFR(A)、SCr(B)、BUN(C)、TIF(D)的相關(guān)性CKD：慢性腎臟?。籋E4：人附睪蛋白4；eGFR:估算的腎小球濾過率；SCr：血清肌酐；BUN：血清尿素氮；TIF:腎小管間質(zhì)纖維化

表2 HE4的表達水平與臨床參數(shù)及腎功指標的相關(guān)性

HE4：人附睪蛋白4；eGFR:估算的腎小球濾過率；a數(shù)據(jù)為均值±標準差或者是中位數(shù)和四分位間距

血清HE4濃度與CKD患者預后的關(guān)系 在對本組112例患者平均42個月的隨訪期中，28例(25%)患者到達終點事件。將CKD患者按照HE4的平均值分為兩組，血清HE4水平≥82.42 pmol/L組24例(21%)患者到達終點事件，而HE4水平<82.42 pmol/L組4例(4%)患者到達終點事件(P<0.001)。將血清HE4水平作為一個分類變量進行COX單變量分析，結(jié)果表明在血清HE4水平≥82.42 pmol/L組到達終點事件的風險明顯高于HE4水平<82.42 pmol/L組(HR=7.33，95%CI:1.64～32.83，P=0.002)。生存曲線分析表明血清HE4水平≥82.42 pmol/L組腎臟存活率明顯低于HE4水平<82.42 pmol/L組(P<0.001，圖3)。多因素分析進一步得知，血清HE4水平為CKD獨立的預后因子(HR=1.032，95%CI:1.01～1.05，P=0.001)。為了評估HE4對CKD進展的預測價值，我們做了預后ROC曲線分析并與eGFR進行比較(圖4)，在48個月時，HE4曲線下面積(AUC)為0.835，對CKD的進展有一定的預測價值。

圖3 不同血清HE4水平患者的腎臟存活率曲線

圖4 ROC曲線預測CKD患者預后的效能HE4：人附睪蛋白4；eGFR:估算的腎小球濾過率；CKD：慢性腎臟病；A：HE4，AUC=0.835，P<0.001；B：eGFR，AUC=0.941，P<0.001

討 論

本研究主要表明CKD患者循環(huán)中HE4水平隨著腎功能的下降逐漸上升，與eGFR呈明顯的負相關(guān)。此外，我們也發(fā)現(xiàn)血清中較高水平的HE4對CKD的長期預后有一定的預測價值，表明HE4可能是CKD進展的一個新的血清生物學標志物。

HE4最早發(fā)現(xiàn)于人類附睪上皮，隨后發(fā)現(xiàn)在多種癌組織中高度表達，如卵巢癌[17]、肺癌[18]、子宮內(nèi)膜癌[19]等，被作為腫瘤的一個血清生物學標記。近年來，研究發(fā)現(xiàn)在犬及小鼠的腎臟纖維化模型中HE4的表達顯著上調(diào)[20-21]。LeBleu等[13]研究發(fā)現(xiàn)在CKD患者腎組織中HE4的表達主要在肌成纖維細胞，HE4作為肌成纖維細胞的衍生物介導了腎臟纖維化。盡管如此，HE4在CKD患者血清中的表達水平及與疾病進展的關(guān)系依然不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)，HE4在各種病理類型的CKD患者血清中的表達水平都顯著高于健康對照組(P<0.01)。隨著病情的進展及腎功能的減退，HE4的表達水平進一步升高。CKD 4～5期患者血清HE4的水平明顯高于CKD 1～2期，其表達水平與eGFR呈明顯的負相關(guān)，這與Bunnag等[22]研究結(jié)果一致。Bunnag等[22]研究發(fā)現(xiàn)在腎臟移植組織中，HE4表達水平上調(diào)，其轉(zhuǎn)錄水平與較低水平的eGFR相關(guān)。此外，Escudero等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在沒有惡性疾病的患者中，腎功能減退是HE4異常表達最常見的原因，我們的數(shù)據(jù)也發(fā)現(xiàn)血清HE4濃度與腎小管間質(zhì)纖維化的比例呈正相關(guān)，與腎功指標血清肌酐、尿素氮、胱抑素C也有明顯的相關(guān)性，這些結(jié)果提示HE4的表達水平可能與CKD的進展相關(guān)。但是，其表達水平與24h尿蛋白定量間并未發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性，這可能提示與腎小球相比，HE4對腎小管間質(zhì)的影響更大。綜上，CKD患者血清中HE4水平升高與CKD的進展及腎功能的惡化密切相關(guān)。

HE4在循環(huán)中的水平與CKD的腎臟預后也明顯相關(guān)。我們的研究表明與低于均值水平的HE4組患者相比，高表達HE4組患者進入終末期腎病的風險更大。此外，在多因素分析中調(diào)整了各種臨床變量后，較高水平的HE4與CKD的不良預后相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)與之前的結(jié)果均表明，隨著CKD的進展，HE4的表達水平逐漸上升，且對CKD的預后有一定的預測價值。

CKD進展的終末期結(jié)果是腎臟纖維化，主要特征包括腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化。無論基礎疾病如何，CKD一旦進展，腎臟的正常組織結(jié)構(gòu)逐步被Ⅰ型膠原蛋白和其他的一些細胞外基質(zhì)蛋白所取代[3,24]。Ⅰ型膠原蛋白的沉積會導致腎實質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的改變，最終引起腎衰竭。目前已有許多研究表明，肌成纖維細胞產(chǎn)生的Ⅰ型膠原蛋白形成瘢痕是腎臟纖維化的一個發(fā)病機制[25-26]。LeBleu等[13]研究發(fā)現(xiàn)在來自腎間質(zhì)纖維化組織中的腎間質(zhì)肌成纖維細胞中，HE4被確定為α平滑肌動蛋白的一個下游靶點，同時也證實了在單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠模型中，HE4在肌成纖維細胞中強烈表達。本研究發(fā)現(xiàn)，在各種病理類型的CKD患者血清中，HE4表達水平明顯上調(diào)，且與腎間質(zhì)纖維化的比例也呈明顯的正相關(guān)，表明高表達的HE4是腎臟纖維化一個共同的下游信號通路。其可能機制是在纖維化的腎臟組織中，腎間質(zhì)肌纖維細胞中HE4大量表達，血清中分泌型HE4表達水平增加，升高的HE4基因可編碼絲氨酸蛋白激酶抑制劑，抑制多種蛋白激酶的活性(包括絲氨酸蛋白酶和金屬基質(zhì)蛋白酶)，并且特異性地抑制了它們降解膠原蛋白Ⅰ的能力，加速了Ⅰ型膠原蛋白在腎臟的沉積，引起CKD的進展，最終加速了腎臟纖維化。給單側(cè)輸尿管梗阻的小鼠注射HE4中和性抗體，與未注射抗體組比較，腎間質(zhì)纖維化程度明顯減輕，在5/6腎切除的大鼠及腎毒血清性腎炎模型中也發(fā)現(xiàn)了同樣的現(xiàn)象[13]。這些結(jié)果提示，動態(tài)監(jiān)測患者血清HE4水平可幫助判斷CKD患者病情的進展及預后。

總之，血清生物學標志物檢測因其無創(chuàng)、客觀、簡便的優(yōu)勢在疾病診治過程中起到很好的輔助作用。本研究發(fā)現(xiàn)隨著CKD進展及腎功能的惡化，循環(huán)中HE4的表達水平升高且對CKD的腎臟預后有一定的預測作用，表明HE4可作為CKD進展及預后的又一潛在血清生物學標記物。由于本研究中樣本量相對較少，故研究結(jié)果有待于更大規(guī)模的臨床研究進一步驗證，確定合適的HE4參考區(qū)間及不同臨床分期CKD患者血清中HE4的濃度范圍。

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(本文編輯 律 舟 凡 心)

Significance of serum human epididymis protein 4 levels in patients with chronic kidney disease

YANGXiaoxia1,BAIMing1,LIULimin2，ZHANGLei1,ZHANGYuming1,SUNShiren1

1DepartmentofNephrology,FirstAffiliatedHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China2StateKeyLaboratoryofCancerBiologyFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710032,China

SUNShiren(E-mail:sunshiren11@sina.com)

Objective：To investigate the expression levels of HE4 in the serum of CKD patients and the relationship to CKD progression. Methodology：We prospectively collected the clinical data and serum samples of 112 CKD patients and serum HE4 concentration of the participants were tested using ELISA. Results：CKD patients had significantly higher serum HE4 concentration than the health controls (82.42±46.29vs29.85±15.18,P<0.001). Serum HE4 levels were significantly different among CKD stages (P<0.01), but were not significantly different among various pathological types of CKD(P>0.05). HE4 levels in the serum were inversely correlated with estimated glomerular filtration rates (eGFRs) (r=-0.712,P<0.001). In addition, positive correlations were found between serum HE4 levels and age, serum creatinine, blood urea nitrogen, cystatin C and the proportions of tubulointerstitial fibrosis(r=0.377,r=0.476,r=0.561,r=0.612,r=0.487,P<0.01; respectively). Kaplan-Meier survival curves showed that higher serum HE4 level was associated with shorter renal survival duration. Cox multivariate analyses further demonstrated that serum HE4 concentration was an independent prognostic factor for CKD patients (HR=1.032,P=0.001). Conclusion：Our study showed that high circulating HE4 levels were associated with adverse kidney disease outcome, suggesting that HE4 is a novel biomarker for CKD progression.

Chronic kidney diseases Human epididymis protein 4 Serum Outcome

10.3969/cndt.j.issn.1006-298X.2016.02.006

國家自然科學基金(81170670，81400699)，陜西省自然科學基金(2014JZ007)

1第四軍醫(yī)大學第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科(西安，710032)；2第四軍醫(yī)大學國家腫瘤生物學重點實驗室

孫世仁(E-mail：sunshiren11@sina.com)

2016-01-27

? 2016年版權(quán)歸《腎臟病與透析腎移植雜志》編輯部所有