附子生物堿脫毒前后對小菜蛾室內(nèi)毒力活性比較研究

白　雪,康曉慧,楊隨莊,袁小紅,周　強

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，中國 綿陽　621000；2．永明鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，中國 綿陽　621038)

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附子生物堿脫毒前后對小菜蛾室內(nèi)毒力活性比較研究

白雪1,康曉慧1*,楊隨莊1,袁小紅1,周強2

(1.西南科技大學生命科學與工程學院，中國 綿陽621000；2．永明鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)服務中心，中國 綿陽621038)

摘要通過對附子生物堿進行脫毒處理，將雙酯型附子生物堿水解為單酯型附子生物堿，分別測定了脫毒前后附子生物堿對小菜蛾的室內(nèi)毒力活性，包括拒食活性、胃毒活性和生長抑制活性.拒食活性中，非選擇性拒食率脫毒前后的毒力回歸曲線分別為y=-3.312+2.014X, y=-1.666+1.716X，AFC50分別為0.651和0.971 g/L.選擇性拒食率的毒力回歸曲線分別為y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，AFC50為0.753和1.201 g/L.胃毒活性中，死亡率的毒力回歸曲線分別為y=-1.296+1.838X， y=-1.386+1.379X, LC50分別為0.705和1.005 g/L.生長抑制活性中，生長抑制率的毒力回歸曲線分別為y=-1.283+1.73X， y=-1.24+1.316X, AGC50分別為0.742和0.942 g/L.分析以上三種活性可知，脫毒前附子生物堿對小菜蛾的殺蟲活性主要體現(xiàn)在拒食活性上，其次為生長抑制活性和胃毒活性；脫毒后殺蟲活性有所降低，但未全部喪失，尤其在拒食活性上表現(xiàn)明顯.

關(guān)鍵詞附子生物堿；小菜蛾；毒力回歸曲線

附子為毛茛科植物烏頭(AconitumcarmichaeliDebx.)，其活性成分含生物堿，具有很強的藥理作用.很多學者對附子進行了研究，大多集中在對附子生物堿的提取及其成分分析上，而對其應用價值鮮見研究.劉倩等[1]采用單因素實驗篩選出了最佳的TLC條件，完善了附子生物堿的TLC檢查方法；楊潔紅等[2]將附子生物堿同甘草的活性物質(zhì)結(jié)合，對兩者結(jié)合所產(chǎn)生的抗炎作用機制進行了探討；陳平等[3]采用液相色譜-質(zhì)譜的方法對附子生物堿的煎煮減毒機理進行了研究；楊昌林等[4]利用蒸制和烘制兩種方法對附子生物堿的成分含量進行了系統(tǒng)研究.

小菜蛾是十字花科蔬菜主要害蟲之一，因其易產(chǎn)生抗藥性及耐藥性，成為了目前許多學者研究熱點之一.羅雁婕等[5]對云南省及國內(nèi)外小菜蛾抗藥性的研究概況進行了系統(tǒng)分析；邢靜等[6]采用葉片藥膜法，探討了亞致死濃度氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾解毒酶活性和藥劑敏感的影響；程英等[7]選取貴陽、安順及遵義作為試驗點，就小菜蛾田間種群對殺蟲劑的抗藥性進行了監(jiān)測；劉玉娣等[8]測定了不同蟲齡小菜蛾過氧化氫酶、過氧化物酶與耐藥性之間的關(guān)系.此外，很多學者還將研究重點放在了防治措施上面.李振宇等[9]對比了不同性誘劑誘芯對小菜蛾的引誘效果；孔國順等[10]選取了8種生物農(nóng)藥對小菜蛾進行了藥效實驗，在實驗基礎(chǔ)上篩選出了較為有效的生物農(nóng)藥；魯喜榮等[11]選取了克蛾寶、銳農(nóng)丹等6種乳油制劑對小菜蛾進行田間防控，對每種農(nóng)藥的藥效作用進行了分析；陸信任等[12]研究了15%的茚蟲威乳油對小菜蛾的防治效果.

本文選擇小菜蛾作為實驗對象，采用附子生物堿作為防治藥劑，其主要成分為烏頭類生物堿，結(jié)構(gòu)可分為單酯型和雙酯型[13]，由于雙酯型生物堿毒性較大，在實際應用中受到了很多限制,基于此，本文將雙酯型生物堿轉(zhuǎn)變?yōu)閱熙バ蜕飰A，比較了脫毒前后附子生物堿對小菜蛾室內(nèi)毒力活性的變化，并對其作用機理進行了初步分析，這對附子生物堿的實際應用具有一定的推廣價值，并且能為植物源農(nóng)藥的開發(fā)提供一定的理論依據(jù).

1材料與方法

1.1供試蟲源

供試蟲源源于四川省綿陽市三臺縣永明鎮(zhèn)油菜示范基地，于西南科技大學東七實驗樓進行飼養(yǎng).飼養(yǎng)條件為室溫25 ℃，相對濕度70%，L/D=14/10，幼蟲飼養(yǎng)油菜幼苗，成蟲飼養(yǎng)20%的蜂蜜水，實驗期間選取2～3齡期健康幼蟲進行實驗.

1.2附子生物堿的制備

附子于2014年8月采于四川省綿陽市江油縣，自然晾干后用粉碎機粉碎為干粉，用95%乙醇提取8 h，用旋蒸儀蒸發(fā)至膏狀，放入深色廣口瓶中置于4 ℃下保存?zhèn)溆?將供試提取物用蒸餾水加熱溶解，分為0.1，0.3，0.5，0.8，1.0 g/L 5個梯度濃度.

1.3附子生物堿的脫毒

將提取物加入到1,4-二氧六環(huán)和水的混合液(體積比9∶1)中，在95 ℃下利用水浴加熱回流約10 h，即可將雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為單酯型.

1.4實驗方法

1.4.1附子生物堿脫毒前后對小菜蛾幼蟲的拒食活性參照Ismail等[14]的方法，，將潔凈的甘藍葉制成2×3 cm2大小，分別于配好的藥液中浸置10 s，通風處自然陰干，用蒸餾水作對照.將晾干的葉片放入直徑7.0 cm 的培養(yǎng)皿，接入大小一致的3齡幼蟲，每個處理3組重復，每組重復10 頭試蟲，轉(zhuǎn)入恒溫培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為(25±1)℃，相對濕度60%～70%，光暗周期比L/D=16/8. 24 h后用坐標紙測量其取食面積，計算出拒食率.計算公式如下：

選擇性拒食率(%)=(對照組取食量-處理組取食量)/(對照組取食量+處理組取食量)×100,

非選擇性拒食率(%)=(對照取食量-處理取食量)/對照取食量×100.

1.4.2附子生物堿脫毒前后對小菜蛾幼蟲的胃毒活性參照1.4.1的方法在培養(yǎng)皿中接入事先饑餓了2 h的生長一致的2齡幼蟲，每天更新葉片，記錄死亡蟲數(shù)，24 h記錄一次，連續(xù)記錄7天.計算其死亡率：死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/總頭數(shù)×100.

1.4.3附子生物堿脫毒前后對小菜蛾幼蟲的生長抑制活性參照1.4.1的方法將2齡幼蟲接入培養(yǎng)皿前，對每頭幼蟲稱取體質(zhì)量.每天稱一次，并更換新處理葉片，堅持記錄7 d.死蟲不稱體質(zhì)量.計算生長發(fā)育抑制率.

體質(zhì)量增長率(%)=(處理后體質(zhì)量-處理前體質(zhì)量)/處理前體質(zhì)量×100,

生長發(fā)育抑制率(%)=(對照體質(zhì)量增長率-處理體質(zhì)量增長率)/對照體質(zhì)量增長率×100.

1.5數(shù)據(jù)處理

用EXCLE 2015對數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)處理，SPSS 21.0進行顯著性分析和回歸分析.

2結(jié)果與分析

2.1附子生物堿脫毒前后對小菜蛾幼蟲的拒食活性

從非選擇拒食率可知，脫毒前各濃度間拒食率均呈顯著性差異，處理濃度加大，拒食率明顯升高，最高達到76%，這表明高濃度下附子生物堿對小菜蛾具有較強的非選擇性拒食活性；脫毒后，當濃度加大到0.5 g/L時，各濃度開始出現(xiàn)顯著性差異，拒食率雖然較脫毒前有所降低，但最高達到53%.對于選擇性拒食率，脫毒前后各濃度間差異不如非選擇性拒食率明顯，選擇性拒食率在未脫毒前最高為59%，相比非選擇性拒食率有所降低.這表明附子生物堿對小菜蛾的拒食活性無論是在脫毒前還是脫毒后，非選擇性拒食活性都高于選擇性拒食活性.結(jié)合兩者的毒力回歸曲線分析，脫毒前的拒食中濃度都低于脫毒后的拒食中濃度，非選擇性拒食中濃度低于選擇性拒食中濃度.非選擇性拒食率脫毒前后的回歸曲線分別為y=-3.312+2.014X,y=-1.666+1.716X，非選擇拒食中濃度分別為0.651和0.971 g/L.選擇性拒食率回歸曲線分別為y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，選擇性拒食中濃度為0.753和1.201 g/L.具體見表1和表2.

表1　附子生物堿對小菜蛾幼蟲的拒食率

注：同列數(shù)據(jù)后的小寫字母表示不同處理間差異顯著，下表同.

表2　附子生物堿對小菜蛾幼蟲的拒食活性統(tǒng)計分析

2.2附子生物堿脫毒前后分別對小菜蛾的胃毒作用

對7天內(nèi)小菜蛾的死亡率進行分析，死亡率最高為63%，整體死亡率偏低，表明附子生物堿對小菜蛾的胃毒作用不明顯.單獨分析脫毒前，處理前期，各濃度間的死亡率顯著性差異不明顯，第五天開始，濃度達到0.8 g/L的幼蟲死亡率超過了50%，并且與其他濃度間呈現(xiàn)顯著性差異.脫毒后，附子生物堿對小菜蛾的胃毒活性明顯降低，低濃度下小菜蛾從第五天開始才出現(xiàn)少量死亡，并且死亡率普遍未超過50%.對第七天小菜蛾的死亡情況進行回歸分析，其毒力回歸曲線分別為y=-1.296+1.838X,y=-1.386+1.379X, 脫毒后小菜蛾的死亡率相比脫毒前變化趨勢緩慢.半致死濃度分別為0.705和1.005 g/L.脫毒后的LC50超過了1 g/L，表明脫毒后的附子生物堿對小菜蛾的胃毒作用明顯減弱,見表3～表5.

表3　附子生物堿脫毒前對小菜蛾的胃毒作用

表4　附子生物堿脫毒后對小菜蛾的胃毒作用

表5　附子生物堿對小菜蛾幼蟲胃毒活性的統(tǒng)計分析

2.3附子生物堿脫毒前后分別對小菜蛾的生長抑制作用

結(jié)合表6和表7分析，附子生物堿對小菜蛾體質(zhì)量增長有一定的抑制作用.脫毒前，前兩天各濃度之間的抑制率不顯著.從第四天起，高濃度與低濃度開始呈現(xiàn)出顯著性差異，拒食率也逐漸增大.第七天，當濃度為0.8和1.0 g/L時，生長抑制率分別達到54.7%和67.6%.脫毒后，小菜蛾幼蟲的生長抑制率有所降低，各濃度下的生長抑制率顯著性不如脫毒前明顯，在第六天和第七天時，高濃度(大于0.5 g/L)與低濃度呈現(xiàn)出了一定差異性，生長抑制率最高為52.22%，脫毒前附子生物堿對小菜蛾幼蟲生長抑制中濃度為0.742 g/L,明顯低于脫毒后的0.942 g/L.毒力回歸曲線分別為y=-1.283+1.73X,y=-1.24+1.316X.

表6　附子生物堿脫毒前小菜蛾幼蟲的生長抑制率

表7　附子生物堿脫毒后小菜蛾幼蟲的生長抑制率

表8　附子生物堿對小菜蛾幼蟲的生長抑制活性統(tǒng)計分析

3小結(jié)與討論

化學藥劑的無限制施用導致小菜蛾的抗藥性不斷多元化，而小菜蛾一旦對一種農(nóng)藥產(chǎn)生抗藥性以后，也會對其他未使用過的農(nóng)藥產(chǎn)生交互的抗性[15].本文選取的生物堿來源于附子，已有很多文獻報道過其具有拒食、觸殺、生長發(fā)育抑制、降低適應能力、降低生殖力等多種生物活性，正是由于其多種特異活性從而使得害蟲很難產(chǎn)生抗藥性[16].同樣，附子生物堿結(jié)構(gòu)中的雙酯型生物堿也被一些文獻證明其具有一定毒性，可能會對人體造成影響.本文據(jù)此對供試藥劑進行了脫毒處理，將雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿，分別對照了附子生物堿脫毒前后對小菜蛾的拒食活性、胃毒活性及生長抑制活性.

實驗結(jié)果表明，3種活性中拒食活性最高，脫毒前非選擇性拒食率和選擇性拒食率最高分別達到76%和59%，而且在此過程中出現(xiàn)了幼蟲死亡現(xiàn)象，這可能是因為無法進食而導致的.而在脫毒后，兩者拒食率有所降低，分別為53%和36%，這表明對附子生物堿進行脫毒后，仍然對小菜蛾具有一定的拒食活性，并且其效果主要體現(xiàn)在非選擇性拒食率上.脫毒前后非選擇性拒食率的獨立回歸曲線分別為y=-3.312+2.014X，y=-1.666+1.716X，AFC50分別為0.651和0.971 g/L.選擇性拒食率回歸曲線分別為y=-0.859+1.141X，y=-1.718+1.431X，AFC50分別為0.753和1.201 g/L.

對胃毒作用進行分析，未脫毒時，小菜蛾幼蟲死亡率最高僅達到63%，并且是在最高濃度施用第7天時所呈現(xiàn)的效果，其他時間死亡率普遍偏低.而脫毒后死亡率大幅降低，基本未超過50%.這表明附子生物堿對小菜蛾的胃毒作用微效而且緩慢.脫毒前后的毒力回歸曲線分別為y=-1.296+1.838X，y=-1.386+1.379X, 半致死濃度在脫毒前后普遍偏高，分別為0.705和1.005 g/L，這表明附子生物堿對小菜蛾的胃毒作用不太明顯.

對生長抑制作用進行分析，實驗前期，各濃度生長抑制率間顯著性差異表現(xiàn)不明顯，生長抑制率普遍偏低，但從第四天開始，高濃度與低濃度間呈現(xiàn)出一定差異性，脫毒前生長抑制率最高為67.79%，脫毒后最高為52.22%，這表明附子生物堿對小菜蛾具有一定的生長抑制活性.脫毒前后死亡率的毒力回歸曲線分別為y=-1.283+1.73X，y=-1.24+1.316X, AGC50分別為0.742和0.942 g/L.

綜合以上分析結(jié)果，附子生物堿脫毒前對小菜蛾具有較強的殺蟲活性，且主要體現(xiàn)在拒食活性上，拒食活性中非選擇拒食活性高于選擇性拒食活性，其次為生長抑制活性，胃毒活性最弱.在拒食活性中，介于本文只測定了24 h的拒食面積，若測定48 h甚至72 h的拒食，其拒食效果還有待研究.而將雙酯型生物堿水解為單酯型生物堿后，殺蟲活性有所減弱，但從拒食活性和生長抑制活性中可知，脫毒后的拒食率和生長抑制率均超過了50%，這表明脫毒后的生物堿在一定濃度下可以進一步利用.

從3種活性的實驗效果可以看出，附子生物堿對小菜蛾的作用方式是間接性的，主要是通過幼蟲接觸藥劑后產(chǎn)生拒食反應，減少取食甚至停止進食，迫使其生長發(fā)育得到抑制，最后導致死亡.本研究由于條件限制，只在室內(nèi)進行了實驗，若要將附子生物堿真正推廣到實際應用中，還需利用田間試驗進一步探究不同大田氣候環(huán)境下附子生物堿對小菜蛾的施用效果，在進行大田實驗時，可考慮將其與化學農(nóng)藥復合或者交替施用，充分發(fā)揮兩者的優(yōu)勢作用，降低防治成本，延緩小菜蛾產(chǎn)生抗藥性.

參考文獻：

[1]劉倩，馬俐麗，車坷科.附子生物堿薄層層析影響因素研究[J]. 藥物鑒定， 2007，16(24)：32-33.

[2]楊潔紅，張宇燕，萬海同，等.附子生物堿與甘草活性物質(zhì)組合抗大鼠佐劑性關(guān)節(jié)炎的實驗研究[J]. 中草藥， 2010，41(3):439-444.

[3]陳平，陳益民，陳佳，等.液相色譜-質(zhì)譜法研究附子生物堿的煎煮減毒機理[J].色譜， 2013，31(11)：1087-1092.

[4]楊昌林，黃志芳，張意涵，等.蒸制和烘制對附子生物堿成分含量的影響研究[J]. 中國中藥雜志， 2014，39(24):4798-4803.

[5]羅雁婕，吳偉文，楊祚斌，等.小菜蛾抗藥性及治理的研究進展[J].云南大學學報:自然科學版， 2008，30(S1):178-182.

[6]邢靜，梁沛，高希武.亞致死濃度氯蟲苯甲酰胺對小菜蛾藥劑敏感度和解毒酶活性的影響[J].農(nóng)藥學學報, 2011,13(5)：464-470.

[7]程英，李鳳良，金劍雪，等.小菜蛾田間種群對殺蟲劑的抗藥性測定[J].貴州農(nóng)業(yè)科學，2012,40(12)：101-103.

[8]劉玉娣，趙士熙.小菜蛾過氧化氫酶和過氧化物酶與耐藥性的關(guān)系[J].福建農(nóng)林大學學報:自然科學版，2002,31(3):304-307.

[9]李振宇，諶愛東，章金明，等.不同性誘劑誘心對小菜蛾引誘效果研究[J].應用昆蟲學報， 2011,48(2)：324-327.

[10]孔國順，劉天龍，朱元良，等.8種生物農(nóng)藥防治菜青蟲和小菜蛾效果試驗[J].長江蔬菜, 2005(3)：39-40.

[11]魯喜榮，楊富.6種藥劑對油菜田小菜蛾的防效試驗初報[J].甘肅農(nóng)業(yè)科技， 2006(2)：25-26.

[12]陸信任，王世忠，何歡宇，等. 15%茚蟲威乳油防治小菜蛾幼蟲田間藥效試驗[J].上海蔬菜， 2012(5)：46-47.

[13]劉文龍，劉志強，宋鳳瑞，等.烏頭類雙酯型生物堿組分轉(zhuǎn)化為單酯型水解型及脂型生物堿組分的研究[J].高等學?；瘜W學報， 2011,32(3)：717-720.

[14]ISMAIL A M, PADRICK S B, CHEN B,etal. The WAVE regulatory complex is inhibited[J]. Nat Struct Mol Biol, 2009,16(5):561-563.

[15]畢道芬.小菜蛾抗藥性監(jiān)測，對茚蟲威抗性選育及抗性生化機理研究[D].武漢：華中農(nóng)業(yè)大學, 2010.

[16]董育新，吳文君.植物殺蟲劑毒理學研究新進展[J].昆蟲知識， 1997,34(2):112-116.

(編輯WJ)

Comparative Study on the Toxicity Activity toPlutellaXylostellaby Aconite Alkaloids Both before and after Detoxification in Laboratory

BAIXue1,KANGXiao-hui1*,YANGSui-zhuang1,YUANXiao-hong1,ZHOUQiang2

(1.College of Life Science and Engineering, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621010, China;2.Agricultural Service Center of Yongming Town, Mianyang 621038, China)

AbstractBased on the detoxification treatment, making the double ester type of aconite alkaloids hydrolyzed single ester type, we have determined the antifeedant activity, stomach toxicity and growth inhibitory activity by the aconite alkaloids before and after partial detoxification. For the antifeedant activity, the regression curve of the non selective antifeedant rate before and after detoxification is y=-3.312+2.014X, y=-1.666+1.716X, with AFC50 equal to 0.651 and 0.971 g/L, respectively. The regression curve of the selective antifeedant rate is y=-0.859+1.141X, y=-1.718+1.431X, with AFC50 0.753 and 1.201 g/L, respectively. For the gastric toxicity, the regression curve of mortality is y=-1.296+1.838X, y=-1.386+1.379X, with LC50 as 0.705 and 1.005 g/L, respectively. For the growth inhibition activity, the growth inhibition rate of the regression curve is y=-1.283+1.73X, y=-1.24+1.316X, with AGC50 to be 0.742 and 0.942 g/L, respectively. It can be seen from above results about the three kinds of activity that aconite alkaloids has a strong insecticidal effect before detoxification, which is mainly reflected by the antifeedant inhibition followed by the gastric toxicity. The activity is markedly reduced after detoxification, though not all of it is completely diminished, especially for the antifeedant activity.

Key wordsaconite alkaloids; Plutella xylostella; toxicity regression curve

中圖分類號S435.654

文獻標識碼A

文章編號1000-2537(2016)02-0029-06

*通訊作者,E-mail：xhuik09@126.com

基金項目：國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系四川創(chuàng)新團隊項目(川農(nóng)業(yè)[2009]156號)

收稿日期：2015-05-18

DOI:10.7612/j.issn.1000-2537.2016.02.005