結(jié)腸癌原位瘤模型方法探討

李凌云 張斌豪 張必翔

·論 著·(實驗研究)

結(jié)腸癌原位瘤模型方法探討

李凌云 張斌豪 張必翔

目的 研究常用結(jié)腸癌原位瘤模型方法的優(yōu)劣，建立穩(wěn)定的結(jié)腸癌原位瘤成瘤模型及肝轉(zhuǎn)移模型。方法 采用CT26小鼠結(jié)腸癌細胞系直接接種于Balb/c小鼠盲腸漿膜下層，或皮下成瘤后采用組織原位種植接種于小鼠盲腸漿膜下層。分析接種4周后原位成瘤及肝轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。另外，將CT26細胞分別接種于小鼠的小腸漿膜下和盲腸漿膜下。比較接種后成瘤效果及并發(fā)癥發(fā)生率。結(jié)果 采用細胞注射和組織種植兩種方法的原位成瘤率均為100%(5/5)，但細胞注射組原位瘤明顯大于組織種植組。細胞注射4周后肝轉(zhuǎn)移率為60%(3/5)，而組織種植組沒有發(fā)生肝轉(zhuǎn)移(P<0.01)。小腸原位種植成瘤率為100%(5/5)，但早期腸梗阻發(fā)生率為80%(4/5)，而盲腸注射組早期未見腸梗阻發(fā)生。結(jié)論 就接種類型而言，細胞原位注射較組織原位種植更適合結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型；而就注射部位而言，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型應(yīng)首選盲腸注射，而非小腸注射。

結(jié)腸癌； 原位種植； 動物模型

結(jié)腸癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，而肝轉(zhuǎn)移是結(jié)腸癌最常見的轉(zhuǎn)移方式和死亡原因。結(jié)腸癌原位瘤模型可以更好地模擬腫瘤的體內(nèi)發(fā)生發(fā)展過程。原位瘤模型對于結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移尤為重要，因為這一模型可以在體內(nèi)模擬結(jié)腸癌細胞通過門靜脈血流進入肝臟的全過程，是目前為止最好的結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型。由于技術(shù)難度或者腫瘤生物學(xué)特征導(dǎo)致原位瘤肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率難以達到研究要求，目前結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移模型很多采用脾臟注射腫瘤細胞或者門靜脈注射腫瘤細胞。這些方法顯然不如結(jié)腸癌原位瘤模型接近臨床實際，研究的價值也會相應(yīng)降低。因此，尋找合適的結(jié)腸癌原位瘤模型，提高原位瘤成瘤率和肝轉(zhuǎn)移率，建立比較穩(wěn)定的結(jié)腸癌原位瘤肝轉(zhuǎn)移模型，對于研究結(jié)腸癌的發(fā)生及肝轉(zhuǎn)移的機制以及相關(guān)的治療方法具有重要意義。本研究重點就腫瘤種植的方法和種植部位進行比較，探討盲腸漿膜下細胞注射和組織種植的優(yōu)劣，并比較盲腸注射和小腸注射后并發(fā)癥發(fā)生率。進而選擇最佳的種植方式和部位，用于研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的機制。

材料與方法

一、細胞、動物與試劑

小鼠結(jié)腸癌細胞系CT26由本實驗室保存。細胞用含5 mmol/L谷氨酰胺的PRMI 1640高糖培養(yǎng)基(Hyclone公司)加10%胎牛血清(Gibico公司)培養(yǎng)，置于37℃含5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。雄性4～6周齡Balb/c小鼠由同濟醫(yī)院實驗動物中心訂購，無特殊病原體環(huán)境下飼養(yǎng)。

二、皮下成瘤試驗

消化貼壁細胞成單細胞懸液并計數(shù)，將5×106結(jié)腸癌細胞CT26懸浮在200 μl生理鹽水中，吹打混勻后接種到裸鼠肩胛皮下。共接種4處皮下瘤備用。2周后皮下瘤直徑約1 cm，消毒皮膚去除皮下瘤，修剪腫瘤周圍纖維結(jié)締組織。取腫瘤外圍鮮嫩組織，用刀片切成直徑約1 mm的小塊組織置于冰上生理鹽水中用于腫瘤原位移植。腫瘤離體至移植時間不超過3 h。

三、小鼠盲腸漿膜下細胞注射

采用異氟醚吸入麻醉Balb/c小鼠(n=5)，取下腹正中切口打開腹腔，自左下腹尋找盲腸并將其拖出切口外。在顯微鏡下采用30G細針將懸浮于50 μl生理鹽水的1×105的結(jié)腸癌細胞CT26注射于盲腸中部血供豐富區(qū)域的漿膜下層。注意緩慢推注，時間控制在30 s，注射結(jié)束拔針后采用小棉球壓迫1 min。待注射液體被腸壁吸收后，將盲腸復(fù)位，避免加壓，關(guān)閉腹腔。

四、小鼠小腸漿膜下細胞注射

用上述方法將盲腸拖出體外后，在近端尋找小腸。取距盲腸近端約1 cm的小腸為注射點，采用盲腸注射同樣的方法進行小腸漿膜下注射(n=5)。

五、小鼠盲腸漿膜下組織移植

將小鼠皮下種植的CT26腫瘤取出，并將腫瘤外圍的新鮮腫瘤組織切取為1 mm大小的小塊置于冰上待用。采用異氟醚吸入麻醉Balb/c小鼠(n=5)，取下腹正中切口打開腹腔，自左下腹尋找盲腸并將其拖出切口外。在顯微鏡下采用尖刀片將盲腸中部的漿膜層刮開約1 mm范圍。將事先準備好的腫瘤組織塊置于刀片刮破的盲腸，并采用6-0的Prolene線將周圍漿膜包繞腫瘤組織塊。 止血并確定植入組織塊未脫出后將盲腸復(fù)位，關(guān)閉腹腔。

六、檢測指標與檢測方法

1．手術(shù)時間與術(shù)后并發(fā)癥觀察 術(shù)中分別記錄盲腸細胞注射和盲腸組織種植兩組所用手術(shù)時間。術(shù)后每天檢測小鼠體重，若體重連續(xù)減輕超過5 d，則處死小鼠并解剖腹腔，觀察有無腸梗阻，腹腔出血等。術(shù)后4周整，處死全部小鼠，解剖腹腔，觀察腹腔有無腸梗阻，并取出盲腸、部分小腸和結(jié)腸。

2．解剖學(xué)與組織學(xué)觀察 種植后4周末處死小鼠，仔細觀察腫瘤大小、形態(tài)以及周圍淋巴結(jié)、各內(nèi)臟有無腫瘤轉(zhuǎn)移;腹水的量與性狀；腸粘連、腸梗阻等并發(fā)癥。HE染色鑒定腫瘤及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤、免疫組織化學(xué)檢測腫瘤壞死與血管形成。10%甲醛固定腫瘤，石蠟包埋切片，進行HE染色以確定腫瘤形成或肝內(nèi)轉(zhuǎn)移。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟，乙醇水合后，枸櫞酸鹽溶液高溫修復(fù)抗原。3%的過氧化氫(甲醇稀釋)室溫孵育15 min封閉內(nèi)源性過氧化物酶。用PBS (136 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4,1.76 mmol/L KH2PO4, pH 7.2)稀釋一抗：Caspase 3 (Cell Signaling) 1∶100，CD31 (Santa Cruz) 1∶100。4℃孵育一抗過夜，恢復(fù)至室溫后37℃孵育二抗(DAB試劑盒)30 min。DAB顯色30 s，蘇木素復(fù)染8 min。

七、統(tǒng)計學(xué)分析

結(jié) 果

一、盲腸內(nèi)細胞注射與組織種植術(shù)中比較

盲腸漿膜下細胞注射組手術(shù)時間為(5.14±0.63) min，明顯低于組織種植組的(15.6±4.14) min，P<0.01，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。兩組小鼠術(shù)中均發(fā)生大出血及死亡。

二、盲腸原位瘤成瘤及肝轉(zhuǎn)移情況

盲腸漿膜下細胞注射及組織移植后4周的盲腸原位成瘤率均為100%(5/5)(圖1)。術(shù)后3周觸診動物腹部均可觸及盲腸部位質(zhì)硬結(jié)節(jié)。術(shù)后4周處死小鼠，測量盲腸原位瘤重量。細胞注射組腫瘤重量為(0.69±0.31) g，而組織種植組的腫瘤重量為(0.09±0.06) g，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。細胞注射4周后肝轉(zhuǎn)移率為60% (3/5)，而組織種植組沒有發(fā)生肝轉(zhuǎn)移 (0/5)(P<0.01)。盲腸細胞注射組肝重/體重百分比為 (6.86±1.07)%；明顯高于組織種植組(5.17±0.48)%(P<0.05)。

圖1 小鼠盲腸漿膜下組織種植(A)和細胞注射(B)4周后的盲腸原位瘤、肝臟及脾臟;組織種植和細胞注射4周后小鼠盲腸腫瘤的重量(C)和肝臟/體重百分比(D)

三、小腸漿膜下細胞注射

小腸原位細胞注射后4周成瘤率為100%(5/5)，其中3只小鼠在注射后3周出現(xiàn)體重下降。解剖小鼠發(fā)現(xiàn)4只小鼠發(fā)生腸梗阻(80%)，小腸明顯擴張伴充血水腫。

四、組織學(xué)檢測

種植后4周末處死小鼠，解剖腹部各臟器，我們發(fā)現(xiàn)動物注射部位均已成瘤，如上述。 通過HE染色進一步證實肉眼所見原位瘤及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤(圖2)。HE染色結(jié)果顯示：盲腸漿膜下細胞注射組原位瘤成瘤率100%，肝轉(zhuǎn)移率60%；盲腸腫瘤組織種植組原位瘤成瘤率100%，肝轉(zhuǎn)移率0%；小腸漿膜下注射組原位瘤成瘤率100%，肝轉(zhuǎn)移率0%。幾組小鼠均未見異位種植，未出現(xiàn)腹水。

另外，我們通過免疫組織化學(xué)檢測Casepase 3的表達來評價腫瘤壞死凋亡情況，通過檢測CD31的表達來評估腫瘤中血管形成的情況。我們發(fā)現(xiàn)通過組織種植后形成的盲腸原位瘤中的Casepase 3的表達明顯高于細胞注射組；相反，CD31在組織種植組的原位瘤中的表達明顯低于細胞注射組(圖3)。

五、術(shù)后并發(fā)癥比較

通過大體解剖及小鼠體重觀察，盲腸漿膜下細胞注射組未發(fā)生腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移、腸粘連、腸梗阻等并發(fā)癥；盲腸漿膜下組織種植組術(shù)后腸粘連發(fā)生1例(20%)，但未發(fā)生腸梗阻；而小腸漿膜下細胞注射組未發(fā)生腸粘連，但其發(fā)生腸梗阻(4/5，80%)，并發(fā)癥明顯高于前面兩組(圖4)。

圖2 肝內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤HE染色 肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織采用HE染色證實,A為100倍圖片,可見轉(zhuǎn)移瘤位于門靜脈周圍;B為400倍放大,可見核異型性的結(jié)腸癌細胞

圖3 通過免疫組織化學(xué)染色檢測盲腸原位瘤中Caspase3(A、B)和CD31(C、D)的表達水平(×400)。

圖4 盲腸漿膜下細胞注射(A、C)和小腸漿膜下細胞注射(B、D)后原位瘤成瘤情況及腸管擴張情況 盲腸原位注射后腫瘤在盲腸成瘤,小腸及結(jié)腸管腔正常,無擴張;小腸漿膜下細胞注射后腫瘤原位成瘤,但腫瘤致腸管梗阻,近端小腸明顯擴張伴水腫,遠端結(jié)腸正常

討 論

由于結(jié)腸癌發(fā)病率高且晚期容易出現(xiàn)肝轉(zhuǎn)移而致終末情況[1-2]，結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移動物模型的制作對于研究結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的機制及防治具有重要作用。原位瘤模型在結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移研究中的地位尤為突出。本研究重點就結(jié)腸癌原位瘤模型的接種方式和接種部位進行探討，以求為基礎(chǔ)和臨床研究提供較穩(wěn)定的結(jié)腸癌原位瘤和肝轉(zhuǎn)移模型。我們的研究結(jié)論是：盲腸是結(jié)腸癌原位瘤模型的最佳接種部位，腫瘤細胞注射在結(jié)腸癌原位瘤及肝轉(zhuǎn)移模型中優(yōu)于組織種植。

腫瘤原位種植是腫瘤生物學(xué)研究，尤其是腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移相關(guān)研究中常用的方法[3-4]，包括腫瘤細胞種植和組織種植。結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移即為腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移的常見類型。在過去的30年內(nèi)，世界范圍內(nèi)對乳腺癌、結(jié)直腸癌、肺癌、前列腺癌等[5-6]方面的研究已取得巨大進展，并取得了很好的臨床效果。動物的原位瘤模型是研究腫瘤器官特異性轉(zhuǎn)移的重要方法。在乳腺癌[7-8]，結(jié)腸癌[9-10]等方面的研究，其原位腫瘤動物模型的制作多采用細胞注射或傳統(tǒng)的組織種植。而結(jié)腸癌由于原位瘤須接種到腹腔內(nèi)的空腔臟器，技術(shù)上難度較大，且成功率相對較低，諸如腸梗阻、腹腔感染等并發(fā)癥發(fā)生率也較高。

在原位瘤模型建立中，細胞注射和組織種植各有優(yōu)勢。細胞注射優(yōu)勢在于種植數(shù)量可以控制，可以減少組間差異，使研究標準化；其缺點主要是注射時可能出現(xiàn)滲漏等，導(dǎo)致接種失敗，或者引起異位種植。相反，組織種植位置比較固定，細胞脫落后異位成瘤的機會少；但種植的組織塊個體差異較大，而且存在組織塊缺血壞死等困難。凋亡是抑制腫瘤生長的重要機制，Caspase 3則是檢測凋亡的常用指標[11-13]。另外，腫瘤血管形成在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中也充當重要的角色，研究中常選用CD31免疫組織化學(xué)染色來評價血管形成的程度[14-16]。 我們的結(jié)果顯示，組織種植后形成的原位瘤Caspase 3的表達明顯高于細胞注射組(圖3 A、B)，而CD31代表的腫瘤血管形成在細胞注射組明顯多于組織種植組(圖3 C、D)，這表明組織種植后原位瘤因組織塊缺血等原因引起的凋亡壞死發(fā)生率明顯高于細胞注射組。腫瘤新生血管形成在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移中起到重要作用[17-19]，尤其是在結(jié)腸癌這種主要通過血行轉(zhuǎn)移的腫瘤其作用尤為突出[20-21]。這一機制可以解釋組織種植后原位瘤明顯小于細胞注射組，并且肝轉(zhuǎn)移率也顯著低于細胞注射組。

本研究我們選用5×106細胞數(shù)量來建立皮下成瘤模型，這樣可以在短時間內(nèi)獲得皮下瘤組織。而在原位瘤模型中，我們選用 1×105細胞數(shù)量進行盲腸漿膜下注射，旨在讓腫瘤細胞在盲腸內(nèi)有充足的生長時間，從而增加肝轉(zhuǎn)移的機會。如果注射細胞數(shù)量過多，動物可能因為原位瘤生長過快而衰竭或者死亡，從而沒有機會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移。相反，如果細胞數(shù)量過低，盲腸原位瘤可能無法形成。結(jié)果在注射后4周，肝轉(zhuǎn)移瘤為60%。而這個時間點，原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤都沒有引起小鼠的衰竭，因此還有更長的時間可用于觀察原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤的發(fā)生。我們相信，觀察更長時間，肝轉(zhuǎn)移率可能會提高。另外，為延長觀察時間，可以考慮降低細胞注射的數(shù)量。但是，我們的皮下成瘤模型經(jīng)驗提示小于1×105細胞數(shù)量難以保證100%的成瘤率。我們推斷，小鼠盲腸漿膜下注射1×105的CT26細胞是理想的結(jié)腸癌原位瘤與肝轉(zhuǎn)移模型；觀察原位瘤及肝轉(zhuǎn)移情況可以延長至6周，甚至更長時間，直至小鼠衰竭。

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Establishment of orthotopic colon cancer homografting model

LiLingyun*,ZhangBinhao,ZhangBixiang.

*DepartmentofGeneralSurgery,JingzhouNo. 3People'sHospital,Jingzhou434001,China

ZhangBinhao,Email:bhzhang8@163.com

Objective To compare three common animal models of orthotopic colon cancer, and establish a stable orthotopic colon cancer and liver metastasis model.Methods Mouse colon cancer cell line CT26 cells were used to establish orthotopic colon cancer in subserosa of cecum by direct cell suspension injection or tissue transplantation harvested from a subcutaneous tumor. Orthotopic tumor and liver metastases were examined 4 weeks after injection. In addition, another experiment was performed by cecum injection and intestinal injection, to compare tumor growth and complications after operation.Results Orthotopic tumors were induced in all mice after tissue transplantation or cell injection, but the tumor size in the cell injection group was significantly larger than that in the tissue transplantation group. Two weeks after operation, 60% (3/5) of the mice in the cell injection group presented liver metastasis, while no liver metastasis formed in the tissue transplantation group (P<0.01). Although 100% (5/5) mice developed orthotopic tumors by intestinal injection, 80% (4/5) of the mice presented intestinal obstruction. In contrast, no obstruction was observed in the mice with cecum injection.Conclusions Cell suspension injection is superior to tissue transplantation for establishing the colon cancer liver metastasis animal model. As far as the injection site is concerned, cecum is the best site for orthotopic colon cancer and liver metastasis model, while intestinal injection is excluded owing to high complications.

Colon cancer; Orthotopic xenografting; Animal model

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金(81502524)

434001 湖北荊州，荊州市第三人民醫(yī)院普通外科(李凌云)；華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院肝臟外科中心(李凌云、張斌豪、張必翔)

張斌豪，Email: bhzhang8@163.com

R735.3

A

10.3969/j.issn.1003-5591.2016.04.021

2015-11-10)