制備、純化和鑒定生物活性肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用

劉銘，劉玉環(huán)*，王允圃，阮榕生，樊亮亮，鄒慧芳，涂春明

1(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047) 2( 南昌大學(xué) 生物質(zhì)教育部工程研究中心，江西 南昌，330047) 3(明尼蘇達(dá)大學(xué) 生物制品與生態(tài)工程系，美國 明尼蘇達(dá)，55108)

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制備、純化和鑒定生物活性肽的研究進(jìn)展及應(yīng)用

劉銘1,2，劉玉環(huán)1,2*，王允圃1,2，阮榕生3，樊亮亮1,2，鄒慧芳1,2，涂春明1,2

1(南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌，330047) 2( 南昌大學(xué) 生物質(zhì)教育部工程研究中心，江西 南昌，330047) 3(明尼蘇達(dá)大學(xué) 生物制品與生態(tài)工程系，美國 明尼蘇達(dá)，55108)

摘要近年來，分離純化以及鑒定技術(shù)的發(fā)展加速了生物活性肽的研究進(jìn)程。生物活性肽被定義為具有生物活性，諸如抗氧化、降血壓、抗血栓、減脂、抑菌和抗炎癥功效等的，由2～20個(gè)氨基酸組成的特定肽類的總稱。低毒和高特異性的特點(diǎn)使生物活性肽在食品和醫(yī)藥行業(yè)有著獨(dú)特應(yīng)用價(jià)值。文中重點(diǎn)綜述了生物活性肽的制備，特別是微生物發(fā)酵和酶水解，并分析了各種技術(shù)手段的聯(lián)用和輔助手段的運(yùn)用。為了確定表征生物活性肽的主要方法，對分離、純化和鑒定的方法進(jìn)行了總結(jié)。最后，還對商業(yè)化應(yīng)用中面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行了分析。

關(guān)鍵詞生物活性肽；純化；鑒定；應(yīng)用挑戰(zhàn)

蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)成分之一，是對于人體生長和維持正常生理代謝必不可少的必需氨基酸的來源，同時(shí)也是機(jī)體能量的來源。蛋白質(zhì)能夠影響食品的物理化學(xué)和感官特性，例如溶解性、黏性、凝膠性和乳化穩(wěn)定性。蛋白質(zhì)所具有的特定的生物學(xué)特性使其成為某些功能性食品的成分之一。在體內(nèi)消化系統(tǒng)的作用下，蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生了多種具有不同功能的生物活性肽。其中具有某些特定結(jié)構(gòu)的肽能與生物體內(nèi)的內(nèi)源性生物活性肽相互作用。這些內(nèi)源性生物活性肽具有重要的功能，主要包括體內(nèi)一些重要內(nèi)分泌腺分泌的肽類激素，如促生長激素釋放激素、促甲狀腺素、胸腺分泌的胸腺肽等[1]。

生物活性肽可從動(dòng)植物蛋白中獲得。植物蛋白來源主要是谷物，比如大豆、小麥、大米、燕麥和黑麥。其中，研究最廣泛的是大豆蛋白源生物活性肽，因?yàn)榇蠖故侨粘Ｉ攀持械鞍椎闹匾獊碓?，也是世界各國重要的?jīng)濟(jì)作物。而動(dòng)物蛋白來源的研究也越來越多，其研究重點(diǎn)在肉類蛋白水解液的制備，水解液在保持生物學(xué)活性的同時(shí)也是礦物質(zhì)和維生素的重要來源，還能被用作增味劑和乳化劑[2]。國內(nèi)主要是孫寶國院士在這方面做了大量研究并首次提出了“味食同源”的觀點(diǎn)，開發(fā)出含硫肉味香精等多種食品香精香料。雞蛋和魚類蛋白水解制備的生物活性肽也成為了研究熱點(diǎn)[3]。

近年來，研究發(fā)現(xiàn)了心血管疾病、肥胖、高血壓、糖尿病和癌癥的發(fā)生和日常飲食息息相關(guān)。食療的觀念逐漸深入人心，這大大開拓了功能性食品的市場。功能性食品是在食品本身基本的營養(yǎng)功能之外，能夠提供特定營養(yǎng)保健功能，調(diào)節(jié)一種或多種身體功能的食品[4]。

為了確定生物活性肽的來源，研究了蛋白水解物和產(chǎn)生的步驟。MELLANDER等[5]首次發(fā)現(xiàn)佝僂病新生兒對酪蛋白水解制備得到生物活性肽的攝入提高了骨骼的鈣化。之后，各種具有生物活性的肽類的制備和它們結(jié)構(gòu)鑒定層出不窮。在Biopep肽庫中，已經(jīng)記錄了超過1 200種具有不同生物活性的肽段[6]。

1生物活性肽概述

生物活性肽被定義為具有生物活性，諸如抗氧化、降血壓、抗血栓、減脂，抑菌和抗炎癥功效等的特定肽類的總稱。這些肽有2～20個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量小于6 000 Da，生物活性主要由氨基酸的組成和氨基酸順序決定[7]。生物活性肽的功能性一直是現(xiàn)代食品科技領(lǐng)域研究的前沿?zé)狳c(diǎn)，已發(fā)現(xiàn)這些肽可以替代某些藥物和充當(dāng)食品防腐劑[8-9]。

按照UHLIG等[9]的研究，生物活性肽在制藥領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。在制藥的研制過程中，一些肽對于治療心血管疾病、傳染性疾病和新陳代謝疾病都有良好的作用。這些肽類對于傳統(tǒng)藥物具有很強(qiáng)的競爭優(yōu)勢，主要有以下幾點(diǎn)：它們對于特定組織的特異性極佳，而且在劑量很低的情況下也有效；化學(xué)合成藥物在人體器官中會(huì)發(fā)生富集，而生物活性肽本身就存在于體內(nèi)并能正常代謝、利用和排泄。

抗菌肽作為一類特殊的生物活性肽被用作天然食品防腐劑，其機(jī)制主要是抗菌肽能夠與細(xì)胞膜表面相互作用，使膜的通透性改變，繼而打破原有的滲透壓平衡，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)容物外流，細(xì)菌細(xì)胞死亡[10-11]。此外，生物活性肽還能與多糖和其他類化合物進(jìn)行協(xié)同作用，如冬蟲夏草中的生物活性肽能和多糖、甾醇類化合物等協(xié)同提高機(jī)體的免疫力[12]。而阿膠中生物活性肽和多糖協(xié)同作用提高機(jī)體造血能力，單獨(dú)的生物活性肽作用效果卻并不理想[13]。

生產(chǎn)生物活性肽的工藝可以分為以下幾個(gè)步驟：(1)尋找合適的蛋白來源。(2)通過蛋白源本身含有的蛋白酶，商業(yè)酶制劑和發(fā)酵來水解蛋白產(chǎn)生生物活性肽。(3)得到的粗酶解物進(jìn)行分離純化得到單一的肽。(4)鑒定提純出的肽的氨基酸順序并化學(xué)合成肽的純凈物進(jìn)行生物活性的實(shí)驗(yàn)測定，最普遍是小鼠實(shí)驗(yàn)。生物活性肽的提取和鑒定步驟可以用圖1進(jìn)行表示。

圖1　生物活性肽制備的主要步驟Fig.1　Major processes for obtaining bioactive peptides

在發(fā)酵中，主要是發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)中，能夠水解蛋白的乳酸菌的加入形成了生物活性肽。在發(fā)酵過程中，蛋白逐漸被酶水解，一些生物活性肽逐漸釋放出來。在特定水解步驟使用植物蛋白或者微生物水解蛋白酶，減少了致敏的可能性，提高了消化性，形成了生物活性肽[14]。還有研究表明乳酸菌和酶的聯(lián)用可以比單一方法、發(fā)酵或酶解，產(chǎn)生更多生物活性產(chǎn)物。各種方法的聯(lián)用和發(fā)酵產(chǎn)品中多肽的增加，引起了許多生物活性和功能性的變化[15]。CHEN等[16]按此方法提高了牛乳制備的生物活性肽的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)抑制的活性。

除了上面提到的常見方法之外，多種其他方法的聯(lián)用對生物活性肽的制備也具有良好效果。超濾和納濾是分離和純化生物活性多肽典型手段，根據(jù)分子的大小分離具有特定功效的生物活性肽。掌握這些方法及工藝參數(shù)對于蛋白水解產(chǎn)生特定功能的肽至關(guān)重要。這些參數(shù)既包含蛋白源和特性、化學(xué)結(jié)構(gòu)、pH、季節(jié)性波動(dòng)、酶的制備和純度、基質(zhì)特異性和比活度，也包含能夠保持酶活及其穩(wěn)定性的pH和溫度、操作條件，如酶和底物的濃度、溫度和作用時(shí)間等[17]。此外，多種酶的聯(lián)用及其使用次序也需要具體研究。

2生物活性肽制備的主要步驟

生物活性肽可以直接存在于某些食品中,特別是發(fā)酵食品，但大多數(shù)生物活性肽存在于食物如牛奶、雞蛋、肉、魚、大豆、小麥等蛋白序列中,只有在某種條件下如體內(nèi)胃腸道酶、食品發(fā)酵、水解等釋放出活性片段后才表現(xiàn)出生理活性。

目前生物活性肽制備可從2個(gè)方向進(jìn)行。通過發(fā)酵、酶解等方法把蛋白質(zhì)水解到一定的程度，使水解液中含有一定量的生物活性肽。由于生物活性肽在含量很低時(shí)也有很好的活性作用，使得混合酶解物也具有相當(dāng)?shù)纳锘钚浴６鴮τ谝阎被嵝蛄械纳锘钚噪倪€可采取定向合成法，包括化學(xué)合成，酶法合成和DNA重組技術(shù)等。

對于生產(chǎn)應(yīng)用而言，定向合成法由于在生產(chǎn)設(shè)備上投入巨大以及產(chǎn)能不足，在實(shí)際生產(chǎn)中開展有諸多限制。因而主要還是通過在發(fā)酵和酶解過程控制工藝生產(chǎn)參數(shù)，使得每個(gè)批次的產(chǎn)品在各方面的功能特性指標(biāo)都具有一致性，可重復(fù)生產(chǎn)出需要的產(chǎn)品。

2.1發(fā)酵

發(fā)酵是生產(chǎn)生物活性肽和食品級(jí)水解蛋白的有效方式。在國外，發(fā)酵被應(yīng)用于生產(chǎn)生物活性肽主要和乳制品的生產(chǎn)有關(guān)。乳制品本身就富含能夠生產(chǎn)生物活性肽的前體蛋白。乳酸菌是在自然界和人體消化系統(tǒng)中十分常見的有益菌。它的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)非常復(fù)雜且包含3種主要成分：附著于細(xì)胞壁上能夠提高牛乳中酪蛋白水解成寡肽的蛋白酶；能夠轉(zhuǎn)運(yùn)寡肽到細(xì)胞質(zhì)的特殊轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白；最后能夠把寡肽進(jìn)一步水解成小肽或者游離氨基酸且存在于細(xì)胞內(nèi)的肽酶[18]。乳酸菌的發(fā)酵還能顯著增強(qiáng)發(fā)酵制品的營養(yǎng)特性，風(fēng)味特性和加工性質(zhì)[19]。這些微生物具有極強(qiáng)的蛋白酶生產(chǎn)能力，能夠制備生物活性肽并在發(fā)酵過程中逐漸釋放出來。國內(nèi)外有較多關(guān)于這些微生物的研究，包括保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等，它們具有有效的蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)并且有助于生物活性肽的釋放[20]。除了直接接種所需微生物之外，從乳酸菌中分離出來的蛋白酶也可以成功用于蛋白質(zhì)的水解和生物活性肽的生產(chǎn)。乳制品通過發(fā)酵生產(chǎn)這些生物活性肽類已經(jīng)非常普遍，同樣豆類、大米和小麥的發(fā)酵制品也具有許多生物活性肽[21-22]。像米曲霉和醬油曲霉在中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品生產(chǎn)中有很長的歷史，在保證食品安全性的同時(shí)富含生物活性肽，作用主要為抗氧化和降血壓[23]。而日本傳統(tǒng)發(fā)酵產(chǎn)品中納豆中含有納豆激酶( nattokinase)，納豆激酶是一種具有溶解交聯(lián)纖維蛋白功能的從納豆(natto)中提取純化出的絲氨酸蛋白酶[24]。作為一種抗血栓肽，納豆激酶對血栓有極強(qiáng)的清除能力；JI等[25]研究還發(fā)現(xiàn)，其對大腦缺血的保護(hù)機(jī)制。

微生物發(fā)酵法的原料都富含蛋白質(zhì)，產(chǎn)生的肽類因?yàn)榘l(fā)酵控制而有所不同。發(fā)酵所產(chǎn)生的生物活性肽通過飲食直接進(jìn)入人體內(nèi)消化系統(tǒng)，被人體吸收。發(fā)酵法比起酶法生產(chǎn)生物活性肽更加安全，投入更少，所以微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物活性肽是目前應(yīng)用最廣的方法。

2.2酶解

酶水解是制備生物活性肽中最快、最安全以及最容易控制的技術(shù)，它被用來提高蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)和生物學(xué)特性的同時(shí)也提高了某些副產(chǎn)品的商業(yè)價(jià)值[26]。目前一般采用一種或多種特異性或非特異性的蛋白酶，酶的復(fù)配能夠顯著降低成本。蛋白酶能夠催化蛋白質(zhì)中肽鍵的水解，對底物有一定的特異性，一般是根據(jù)肽鍵周圍氨基酸的順序。這種特異性和水解條件(pH、溫度時(shí)間等)會(huì)影響多肽鏈的長度和氨基酸順序以及游離氨基酸的數(shù)量，最終影響水解物的生物活性[27]。具有特定活性的蛋白酶比如胰蛋白酶和糜蛋白酶和不同非特異性的蛋白酶比如來自于不同菌屬來源的蛋白酶的混合使用能夠減少酶解時(shí)間和得到不同組成和分子質(zhì)量分布的酶解物。通過控制制備的參數(shù)可以穩(wěn)定高效地制備生物活性肽。蛋白酶源有動(dòng)物、植物和微生物。除了商業(yè)酶制劑之外，微生物粗酶也能用來生產(chǎn)生物活性肽。表1列舉了用商業(yè)酶和粗酶制品水解蛋白生產(chǎn)的生物活性肽的情況。

表1　用商業(yè)酶和粗酶制品水解蛋白生產(chǎn)的生物活性肽的情況

酶解制備生物活性肽需要蛋白質(zhì)的預(yù)處理技術(shù)和可控酶解技術(shù)使酶能進(jìn)行高效靶向性的酶解。蛋白質(zhì)的預(yù)處理主要是為了提高酶對蛋白質(zhì)敏感性，包括高壓均質(zhì)和超微細(xì)粉碎技術(shù)、適度變性技術(shù)、亞基解離技術(shù)、接枝技術(shù)、超高壓改性和超聲改性等；蛋白質(zhì)的可控酶解主要是為了控制酶切位點(diǎn)，保證產(chǎn)物一定的分子質(zhì)量分布，包括酶分子修飾和底物蛋白分子修飾。

酶法制備生物活性肽利于穩(wěn)定生產(chǎn)，對于工業(yè)化應(yīng)用非常有利，具有良好的應(yīng)用前景。

3生物活性肽的純化，鑒定的研究進(jìn)展

生物活性肽定向分離純化對于生物活性肽進(jìn)行進(jìn)一步生物活性評(píng)價(jià)和結(jié)構(gòu)分析，繼而確定構(gòu)效關(guān)系至關(guān)重要。定向分離純化技術(shù)主要包括超濾、凝膠色譜、離子交換色譜和高效逆流色譜等。前2種依據(jù)分子質(zhì)量分別進(jìn)行粗分離和精分離，而后2種分別利用帶電性和親疏水性進(jìn)行精分離。表2綜述了生物活性肽的純化和鑒定方法的不同特點(diǎn)，包括它們的原理，優(yōu)點(diǎn)和局限性。

表2　生物活性肽純化和鑒定不同分析手段的主要特點(diǎn)

色譜技術(shù)在其中運(yùn)用最為廣泛，比如高效液相色譜和超高壓液相色譜[6]。超高壓液相色譜在小分子生物活性肽的分離中有很大的優(yōu)勢，提高了普通高效液相色譜分離的生產(chǎn)量，這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)還在于分辨率和靈敏性的提高[36-47]。高效反向液相色譜可以通過疏水性來分離多肽。親水作用液相色譜是親水基質(zhì)分離的有效手段，這種方法基于隨著固定相和溶質(zhì)的極性增加，用于洗脫的主要有機(jī)溶劑的極性減少，與反向液相色譜的原理相反。

LE等[37]利用高效液相色譜法提高了小肽的分離效果并且通過質(zhì)譜分析了具有相似氨基酸序列的肽類的差異。其中高效液相色譜法(HPLC)是分離、純化和鑒定生物活性肽最常見的手段。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和超速離心也常用于結(jié)構(gòu)測定和氨基酸組成分析。此外，超濾可以用來分離所需要分子質(zhì)量和功能活性的生物活性肽。對篩選過的生物活性肽進(jìn)行超濾能提高生物活性。而凝膠色譜法由于具有設(shè)備簡單，操作方便，洗脫條件溫和和層析柱可反復(fù)使用等諸多優(yōu)點(diǎn)，在生物活性肽的分離純化中使用極其廣泛。

近年來，電噴射離子化(ESI)，基質(zhì)輔助激光解析電離質(zhì)譜(MALDI-MS)和質(zhì)譜(MS)逐漸被用來鑒定生物活性肽的結(jié)構(gòu)。質(zhì)譜能夠精確測定分子質(zhì)量和蛋白序列，也能鑒定蛋白的降解產(chǎn)物和研究蛋白質(zhì)的構(gòu)象[46]。分子過濾和分子排阻色譜還能用來提取特定分子質(zhì)量的生物活性肽。各種方法都有其適用性和局限性，在實(shí)際使用中主要根據(jù)研究目的和效果進(jìn)行選擇和方法聯(lián)用。

4生物活性肽制備和商業(yè)化應(yīng)用的主要問題

制備生物活性肽存在諸多問題：(1)大多生物活性肽構(gòu)效關(guān)系不清楚；(2)原料蛋白利用率低，生產(chǎn)成本偏高；(3)生物活性肽有效成分低、功效不突出；(4)蛋白酶對肽鍵的專一性不強(qiáng)，難以靶向酶解；(5)小分子肽的分離純化技術(shù)大多數(shù)難適應(yīng)于工業(yè)化生產(chǎn)；(6)生物活性肽與食品其他成分在加工、儲(chǔ)藏過程中反應(yīng)復(fù)雜，難以控制；(7)生物活性肽在體內(nèi)進(jìn)行消化吸收后作用機(jī)理缺乏研究。

4.1生物活性肽的功能性爭議

PICARIELLO等[48]研究表明，生物活性肽的作用機(jī)理仍然不能用作為理解藥物代謝所必須的藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)來解釋。大多數(shù)關(guān)于食源性的生物活性肽的研究對肽類對胃酶、胰酶和小腸絨毛細(xì)胞酶敏感性的研究不足，而且只有極小的分子濃度才可能進(jìn)入體循環(huán)。雖然一些肽類可能在局部胃腸道中還保持生物活性，但大多數(shù)生物循環(huán)肽在體循環(huán)中已經(jīng)完全失去了生物活性。所以，關(guān)于生物活性肽的體內(nèi)穩(wěn)定性、有效性和利用性和它們的吸收、代謝和排出都很有爭議。

BOUTROU等[49]對在攝入30 g的牛乳酪蛋白和乳清蛋白的健康成年人空腸液分別檢測和測序了356種和146種肽，這些肽的含量都足夠使其生物活性的得到表現(xiàn)，包括β-酪蛋白產(chǎn)生的已知序列生物活性肽的降血壓功能。但是，并未發(fā)現(xiàn)這些寡肽的吸收和生物利用情況。對于像納豆激酶這樣由275個(gè)氨基酸組成的肽，基本不可能進(jìn)入人體血液循環(huán)。由于諸如此類研究都采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的方法，包括進(jìn)行生物活性肽注射和體外凝血實(shí)驗(yàn)等，而人體主要通過膳食途徑攝入這些生物活性肽，關(guān)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果是否適用于人體，效果是否顯著的研究并不充分。

從原理上看來，生物活性肽在人體內(nèi)要發(fā)揮一定功效是很難實(shí)現(xiàn)的。一方面進(jìn)入消化系統(tǒng)被酶分解成更小的肽和氨基酸;另一方面通過消化道壁乃至進(jìn)入人體血液循環(huán)很難保證一定的含量來發(fā)揮其生物活性。此外，還可能直接被免疫系統(tǒng)識(shí)別為外來異物，引起免疫反應(yīng)。有學(xué)者通過肛門給蛋白類藥物，想通過直腸吸收藥物以避開消化分解的可能，但也未在血液中檢查到目標(biāo)物。

所以生物活性肽在人體中的生物活性，所起的效果還存在著諸多問題，這也是制約生物活性肽商業(yè)化應(yīng)用最大的瓶頸。而且也缺乏足夠的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)特別是患者服用效果的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來證明生物活性肽的有效性。

4.2生物活性肽的風(fēng)味問題

民以食為天，食以味為先。對于食品而言，最大的影響因素就是風(fēng)味。沒有良好的風(fēng)味，消費(fèi)者是不愿意為新產(chǎn)品買單，特別是在功效還不明確的情況下。

TEMUSSI[50]發(fā)現(xiàn)，在考慮一類肽的許多重要的生物功能性時(shí)，往往會(huì)忽略肽的風(fēng)味。而多種的肽類產(chǎn)品的風(fēng)味卻極其苦澀，所以需要合適的配方與其他成分如可可粉和阿斯巴甜，或果糖、果膠等的加入調(diào)配來提升風(fēng)味和色澤。同時(shí)還需要風(fēng)味提升技術(shù)和穩(wěn)態(tài)保護(hù)技術(shù)。

生物活性肽的應(yīng)用還有諸多其他的問題。表3列舉相關(guān)的問題和解決方法。

表3　生物活性肽商業(yè)化的問題與挑戰(zhàn)和對應(yīng)的解決方法與研究需要

當(dāng)今世界，非傳染性疾病的流行突顯了生物活性肽作為功能膳食原料的研究價(jià)值。然而，大規(guī)模的生物活性肽的商品化應(yīng)用仍然面臨諸多技術(shù)和工藝上的問題。首先，生物活性肽的功效性需要大量的臨床療效實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來證明；其次，對于生產(chǎn)條件的控制和生物活性肽制劑在人體內(nèi)的活性保護(hù)需要嚴(yán)格的操作保證和穩(wěn)態(tài)保護(hù)技術(shù)；最后，對于產(chǎn)品風(fēng)味和顏色需要一些食品添加劑的調(diào)配，但是對于生物活性肽和其他食品組分的反應(yīng)還需要進(jìn)一步的研究。

作為食療，生物活性肽的攝入具有許多藥物所沒有的優(yōu)勢，生物活性肽產(chǎn)業(yè)機(jī)遇和挑戰(zhàn)并存。

參考文獻(xiàn)

[1]趙謀明, 任嬌艷. 食源性生物活性肽結(jié)構(gòu)特征與生理活性的研究現(xiàn)狀與趨勢[J]. 中國食品學(xué)報(bào), 2011, (9): 69-81.

[2]LAFARGA T, HAYES M. Bioactive peptides from meat muscle and by-products: generation, functionality and application as functional ingredients[J]. Meat Sci, 2014, 98(2): 227-239.

[3]SAKANAKA S, TACHIBANA Y, ISHIHARA N, et al. Antioxidant activity of egg-yolk protein hydrolysates in a linoleic acid oxidation system[J]. Food Chem, 2004, 86(1): 99-103.

[4]王偉軍, 李延華, 于俊林, 等. 功能性食品的研究現(xiàn)狀及發(fā)展趨勢[J]. 通化師范學(xué)院學(xué)報(bào), 2008(10): 37-39.

[5]MELLANDER O. The physiological importance of the casein phosphopeptide calcium salts. 2. Peroral calcium dosage of infants. Some aspects of the pathogenesis of rickets[J]. Acta Societatis Botanicorum Poloniae, 1950, 55(5/6): 247-255.

[6]SINGH B P, VIJ S, HATI S. Functional significance of bioactive peptides derived from soybean[J]. Peptides, 2014, 54: 171-179.

[7]MORA L, REIG M, TOLDRF. Bioactive peptides generated from meat industry by-products[J]. Food Research International, 2014, 65: 344-349.

[8]HONG F, MING L, YI S, et al. The antihypertensive effect of peptides: A novel alternative to drugs?[J]. Peptides, 2008, 29(6): 1 062-1 071.

[9]UHLIG T, KYPRIANOU T, MARTINELLI F G, et al. The emergence of peptides in the pharmaceutical business: From exploration to exploitation[J]. EuPA Open Proteomics, 2014, 4: 58-69.

[10]BRIJESH K P, SAURABH S, MANISH S, et al. Inducing toxicity by introducing a leucine-zipper-like motif in frog antimicrobial peptide, magainin 2[J]. Biochemical journal, 2011, 436(3): 609-620.

[11]苗建銀, 柯暢, 郭浩賢, 等. 抗菌肽的提取分離及抑菌機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014(1): 233-240.

[12]王尊生, 俞永信, 袁勤生. 蟲草屬真菌的生物活性成分[J]. 中草藥, 2004(10): 130-133.

[13]LIU M, TAN H, ZHANG X, et al. Hematopoietic effects and mechanisms of Fufang Ejiao Jiang on radiotherapy and chemotherapy-induced myelosuppressed mice[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2014, 152(3): 575-584.

[14]KORHONEN H. Milk-derived bioactive peptides: From science to applications[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1(2): 177-187.

[15]HAFEEZ Z, CAKIR-KIEFER C, ROUX E, et al. Strategies of producing bioactive peptides from milk proteins to functionalize fermented milk products[J]. Food Research International, 2014, 63: 71-80.

[16]CHEN G W, TSAI J S, SUN P B. Purification of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides and antihypertensive effect of milk produced by protease-facilitated lactic fermentation[J]. International Dairy Journal, 2007, 17(6): 641-647.

[17]LI-CHAN E C Y. Bioactive peptides and protein hydrolysates: research trends and challenges for application as nutraceuticals and functional food ingredients[J]. Current Opinion in Food Science, 2015, 1: 28-37.

[19]LOPEZ-KLEINE L, MONNET V 2011. Lactic Acid Bacteria | Proteolytic Systems[M] //JW Fuquay, Encyclopedia of Dairy Sciences (Second Edition). San Diego:Academic Press,2011:49-55.

[21]HATI S, VIJ S, MANDAL S, et al. α-Galactosidase activity and oligosaccharides utilization by lactobacilli during fermentation of soy milk[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2014, 38(3): 1 065-1 071.

[22]NAKAHARA T, SANO A, YAMAGUCHI H, et al. Antihypertensive effect of peptide-enriched soy sauce-like seasoning and identification of its angiotensin I-converting enzyme inhibitory substances[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010, 58(2): 821-827.

[23]GIRI A, OSAKO K, OKAMOTO A, et al. Antioxidative properties of aqueous and aroma extracts of squid miso prepared with Aspergillus oryzae-inoculated koji[J]. Food Research International, 2011, 44(1): 317-325.

[24]SUMI H, HAMADA H, TSUSHIMA H, et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese Natto; a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia, 1987, 43(10): 1 110-1 111.

[25]JI H, YU L, LIU K, et al. Mechanisms of nattokinase in protection of cerebral ischemia[J]. Eur J Pharmacol, 2014, 745(1-3): 144-151.

[26]LUNA-VITAL D A, MOJICA L, GONZLEZ DE MEJA E, et al. Biological potential of protein hydrolysates and peptides from common bean (PhaseolusvulgarisL.): A review[J]. Food Research International,2015,76:39-50.

[27]SAMARANAYAKA A G P, LI-CHAN E C Y. Food-derived peptidic antioxidants: A review of their production, assessment, and potential applications[J]. Journal of Functional Foods, 2011, 3(4): 229-254.

[28]GONZALEZ DE MEJIA E, MARTINEZ-VILLALUENGA C, ROMAN M, et al. Fatty acid synthase and in vitro adipogenic response of human adipocytes inhibited by α and α′ subunits of soybean β-conglycinin hydrolysates[J]. Food Chem, 2010, 119(4): 1 571-1 577.

[29]TSOU M J, KAO F J, TSENG C K, et al. Enhancing the anti-adipogenic activity of soy protein by limited hydrolysis with Flavourzyme and ultrafiltration[J]. Food Chem, 2010, 122(1): 243-248.

[30]TSOU M J, LIN W T, LU H C, et al. The effect of limited hydrolysis with Neutrase and ultrafiltration on the anti-adipogenic activity of soy protein[J]. Process Biochemistry, 2010, 45(2): 217-222.

[31]ADJE E, BALTI R, KOUACH M, et al. α 67-106 of bovine hemoglobin: a new family of antimicrobial and angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides[J]. European Food Research and Technology, 2011, 232(4): 637-646.

[32]OSEGUERA-TOLEDO M E, DE MEJIA E G, DIA V P, et al. Common bean (PhaseolusvulgarisL.) hydrolysates inhibit inflammation in LPS-induced macrophages through suppression of NF-κB pathways[J]. Food Chem, 2011, 127(3): 1 175-1 185.

[33]NASRI R, AMOR I B, BOUGATEF A, et al. Anticoagulant activities of goby muscle protein hydrolysates[J]. Food Chem, 2012, 133(3): 835-841.

[34]AHN C B, JE J Y, CHO Y S. Antioxidant and anti-inflammatory peptide fraction from salmon byproduct protein hydrolysates by peptic hydrolysis[J]. Food Research International, 2012, 49(1): 92-98.

[35]BALTI R, BOUGATEF A, SILA A, et al. Nine novel angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory peptides from cuttlefish (Sepiaofficinalis) muscle protein hydrolysates and antihypertensive effect of the potent active peptide in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chem, 2015, 170: 519-525.

[36]EVERLEY R A, CROLEY T R. Ultra-performance liquid chromatography/mass spectrometry of intact proteins[J]. Journal of Chromatography A, 2008, 1 192(2): 239-247.

[37]LE MAUX S, NONGONIERMA A B, FITZGERALD R J. Improved short peptide identification using HILIC-MS/MS: Retention time prediction model based on the impact of amino acid position in the peptide sequence[J]. Food Chem, 2015, 173: 847-854.

[38]ORTIZ-MARTINEZ M, WINKLER R, GARCA-LARA S. Preventive and therapeutic potential of peptides from cereals against cancer[J]. J Proteomics, 2014, 111: 165-183.

[39]BOUHALLAB S, HENRY G, BOSCHETTI E. Separation of small cationic bioactive peptides by strong ion-exchange chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 1996, 724(1-2): 137-145.

[40]ISSAQ H J, CONRADS T P, JANINI G M, et al. Methods for fractionation, separation and profiling of proteins and peptides[J]. Electrophoresis, 2002, 23(17): 3 048-3 061.

[41]MORA L, REIG M, TOLDRF. Bioactive peptides generated from meat industry by-products[J]. Food Research International, 2014, 65: 344-349.

[42]FEKETE S, BECK A, VEUTHEY J L, et al. Theory and practice of size exclusion chromatography for the analysis of protein aggregates[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014, 101: 161-173.

[43]ULIYANCHENKO E, SCHOENMAKERS P J, VAN DER WAL S. Fast and efficient size-based separations of polymers using ultra-high-pressure liquid chromatography[J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218(11): 1 509-1 518.

[44]GRAY N, HEATON J, MUSENGA A, et al. Comparison of reversed-phase and hydrophilic interaction liquid chromatography for the quantification of ephedrines using medium-resolution accurate mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A, 2013, 1 289: 37-46.

[45]MANO N, GOTO J. Biomedical and biological mass spectrometry[J]. Analytical Sciences, 2003, 19(1): 3-14.

[46]DEL MAR CONTRERAS M, LPEZ-EXPSITO I, HERNNDEZ-LEDESMA B, et al. Application of mass spectrometry to the characterization and quantification of food-derived bioactive peptides[J]. Journal of AOAC International, 2008, 91(4): 981-994.

[47]SARMADI B H, ISMAIL A. Antioxidative peptides from food proteins: a review[J]. Peptides, 2010, 31(10): 1 949-1 956.

[48]PICARIELLO G, MAMONE G, NITRIDE C, et al. Protein digestomics: Integrated platforms to study food-protein digestion and derived functional and active peptides[J]. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 2013, 52: 120-134.

[49]BOUTROU R, GAUDICHON C, DUPONT D, et al. Sequential release of milk protein-derived bioactive peptides in the jejunum in healthy humans[J]. The American journal of clinical nutrition, 2013, 97(6): 1 314-1 323.

[50]DIA V P, TORRES S, DE LUMEN B O, et al. Presence of lunasin in plasma of men after soy protein consumption[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2009, 57(4): 1 260-1 266.

Research progress on production, purification and identification of bioactive peptides and its challenges in application

LIU Ming1,2， LIU Yu-huan1,2*， WANG Yun-pu1,2，RUAN Rong-sheng3， FAN Liang-liang1,2， ZOU Hui-fang1,2， TU Chun-ming1,2

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China) 2(Engineering Research Center for Biomass Conversion, Ministry of Education, Nanchang University, Nanchang 330047, China) 3(Center for Biorefining and Dept. of Bioproducts and Biosystems Engineering, University of Minnesota, Paul, 55108, USA)

ABSTRACTRecent advances in purification and identification technique of biologically active peptides created a great interest of research. Bioactive peptides can be defined as specific portions of peptides with 2 to 20 amino acids that have desirable biological activities, including antioxidant, antihypertensive, antithrombotic, antiadipogenic, antimicrobial and anti-inflammatory effects. Specific characteristics, including low toxicity and high specificity, make these molecules of particular interest in the field of food and pharmaceutical industries. This review focuses on the production of bioactive peptides, with special emphasis on fermentation and enzymatic hydrolysis. The combination of different technologies and the use of auxiliary processes are also addressed. A survey of isolation, purification and peptide characterization methods helped to choose the best techniques to determine the structures of bioactive peptides. Finally, research trends and challenges for application are discussed.

Key wordsbioactive peptides; purification; identification; challenges for application

收稿日期：2015-07-30，改回日期：2015-10-14

基金項(xiàng)目：食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自由探索課題 (No.SKLF-ZZB-201312 )； 科技部國際合作項(xiàng)目(No.2014DFA61040)；江西省重大專項(xiàng)課題(No.20124ABG04103)資助;江西省研究生創(chuàng)新專項(xiàng)資金資助

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201604045

第一作者：碩士研究生(劉玉環(huán)研究員為通訊作者,)。