纖維素酶對汽爆麥稈酶解的動(dòng)力學(xué)研究

肖玲玲，湯金婷，龔大春

(1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)，湖北 宜昌 443002)

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纖維素酶對汽爆麥稈酶解的動(dòng)力學(xué)研究

肖玲玲1，湯金婷2，龔大春2

(1.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北 宜昌 443002；2.三峽大學(xué)，湖北 宜昌 443002)

摘要：測定了不同條件下纖維素酶對汽爆麥稈酶解的反應(yīng)速率曲線，得到最大反應(yīng)速率vmax及米氏常數(shù)Km，并通過動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化來研究酶解機(jī)制。結(jié)果表明，添加金屬離子、表面活性劑和含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉酶液都有助于酶解速率的提高。

關(guān)鍵詞：纖維素酶；汽爆麥稈；酶解；動(dòng)力學(xué)

生物質(zhì)是地球上最豐富的可再生資源，其中蘊(yùn)含著大量的可轉(zhuǎn)化為能源與生化產(chǎn)品的纖維素原料。隨著人們對纖維素原料開發(fā)與綜合利用研究的逐步深入，將纖維素通過纖維素酶水解為小分子葡萄糖已成為其深度開發(fā)的共有途徑，而對纖維素酶酶促反應(yīng)機(jī)理的研究也日益受到人們的關(guān)注[1]。

纖維素水解反應(yīng)為非均相反應(yīng)，由于底物的不溶性，纖維素酶需首先擴(kuò)散到纖維表面或內(nèi)部，與纖維素分子產(chǎn)生吸附作用，進(jìn)而才能水解纖維素，因此，纖維素對纖維素酶的可及性是決定水解起始速率的關(guān)鍵因素。研究表明，纖維素酶的吸附與解吸基本處于動(dòng)態(tài)平衡，這是Michaelis-Menten模型的使用基礎(chǔ)[2-4]。

纖維素的酶解速率很低并受多種因素的影響。作者在此測定了不同條件下纖維素酶對汽爆麥稈酶解的反應(yīng)速率曲線，通過動(dòng)力學(xué)研究揭示纖維素酶的酶解機(jī)制，擬為纖維素酶酶解纖維素類底物提供一定的理論與技術(shù)支撐。

1實(shí)驗(yàn)

1.1材料

汽爆麥稈(纖維素52.62%，半纖維素21.83%，木質(zhì)素6.62%，水分8.60%)，安琪酵母股份有限公司；纖維素酶ZSS-600，山東澤生生物科技有限公司；黑曲霉酶液，三峽大學(xué)艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所[5]。

1.2方法

1.2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別吸取一定量的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液、緩沖溶液和DNS試劑于試管中，混勻。置于沸水浴中反應(yīng)10min，取出速冷，定容至25mL，測定540nm處吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸方程。

1.2.2纖維素酶酶活的測定

將固態(tài)酶或酶液稀釋一定倍數(shù)，吸取0.5mL加入相應(yīng)底物及緩沖溶液，混勻，于50 ℃水浴反應(yīng)30min后，迅速加入DNS試劑1.0mL，沸水浴中加熱10min，取出，測定540nm處吸光度，依據(jù)葡萄糖線性回歸方程即可計(jì)算還原糖濃度。

酶活定義：在50 ℃、pH值為4.8的條件下，每分鐘從底物中釋放1μmol還原糖所需要的酶量為一個(gè)酶活單位(U)。

1.2.3還原糖濃度的測定

采用DNS法。吸取0.5mL待測糖液、1.5mL緩沖溶液和1mLDNS試劑于試管中，混勻。置于沸水浴中反應(yīng)10min，取出速冷，定容至25mL，測定540nm處吸光度，通過葡萄糖線性回歸方程計(jì)算還原糖濃度。

2結(jié)果與討論

2.1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

圖1　葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

從圖1可以看出，葡萄糖濃度在一定范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好，擬合線性方程為y=0.0169x-0.018，R2=0.9991。

2.2纖維素酶裝載量對初始速率的影響

在500 mL具塞錐形瓶中加入裝載量[U·(g纖維素)-1]分別為10、20、30、40的纖維素酶，然后加入10.0%(質(zhì)量濃度，下同)的汽爆麥稈，在50 ℃、120 r·min-1條件下酶解，產(chǎn)物中還原糖濃度(p)隨時(shí)間(t)的變化曲線(p-t曲線)如圖2所示。

從圖2可以看出，水解反應(yīng)初始階段還原糖濃度迅速升高，但隨著水解的進(jìn)行，升幅趨緩。這可能是因?yàn)椋a(chǎn)物(葡萄糖和/或纖維二糖)的增加抑制了酶的活性；酶因死吸附或剪切力等因素而失活；底物不定形區(qū)水解后，定形區(qū)暴露，不易降解。

在反應(yīng)開始的前120 min，p-t曲線呈相關(guān)度較高的直線，以其斜率表示動(dòng)力學(xué)中的水解初始速率(v0)，初期水解方程及初始速率如表1所示。

圖2　不同纖維素酶裝載量下的p-t曲線

表1

不同纖維素酶裝載量下的初期水解方程及初始速率

Tab.1

Initial hydrolysis equations and v0 under

注：底物濃度為10.0%。

從表1可知，水解初始速率v0隨酶裝載量的增加而升高，但v0的升幅隨酶裝載量的增加而減小?？赡苁且?yàn)?，纖維素底物表面的吸附位點(diǎn)有限，酶與底物的吸附受到限制，限制了反應(yīng)速率的提高；也可能是因?yàn)?，纖維素底物與酶吸附后產(chǎn)生位阻，從而干擾臨近位點(diǎn)的吸附。因此，即使底物表面的位點(diǎn)未吸附完全也會(huì)出現(xiàn)初始速率隨酶裝載量的增加而升幅減小的現(xiàn)象。

2.3底物濃度對初始速率的影響

在500 mL具塞錐形瓶中加入裝載量為10 U·(g纖維素)-1的纖維素酶，再分別加入5.0%、7.5%、10.0%、12.5%的汽爆麥稈，在50 ℃、120 r·min-1條件下的p-t曲線如圖3所示。

圖3　不同底物濃度下的p-t曲線

從圖3可以看出，隨著底物濃度的增加，還原糖濃度升高，但兩者的關(guān)系并不成比例。可能是因?yàn)?，增加底物濃度，增大了傳質(zhì)阻礙，從而影響了酶與底物有效結(jié)合；同時(shí)，底物濃度的增加也會(huì)導(dǎo)致底物和產(chǎn)物抑制的加劇。

以反應(yīng)開始的前120 min的反應(yīng)速率作為水解初始速率，初期水解方程及初始速率如表2所示。

表2

不同底物濃度下的初期水解方程及初始速率

Tab.2

Initial hydrolysis equations and v0 under

注：酶裝載量為10 U·(g纖維素)-1。

根據(jù)不同底物濃度下的初始速率，作1/v-1/[S]([S]為底物濃度)圖，如圖4所示。

圖4　不同底物濃度下的1/v-1/[S]線性擬合曲線

2.4添加劑對初始速率的影響

在500mL具塞錐形瓶中加入裝載量為10U·(g纖維素)-1的纖維素酶，再分別加入5.0%、7.5%、10.0%、12.5%的汽爆麥稈，同時(shí)添加一定量的金屬離子(Mg2+1mmol·L-1、Co2+1mmol·L-1、Fe3+10mmol·L-1)與表面活性劑(PEG2000 1g·L-1、Tween-80 1g·L-1)，在50 ℃、120r·min-1條件下的p-t曲線如圖5所示。

由圖5可以看出，金屬離子和表面活性劑的加入可以明顯提高酶解反應(yīng)初始速率。

圖5　不同底物濃度下添加金屬離子(a)、表面活性劑(b)

以反應(yīng)開始的前120 min的反應(yīng)速率作為水解初始速率，初期水解方程及初始速率如表3所示。

以1/v-1/[S]作圖，如圖6所示。

對圖6a進(jìn)行線性擬合：y=0.711x+1.976(R=0.993)，根據(jù)變形的米氏方程得到：Km=0.360 g·L-1，vmax=0.506 g·L-1·min-1。

對圖6b進(jìn)行線性擬合：y=0.539x+2.097(R=0.998)，根據(jù)變形的米氏方程得到：Km=0.257 g·L-1，vmax=0.477 g·L-1·min-1。

對圖6c進(jìn)行線性擬合：y=0.597x+0.903(R=0.998)，根據(jù)變形的米氏方程得到：Km=0.660 g·L-1，vmax=1.107 g·L-1·min-1。

2.5黑曲霉酶液對初始速率的影響

在500 mL具塞錐形瓶中加入裝載量為10 U·(g纖維素)-1的纖維素酶、含0.9 U·mL-1β-葡萄糖苷酶的黑曲霉酶液，再分別加入4%、6%、8%、10%、12%的汽爆麥稈及一定量的金屬離子和表面活性劑，在50 ℃、120 r·min-1條件下的p-t曲線如圖7所示。

表3不同底物濃度及添加劑下的初期水解方程及初始速率

Tab.3

Initial hydrolysis equations and v0 under different

圖6　不同底物濃度及添加劑下的1/v-1/[S]線性擬合曲線

圖7　不同底物濃度下，添加含β-葡萄糖苷酶

以反應(yīng)開始的前120 min的反應(yīng)速率作為水解初始速率，初期水解方程及初始速率如表4所示。

表4

不同底物濃度下添加含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉

酶液的初期水解方程及初始速率

Tab.4

Initial hydrolysis equations and v0 for addition

注：纖維素酶裝載量為10 U·(g纖維素)-1。

以1/v-1/[S]作圖，如圖8所示。

圖8　不同底物濃度下，添加含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉

對圖8進(jìn)行線性擬合：y=0.750x+1.174(R=0.984)，根據(jù)變形的米氏方程得到：Km=1.135 g·L-1，vmax=0.852 g·L-1·min-1。

2.6動(dòng)力學(xué)參數(shù)討論

比較不同條件下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，如表5所示。

表5

不同條件下的動(dòng)力學(xué)參數(shù)

Tab.5

Kinetic parameters under different conditions

注：空白為裝載量為10 U·(g纖維素)-1的纖維素酶；A為金屬離子(Mg2+1 mmol·L-1，Co2+1 mmol·L-1，F(xiàn)e3+10 mmol·L-1)；B為表面活性劑(PEG2000 1 g·L-1，Tween-80 1 g·L-1)；C為含0.9 U·mL-1β-葡萄糖苷酶的黑曲霉酶液。

由表5可以看出，加入金屬離子、表面活性劑及含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉酶液均有助于酶解速率的提高，米氏常數(shù)Km也有所增大。

加入金屬離子、表面活性劑后，v0、vmax、Km均增大，1/Km減小，即酶與底物親和力減弱，這與初始反應(yīng)速率v0和最大反應(yīng)速率vmax提高的現(xiàn)象存在矛盾。因此，推斷金屬離子、表面活性劑主要是改變了酶與底物作用的環(huán)境，更有利于酶解中間產(chǎn)物(ES)的結(jié)合和離解，從而表現(xiàn)出親和力減弱的假象[6]。

添加含有β-葡萄糖苷酶的黑曲霉酶液后，Km相應(yīng)增大。這可能是因?yàn)椋环矫?，加入?葡萄糖苷酶后，酶解環(huán)境有了較大的變化，改變了原有的酶組成(所添加的黑曲霉酶液中有少量的內(nèi)切酶和外切酶)；另一方面，酶解中間產(chǎn)物在β-葡萄糖苷酶的作用下及時(shí)水解，而使中間產(chǎn)物的濃度降低，促進(jìn)酶解反應(yīng)向正反應(yīng)方向進(jìn)行，利于酶解中間產(chǎn)物的解離，導(dǎo)致水解速率的提高[7]。

3結(jié)論

通過對不同條件下汽爆麥稈酶解動(dòng)力學(xué)的研究，得到了相應(yīng)的反應(yīng)速率曲線、最大反應(yīng)速率與米氏常數(shù)。在底物濃度一定、纖維素酶裝載量不同的條件下，水解初始速率隨酶裝載量的增加而升高，但其升幅隨酶裝載量的增加而減?。辉诶w維素酶裝載量一定、底物濃度不同的條件下，水解初始速率隨底物濃度的增加而升高，但兩者關(guān)系并不成比例；在纖維素酶裝載量一定、底物濃度不同的條件下，加入金屬離子、表面活性劑及含β-葡萄糖苷酶的黑曲霉酶液均有助于水解初始速率及最大反應(yīng)速率的提高，米氏常數(shù)也相應(yīng)增大。

參考文獻(xiàn)：

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Kinetics of Enzymolysis of Steam-Exploded Straw by Cellulase

XIAO Ling-ling1，TANG Jin-ting2，GONG Da-chun2

(1.HubeiThreeGorgesPolytechnic,Yichang443002,China;2.ThreeGorgesUniversity,Yichang443002,China)

Abstract：Reaction rate curves of enzymolysis of steam-exploded straw by cellulase at different conditions were determined,and the maximum reaction rate vmaxand Michaelis constant Km were obtained.Enzymolysis mechanism was studied by changing of kinetic parameters.The results showed that addition of metal ions,surfactant or fluid of Aspergillus niger containing β-glucosidase was benefit to increasing enzymolysis rate.

Keywords：cellulase;steam-exploded straw;enzymolysis;kinetics

中圖分類號(hào)：TQ 033O 643.11

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-5425(2016)04-0046-05

doi：10.3969/j.issn.1672-5425.2016.04.012

作者簡介：肖玲玲(1983-)，女，湖南常德人，講師，研究方向：生物化工，E-mail:xll_tgc@163.com。

收稿日期：2016-01-06