11β-類固醇脫氫酶-2啟動子區(qū)甲基化與原發(fā)性高血壓關系初探

王述琦,劉麗秋,劉海娜

(1.青島大學附屬青島市市立醫(yī)院 a干?？?b超聲科,山東 青島266011；2.青島大學附屬醫(yī)院 腎內科)

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11β-類固醇脫氫酶-2啟動子區(qū)甲基化與原發(fā)性高血壓關系初探

王述琦1a,劉麗秋2*,劉海娜1b

(1.青島大學附屬青島市市立醫(yī)院 a干保科;b超聲科,山東 青島266011；2.青島大學附屬醫(yī)院 腎內科)

摘要：目的通過11β- 類固醇脫氫酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 ,11β-HSD-2)基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率的測定,探討原發(fā)性高血壓可能的發(fā)病機制。方法選取未經治療的原發(fā)性高血壓患者64例以及正常對照組30例,Sequenom MassArray質譜法檢測11β-HSD-2基因啟動子區(qū)“-101到461”的563個堿基序列的甲基化發(fā)生率。結果原發(fā)性高血壓組甲基化發(fā)生率高且差異有統(tǒng)計學意義,CpG位點如下：CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65、CpG_72。t值分別為-5.42,-3.17,-2.84,-2.32和-2.32,P<0.05。CpG_7、8、CpG_9位于核心啟動子區(qū)。結論原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2基因啟動子區(qū)存在高甲基化發(fā)生率位點。

關鍵詞：11β-類固醇脫氫酶-2;原發(fā)性高血壓;啟動子區(qū);甲基化

(ChinJLabDiagn,2016,20:0570)

我國大約有2億高血壓患者,且發(fā)病率逐年上升[1,2]。近年來研究[3-6]發(fā)現DNA甲基化修飾與高血壓發(fā)病密切相關。已有研究證實11β- 類固醇脫氫酶-2(11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2,11β-HSD-2)[7]參與高血壓的發(fā)病[8,9]。高血壓患者11β-HSD-2基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率的測定國內未見報道。本研究探討11β-HSD-2基因啟動子區(qū)甲基化與原發(fā)性高血壓的關系。

1資料與方法

1.1研究對象收集64例未經藥物治療的原發(fā)性高血壓(符合JNCVⅡ及歐洲高血壓指南)患者作為觀察組,其中男52例,女12例,平均年齡(46.5±9.4)歲。30例健康查體者作為正常對照組,其中男24例,女6例,平均年齡(44.4±8.2)歲。排除標準：所有觀察者均已排除正在使用降壓藥物者、繼發(fā)性高血壓、腎功能不全、肝硬化、甲狀腺功能亢進、糖尿病、冠心病、心臟瓣膜病、腫瘤、自體免疫病、過量飲酒及其它慢性疾病。2組患者一般資料及體質量指數具有可比性,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

1.2檢測項目生化全套、甲功及血、尿常規(guī)、心電圖、胸X線片,測定11β-HSD-2基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率測定。

1.3主要實驗儀器DYY-Ⅲ型電泳槽(北京市六一儀器廠),FD201 穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京通用分析儀器廠),Tanon-3500 全自動數碼凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司),全波長紫外/可見光掃描分光光度計NanoDrop-2000(美國 NanoDrop公司),DNA濃縮儀(Eppendorf,Concentractor5301),K960熱循環(huán)儀(杭州晶格科學儀器有限公司), MassARRAY系統(tǒng)(Sequenom公司),TF-0384型384孔PCR板(ABGene公司), Veriti 384 well PCR儀(AB公司)。

1.4實驗試劑及耗材PureGene DNA抽提試劑盒EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO), 樣本亞硫酸鹽處理用試劑盒 EZ DNA Methylation-Gold Kit (ZYMO),一套 10 μM 擴增引物(上海賽百勝基因技術有限公司合成),25 mM dNTP 混合物(Sequenom 公司),5 U/μL 熱啟動 Taq 酶(Sequenom 公司),SAP 緩沖液(Sequenom 公司),SAP 酶(1.7 U/μL) (Sequenom 公司),T Cleavage Mix(Sequenom 公司),100 mM DTT(Sequenom 公司),T7 RNA & DNA Polymerase(Sequenom 公司),RNase A(Sequenom 公司),Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ(大連寶生物工程公司),溴酚藍(上海生工生物工程公司),瓊脂糖(Agarose),(上海生工生物工程公司)。

1.5引物設計和合成引物信息：5’端引物序列：aggaagagagGGGAGAGAAGTGAAGGAAAGTT,3’端引物序列 :cagtaatacgactcactatagggagaaggctTCAATCCTATTAAATATCCAATCCC。查詢并確定待測的基因序列,將目的序列輸入到EpiDesigner軟件進行引物設計。將目的序列粘貼到PasteSequence中,根據軟件運算結果,選擇并確定合適的引物方案,合成引物,每條50D。由華大基因科技有限公司完成。

1.6外周血DNA的提取抽取高血壓患者和正常對照組觀察者清晨空腹靜脈血3 ml,按照PureGene DNA抽提試劑盒說明書方法提取外周血DNA。

1.7Sequenom MassARRAY甲基化檢測11β-HSD-2基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率。由華大基因科技有限公司完成。

1.8統(tǒng)計學方法所有數據均采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件包統(tǒng)計。將甲基化發(fā)生率做對數轉換使之成正態(tài)分布,對每一個檢測位點分別做高血壓組和正常對照組的t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

入選94例(原發(fā)性高血壓患者64例,正常觀察者30例),檢測11β-HSD-2基因啟動子區(qū) “-101到461”的一段包含563個堿基序列的基因片段,其中核心啟動子位于距轉錄起始位點“-52到7”的堿基序列,其中包含CpG_7、8、9三個甲基化位點。甲基化發(fā)生有顯著性差異的CpG位點如下：CpG_7、8 位于“-20到-14”的位置(t=-5.42,P<0.05)。

CpG_9 位于“-8到-9”的位置(t=-3.17,P<0.05)。CpG_62、63、64位于“373到378”的位置(t=-2.84,P<0.05)。CpG_65位于“390到391”的位置(t=-2.32,P<0.05)。CpG_72位于“430到431”的位置(t=-2.32,P<0.05)。凝膠電泳結果分別如下圖1。

圖1　凝膠電泳結果

3討論

近年來DNA甲基化在心血管領域的研究漸成為焦點并受到學者們的關注,甲基化是指在DNA甲基轉移酶介導下,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一個甲基集團,變成5-甲基胞嘧啶(5-mC)的化學修飾過程。DNA 甲基化主要發(fā)生在基因的啟動子區(qū)和第一個外顯子區(qū)的CpG 島,啟動子區(qū)CpG發(fā)生甲基化改變了基因的表觀遺傳性狀,基因的活性發(fā)生了變化,進而影響細胞分化、基因調控、X 染色體失活等諸多過程[5,6]。甲基化與高血壓發(fā)病相關[10,11],因此了解DNA甲基化的調控機制對于原發(fā)性高血壓的預防、控制和臨床合理用藥具有重要意義。

近年來研究證據顯示,代謝酶11β-HSD-2活性降低,游離皮質醇水平升高可導致高血壓[12]。11β-HSD-2基因通過發(fā)生甲基化調控,影響11β-HSD-2的表達和活性,從而通過腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)激活,以及腎性水鈉潴留等途徑引起高血壓的發(fā)生[13]。

國外Alikhani-Koopaei 等[14]的研究證實,11β-HSD-2 基因啟動子及第一外顯子區(qū)的CpG 島發(fā)生甲基化會導致基因轉錄活性下降,引起11β-HSD-2 表達降低,進而使血壓升高。體外培養(yǎng)人類細胞和對大鼠進行的體內實驗證實,給予DNA 甲基化酶抑制劑5- 氮雜胞苷及普魯卡因胺后,11β-HSD-2基因轉錄水平提高,進而表達增加,提示成年個體DNA 甲基化水平的改變與高血壓的發(fā)病密切相關。Friso 等[15]對原發(fā)性高血壓患者和部分繼發(fā)性高血壓患者的研究,發(fā)現人外周血單核細胞上的11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化水平與基因表達水平呈負相關,11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化程度增高,11β-HSD-2 基因表達下降,血壓升高,提示11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化水平與血壓水平呈正相關。Wyrwoll 等[16]對孕婦的研究發(fā)現,孕婦服用地塞米松會降低子代腎臟11β-HSD-2 的表達,導致血壓升高。Burns 等[17]對這種機制的研究認為,子代胚胎植入子宮的過程中絕大多數基因會發(fā)生去甲基化反應,而由于母體子宮內環(huán)境不同引起去甲基化水平的差異,導致基因表達的差異。以上研究證實,11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化的發(fā)生與高血壓發(fā)病密切相關。

總之研究認為,高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化程度增高致11β-HSD-2基因表達下降,11β-HSD-2酶活性降低,進而血壓升高。11β-HSD-2酶活性與高血壓的關系國內研究[18-20]較為一致的觀點是11β-HSD-2酶活性下降,血壓升高。但高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化程度的研究國內未見報道。

本研究共篩選未治療的原發(fā)性高血壓患者64例,正常對照組30例,共檢測11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)-101至461區(qū)域內563個核苷酸序列的甲基化位點27個,其中甲基化發(fā)生率明顯高于正常對照組的位點是CpG_7、8(位于-20到-14)、CpG_9(位于-8到-9)、CpG_62、63、64(位于373-378)、CpG_65(位于390到391)和CpG_72(位于430到431),其中CpG_7、8、9位點位于核心啟動子區(qū)。Sequenom MassArray時間飛行質譜生物芯片系統(tǒng)用于甲基化定量分析研究,是目前唯一采用質譜法進行直接檢測的設備。質譜法甲基化檢測具有很高的靈敏度和穩(wěn)定性,可定量分析DNA甲基化發(fā)生率,尤其適合臨床上容易獲取、但DNA含量低的血漿標本。關于原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率的研究國內未見報道,采用質譜法甲基化檢測,初步證實原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)存在有統(tǒng)計學意義的高甲基化CpG位點,包括位于核心啟動區(qū)的CpG_7、8、CpG_9以及位于啟動子區(qū)的CpG_62、63、64、CpG_65和CpG_72。由于實驗經驗不足、時間、經費限制本研究例數相對較少。原發(fā)性高血壓患者11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化狀況還有待于進一步擴大樣本量觀察。另外可進一步觀察11β-HSD-2 基因啟動子區(qū)甲基化發(fā)生率與腎素-血管緊張素-醛固酮的相關性,從而更進一步闡明11β-HSD-2基因甲基化參與高血壓發(fā)病的機制。

參考文獻：

[1]中國高血壓防治指南修訂委員會.中國高血壓防治指南 2010[J].中華心血管病雜志,2011,39:707.

[2]Kelly TN,Gu DF,Chen J,et al.Hypertension subtype and risk of cardiovascular disease in Chinese adults[J].Circulation,2008,118:1558.

[3]譚雙香,李君,易紅,等.基因甲基化導致鼻咽癌組織14-3-3σ 表達下調[J].生物化學與生物物理進展,2009,36:743.

[4]McCabe M T,Brandes J C,Vertino P M.Cancer DNA methylation:molecular mechanisms and clinical implications[J].Clin Cancer Res,2009,15:3927.

[5]Cotton A M,Avila L,Penaherrera M S,et al.Inactive X chromosome-specific reduction in placental DNA methylation[J].Hum Mol Genet,2009,18:3544.

[6]Deng T,Kuang Y,Zhang D,et al.Disruption of imprinting and aberrant embryo development in completely inbred embryonic stem cell-derive mice[J].Dev Growth Differ,2007,49:603.

[7]Mariniello B,Ronconi V,Sardu C,et al.Analysis of the 11b-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 gene (HSD11B2) in human essential hypertension[J].Am J Hypertens,2005,18:1091.

[8]張繼業(yè).表觀遺傳與高血壓[J].心腦血管病防治,2013,4：88.

[9]Satoh M,Kikuya M,Hara A,et al.Aldosterone-to-renin ratio and home blood pressure in subjects with higher and lower sodium intake：the Ohasama study[J].Hypertens Res,2011,34:361.

[10]杜霞,袁洪,邢曉為.DNA甲基化與原發(fā)性高血壓的研究進展[J].生物化學與生物物理進展,2010,37：364.

[11]Cowley AW,Nadeaa JH.Baccareli A,et al .Report of the National Heart,Lung and Blood Institute Working Group on Epigenetics and Hypertension[J] .Hypertension,2012,59:899.

[12]Ferrari P.The role of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 in human hypertension[J].Biochim Biophys Acta,2010,1802:1178.

[13]Draper N,Stewart P M.11-hydroxysteroid dehydrogenase and the pre-receptor regulation of corticosteroid hormone action[J].J Endocrinol,2005,186(2):251.

[14]Alikhani-Koopaei R,Fouladkou F,Frey F J,et al.Epigenetic regulation of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 expression[J].Clin Invest,2004,114:1146.

[15]Friso S,Pizzolo F,Choi S W,et al.Epigenetic control of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase 2 gene promoter is related to human hypertension[J].Atherosclerosis,2008,199:323.

[16]Wyrwoll C S,Mark P J,Waddell B J.Developmental programming of renal glucocorticoid sensitivity and the renin-angiotensin system[J].Hypertension,2007,50:579.

[17]Burns S P,Desai M,Cohen R D,et al.Gluconeogenesis,glucose handling,and structural changes in livers of the adult offspring of rats partially deprived of protein during pregnancy and lactation[J].J Clin Invest,1997,100:1768.

[18]姚兵,張銀娣,蔡衛(wèi)民,等.84例原發(fā)性高血壓患者和健康志愿者腎11β-HSD活性的測定和比較[J].中國臨床藥理學雜志,2000,16:332.

[19]蔣文龍,陳清枝,李東野,等,原發(fā)性高血壓患者腎臟中11β-羥類固醇脫氫酶活性的變化[J].徐州醫(yī)學院學報,2004,24：394.

[20]張林,康學軍,孫子林,等.11β-羥基類固醇脫氫酶2與原發(fā)性高血壓關系的探討[J].中國老年醫(yī)學雜志,2008,28：776.

Methylation rate detection of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 promoter in primary hypertension patients

WANGShu-qi,LIULi-qiu,LIUHai-na.

(Departmentofspecialhealthcare,QingdaoUniversityAffiliatedQingdaoMunicipalHospital,Qingdao266011,China)

Abstract:ObjectiveBy detecting the methylation rate of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 promoter in patients suffering from primary hypertension,to investigate the mechanism of primary hypertension.MethodsTo select 64 cases of untreated patients suffering from primary hypertension and 30 healthy persons as controls.The CpG islands of 11β-HSD-2 gene promoter include 563 bases from “-101 to 461”.To detect its methylation rate using Sequenom MassArray method.ResultsThe methylation rates are higher at CpG_7、8、CpG_9、CpG_62、63、64、CpG_65 and CpG_72 in patients suffering from primary hypertension,and the differences are significant,t=-5.42,-3.17,-2.84,-2.32 and -2.32,P<0.05.CpG_7、8 and CpG_9 are in the core promoter sequence.ConclusionPatients suffering from primary hypertension have hypermethylation frequency sites in the promoter region of 11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2 gene as compared to the control group.

Key words:11β-hydroxysteroid dehydrogenase-2；Primary hypertension；Promoter；Methylation

(收稿日期：2015-10-16)

中圖分類號：R541.3

文獻標識碼：A

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)04-0570-04