補(bǔ)腎安胎沖劑對復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)小鼠蛻膜血管內(nèi)皮生長因子及其受體調(diào)控作用研究

儲(chǔ)繼軍，李偉莉，吳獻(xiàn)群，秦秀娟

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢　430061；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，安徽 合肥　230031；3. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢　430061；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥　230038)

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補(bǔ)腎安胎沖劑對復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)小鼠蛻膜血管內(nèi)皮生長因子及其受體調(diào)控作用研究

儲(chǔ)繼軍1,2，李偉莉2，吳獻(xiàn)群3，秦秀娟4

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢430061；2. 安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科，安徽 合肥230031；3. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，湖北 武漢430061；4.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生部，安徽 合肥230038)

[摘要]目的觀察補(bǔ)腎安胎沖劑對復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)小鼠胚胎丟失率和蛻膜組織血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體的影響。方法采用Clark經(jīng)典RSA小鼠模型，將RSA小鼠隨機(jī)分為模型組、補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量(11.7 g/kg)組、補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量(23.4 g/kg)組，黃體酮膠囊(156 mg/kg)組，另取正常妊娠小鼠作為正常組，每組8只。末次給藥后，處死小鼠，計(jì)算胚胎丟失率；光鏡下觀察蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)改變；采用免疫組化法檢測蛻膜組織VEGF、血管內(nèi)皮生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)、可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sVEGFR-1)的表達(dá)；采用RT-PCR法檢測小鼠蛻膜組織中VEGF、VEGFR-2及sVEGFR-1 mRNA的表達(dá)。結(jié)果補(bǔ)腎安胎沖劑能改善蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)變化，升高蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2蛋白含量，降低sVEGFR-1蛋白含量；能顯著降低RSA小鼠胚胎丟失率(P<0.05)，升高蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平，降低sVEGFR-1 mRNA表達(dá)水平(P<0.05)，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。結(jié)論補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠具有一定的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與調(diào)控VEGF及其受體，改善蛻膜組織血管重鑄有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)；補(bǔ)腎安胎沖劑；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子；血管重鑄

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)，中醫(yī)稱為滑胎，是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，其發(fā)生率約占育齡婦女的1%～2%，占所有妊娠丟失的15%～20%[1]。RSA發(fā)病原因復(fù)雜[2-3]，西醫(yī)療效尚待提高。補(bǔ)腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院根據(jù)“腎主生殖”和“胞胎系于腎”理論，結(jié)合多年臨床實(shí)踐創(chuàng)制的特色中藥制劑，具有補(bǔ)腎健脾益氣安胎的作用，臨床療效確切[4-6]。本實(shí)驗(yàn)通過復(fù)制RSA模型觀察補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1材料

1.1藥材與試劑補(bǔ)腎安胎沖劑(批號(hào)：皖藥制字BZ20080017)：由菟絲子、桑寄生、續(xù)斷、熟地黃、炒白術(shù)、白芍、黨參、炙黃芪、黃芩等組成，由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供；黃體酮膠囊(每粒50 mg，批號(hào)為國藥準(zhǔn)字H20041902)：由浙江仙琚制藥股份有限公司提供；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Revert Aid TM first Strand cDNA Synthesis Kit)(批號(hào) 00221108)：由Thermo公司提供；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)抗體(批號(hào) E8562)：由Santa Cruz公司提供；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR-2)抗體(批號(hào) 4)：由Cell Signaling Technology提供；可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor 1，sVEGFR-1)抗體(批號(hào) CJ36131)：由Bioworld公司提供。VEGF、VEGFR-2和sVEGFR-1檢測試劑盒均購于北京中杉公司。

1.2動(dòng)物雌性CBA/J小鼠50只、雄性DBA/2小鼠20只及BALB/c小鼠5只，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK[京]2014-0004。

1.3儀器JB-P5 包埋機(jī)，由湖北省武漢俊杰電子有限公司提供；RM2016病理切片機(jī)，由上海萊卡儀器有限公司提供；PIKOREAL 96熒光定量PCR儀，由賽默飛世爾科技公司提供。

2方法

2.1RSA小鼠模型的復(fù)制按Clark經(jīng)典RSA小鼠模型復(fù)制方法[7]，將雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠按2∶1合籠交配，復(fù)制RSA模型；將雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠按2∶1合籠交配，復(fù)制正常妊娠小鼠。檢出陰栓者計(jì)為妊娠第0天。

2.2分組及給藥將上述RSA模型小鼠隨機(jī)分為4組：模型組，補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量(11.7 g/kg，相當(dāng)于60 kg成人臨床劑量3倍)組，補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量(23.4 g/kg)組，黃體酮膠囊(156 mg/kg)組，每組8只，另取正常妊娠小鼠8只作為正常組。于檢出陰栓第2天開始，除模型組及正常妊娠組小鼠接受同容積蒸餾水灌胃外，其余3組小鼠每天接受相應(yīng)藥物灌胃(20 mL/kg)，每日1次，連續(xù)給藥15 d。

2.3檢測指標(biāo)

2.3.1胚胎丟失率觀察末次給藥24 h后，處死小鼠，剖視子宮觀察胚胎丟失情況，具體判斷標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)[8]。正常胚胎粗大狀如串珠，宮內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)痕血，胚胎呈現(xiàn)淡紅色；流產(chǎn)胚胎的宮內(nèi)可見明顯痕血，胚胎顏色呈黑褐色，或子宮呈現(xiàn)竹節(jié)樣改變，胚胎出現(xiàn)完全或部分消失。胚胎丟失率=丟失胚胎數(shù)/(丟失胚胎數(shù)+存活胚胎數(shù))。

2.3.2蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)觀察取固定部位蛻膜組織，置于4%多聚甲醛液中固定、石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)改變。

2.3.3免疫組化法檢測蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1的分布及表達(dá)參照免疫組化檢測試劑盒和DAB酶底物顯色試劑盒的說明書進(jìn)行操作，即石蠟切片(厚度2 μm)，脫蠟至水，抗原微波修復(fù)后，加一抗、二抗孵育，顯色、襯染、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察蛻膜組織切片，以細(xì)胞漿或細(xì)胞核內(nèi)的棕黃色粗顆?；蜃攸S色細(xì)膩顆粒彌漫分布為陽性表達(dá)。

2.3.4RT-PCR檢測蛻膜組織VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1 mRNA的含量取小鼠蛻膜組織100 mg，采用TRIzol法抽提小鼠蛻膜組織中總RNA，總反應(yīng)體系10 μL，合成cDNA。取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL作為反應(yīng)模板，反應(yīng)體系10 μL。VEGF引物序列：正向引物為5′- CTCTCTCCCAGATCGGTGAC-3′，反向引物為5′-CAAAGGAATGTGTGGTGGGG-3′；VEGFR-2引物序列：正向引物為5′- ACAGTTCCCAGAGTGGTTGG-3′，反向引物為5′-GTCACTGACAGAGGCGTAGA-3′；sVEGFR-1引物序列：正向引物為5′- CAGACAATTCTGCAGCACCT-3′,反向引物為5′-TCCTTCGAGGTGGATTTAGG-3′；β-actin引物序列：正向引物為5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，反向引物為5′- TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸10 s，40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后，由電腦軟件自動(dòng)分析讀取CT值，使用相對定量研究方法進(jìn)行分析。

3 結(jié)果

3.1補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠胚胎丟失率的影響模型組小鼠胚胎丟失率較正常組顯著升高(P<0.05)；模型組和補(bǔ)腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠胚胎丟失率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，21)=55.32，P=0.000)，提示補(bǔ)腎安胎沖劑在降低RSA小鼠胚胎丟失率方面具有明顯的量效關(guān)系，以補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量的效應(yīng)最為顯著；黃體酮膠囊組和補(bǔ)腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠胚胎丟失率比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F(2，21)=16.04，P=0.000)，黃體酮膠囊降低RSA小鼠胚胎丟失率的效應(yīng)與補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組相當(dāng)。見表1。

表1　各組小鼠胚胎丟失率比較±s)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05。

3.2補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)影響與正常妊娠小鼠比較，模型組RSA小鼠絨毛大小不一，形態(tài)不規(guī)則，合體滋養(yǎng)層細(xì)胞及細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞均明顯減少，萎縮變性，排列紊亂，可見凋亡細(xì)胞及炎性細(xì)胞，核固縮，染色較深，間充質(zhì)及基質(zhì)見纖維素樣變性，間質(zhì)血管減少；蛻膜組織變性，上皮不完整，細(xì)胞排列不規(guī)則，腺體皺縮，血管瘀血。給予補(bǔ)腎安胎沖劑和黃體酮膠囊干預(yù)后，RSA小鼠蛻膜組織血管形態(tài)學(xué)呈現(xiàn)好轉(zhuǎn)趨勢。結(jié)果見圖1。

注:A.正常組;B.模型組;C.補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組;D.補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組;E.黃體酮膠囊組;白色箭頭示蛻膜組織血管。

圖1各組小鼠蛻膜組織形態(tài)學(xué)變化(HE染色，10×20倍)

3.3補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織中VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1分布及表達(dá)的影響在各組小鼠蛻膜中，VEGF主要表達(dá)于蛻膜細(xì)胞、腺上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿中，細(xì)胞核未見明顯著色，蛻膜細(xì)胞陽性染色強(qiáng)，見圖2；VEGFR-2在蛻膜組織的陽性表達(dá)位于大部分蛻膜細(xì)胞及少數(shù)腺上皮細(xì)胞的胞核和胞漿內(nèi)，見圖3；sVEGFR-1在血管內(nèi)皮細(xì)胞中存在豐富的表達(dá)，見圖4。模型組RSA小鼠VEGF、VEGFR-2的表達(dá)低于正常組，補(bǔ)腎安胎沖劑低、高劑量組及黃體酮膠囊組，而sVEGFR-1的表達(dá)高于正常組，補(bǔ)腎安胎沖劑低、高劑量組及黃體酮膠囊組。

3.4補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織中VEGF、VEGFR-2、sVEGFR-1 mRNA表達(dá)的影響與正常妊娠小鼠比較，模型組小鼠蛻膜組織中VEGF mRNA和VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，sVEGFR-1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。模型組和補(bǔ)腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠蛻膜組織中VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA和sVEGFR-1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF mRNA：F(2，15)=85.56，P=0.000；VEGFR-2 mRNA：F(2，15)=68.35，P=0.000；sVEGFR-1 mRNA：F(2，15)=9.33，P=0.002)，以補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量升高VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平和降低sVEGFR-1 mRNA表達(dá)水平的效應(yīng)最顯著。黃體酮膠囊組和補(bǔ)腎安胎沖劑高、低劑量組小鼠蛻膜組織中VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA和sVEGFR-1 mRNA表達(dá)水平比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(VEGF mRNA：F(2，15)=11.21，P=0.001；VEGFR-2 mRNA：F(2，15)=14.83，P=0.000；sVEGFR-1 mRNA：F(2，15)=18.71，P=0.000)，以黃體酮膠囊升高VEGF mRNA、VEGFR-2 mRNA表達(dá)水平和降低sVEGFR-1 mRNA表達(dá)水平的效應(yīng)最顯著。見圖5。

注:A.正常組;B.模型組;C.補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組;D.補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組;E.黃體酮膠囊組;白色箭頭示棕黃色的VEGF蛋白。

圖2　各組小鼠VEGF的表達(dá)情況(10×20倍)

圖3各組小鼠VEGFR-2的表達(dá)情況(10×20倍)

4討論

RSA屬中醫(yī)學(xué)“滑胎”范疇。腎氣不足致胎失所系，脾虛血少致胎失所養(yǎng)等，均可導(dǎo)致胎元不固而殞墮[9]。補(bǔ)腎安胎沖劑是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院根據(jù)“腎主生殖”“胞胎系于腎”理論，經(jīng)過多年臨床驗(yàn)證形成的中藥制劑，具有補(bǔ)腎健脾、益氣安胎的功效[10]。方中菟絲子補(bǔ)腎益精為全方主藥；續(xù)斷既補(bǔ)肝腎，又具止血安胎之功效；桑寄生有補(bǔ)肝腎、養(yǎng)血安胎之功；熟地黃滋陰補(bǔ)腎、益精養(yǎng)血；黨參、黃芪補(bǔ)脾益腎，即能補(bǔ)脾腎之氣，又兼固精之效；黃芩清熱止血安胎，與白術(shù)配伍使用，有朱丹溪“安胎圣藥”之妙。全方緊緊圍繞滑胎“腎脾虧虛”的核心病機(jī)，補(bǔ)腎以養(yǎng)先天，使腎系有力、胎元得固；健脾以益后天，使氣血生化有源、胎元得養(yǎng)。

注:A.正常組;B.模型組;C.補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組;D.補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組;E.黃體酮膠囊組;白色箭頭示棕黃色的sVEGFR-1蛋白。

圖4各組小鼠sVEGFR-1的表達(dá)情況(10×20倍)

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑低劑量組比較，△P<0.05；與補(bǔ)腎安胎沖劑高劑量組比較，◇P<0.05。

圖5各組小鼠VEGF、VEGFR-2和sVEGFR-1 mRNA

在妊娠過程中，胎盤微血管的生成及胎盤血管網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建是至關(guān)重要的[11]，血管建立在胎盤與子宮內(nèi)膜之間，并侵入蛻膜組織，血管新生及其通透性改變在胚胎著床到胎盤形成中發(fā)揮著重要作用[9]。VEGF是一種主要的血管生成和血管通透性誘導(dǎo)因子[12]，既有促進(jìn)微小靜脈通透性增加，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂和增殖，使細(xì)胞鈣聚集等作用，又可誘導(dǎo)血管生成，參與母胎界面血管重鑄[13]。妊娠時(shí)期原始血管形成，主要來源于內(nèi)皮細(xì)胞的VEGF通過與其特異性受體VEGFR-2結(jié)合而促進(jìn)細(xì)胞侵襲蛻膜組織，完成血管重鑄過程[14]。VEGFR-2具有很強(qiáng)的酪氨酸激酶活性，介導(dǎo)了VEGF的主要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組RSA小鼠VEGF和VEGFR-2的表達(dá)較正常妊娠小鼠顯著降低，與文獻(xiàn)報(bào)道[15]一致。與模型組RSA小鼠比較，補(bǔ)腎安胎沖劑低、高劑量組及黃體酮膠囊組均可不同程度增加小鼠蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2的表達(dá)，并且明顯減少小鼠的胚胎丟失率。

sVEGFR-1是VEGFR-1的可溶性形式，能與膜表面受體競爭結(jié)合VEGF，起著天然的內(nèi)源性血管生成抑制劑作用，阻斷VEGF促血管生成的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而抑制VEGF誘導(dǎo)血管生成的生物學(xué)活性[16]。Ahmad等[17]也觀察到來自正常妊娠絨毛的條件培養(yǎng)液促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移、管狀形成，加入外源性sVEGFR-1則削弱其作用，導(dǎo)致流產(chǎn)的發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組RSA小鼠sVEGFR-1的表達(dá)較正常妊娠小鼠明顯升高，補(bǔ)腎安胎沖劑低、高劑量組可不同程度降低小鼠蛻膜組織中sVEGFR-1的表達(dá)。

綜上所述，補(bǔ)腎安胎沖劑對RSA小鼠蛻膜組織中血管生成具有一定的促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是通過升高RSA小鼠蛻膜組織中VEGF和VEGFR-2的含量，降低sVEGFR-1的含量，從而促進(jìn)小鼠蛻膜組織中血管生成，保護(hù)妊娠。

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Regulatory Effect of Granule for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage on Decidual Vascular Endothelial Growth Factor and Its Receptor in Mice with Recurrent Spontaneous Abortion

CHUJi-jun1,2,LIWei-li2,WUXian-qun3,QINXiu-juan4

(1.CollegeofClinicalChineseMedicine,HubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430061,China; 2.DepartmentofGynecology,TheFirstHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230031;3.DepartmentofObstetricsandGynecology,TheAffiliatedHospitalofHubeiUniversityofChineseMedicine,HubeiWuhan430061;4.GraduateDivision,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230038,China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the effects of Granules for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage(GTKPM)on embryo loss rate and decidual vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptor in mice with recurrent spontaneous abortion (RSA). MethodsThe classical Clark RSA mice were selected and randomly divided into model group, low-dose GTKPM group (11.7 g/kg), high-dose GTKPM group (23.4 g/kg), and progesterone capsule group (156 mg/kg), each with 8 mice. Another 8 normal pregnancy mice were selected as the control group. After the last administration, the mice were sacrificed, and the embryo loss rate (ELR) was calculated. The changes in the vascular morphology of decidual tissue were observed under a light microscope. The protein expression of vascular endothelial growth factor (VEGF), vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2), and soluble vascular endothelial growth factor receptor 1 (sVEGFR-1) in decidual tissue was measured by immunohistochemistry. Moreover, RT-PCR was performed to measure the mRNA expression of VEGF, VEGFR-2, and sVEGFR-1 in decidual tissue. ResultsGTKPM improved the vascular morphology of decidual tissue, increased the protein expression of VEGF and VEGFR-2 in decidual tissue, and reduced the protein expression of sVEGFR-1. In addition, GTKPM significantly reduced the ELR of RSA mice (P<0.05), increased the mRNA expression of VEGF and VEGFR-2 in decidual tissue, and reduced the mRNA expression of sVEGFR-1 (P<0.05),with a significant dose-effect relationship. ConclusionGTKPM has a certain protective effect on RSA mice, which may be related to its regulatory effect on VEGF and its receptor and improving the vascular remodeling of decidual tissue.

[Key words]Recurrent spontaneous abortion; Granule for Tonifying the Kidney and Preventing Miscarriage; Vascular endothelial growth factor; Vascular remodeling

(收稿日期：2016-01-20；編輯：姚實(shí)林)

[中圖分類號(hào)]R285.5；R714.21[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.02.023

通信作者：吳獻(xiàn)群，foursides@163.com

作者簡介：儲(chǔ)繼軍(1977-)，男，博士研究生，主治醫(yī)師