高效液相色譜測(cè)定中藥夏枯草活性成分含量

湯國茂（廣州市增城區(qū)疾病防預(yù)控制中心藥品檢驗(yàn)科　廣州　510000）

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高效液相色譜測(cè)定中藥夏枯草活性成分含量

湯國茂（廣州市增城區(qū)疾病防預(yù)控制中心藥品檢驗(yàn)科廣州510000）

摘要：目的：分析高效液相色譜（HPLC）測(cè)定中藥夏枯草活性成分含量。方法：本次研究采用島津SPD-15C型號(hào)的高效液相色譜儀、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器等進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；色譜柱選擇Phenomenex C18柱，流速設(shè)置為1mL/min；流動(dòng)相為乙腈以及0.01%磷酸溶液，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210nm。結(jié)果：本次研究中，熊果酸回收率均值為98.65，RSD為3.98；齊墩果酸回收率均值為92.68，RSD為4.23；計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，熊果酸為3.98～8.26mg·g-1，齊墩果酸為0.256～0.598mg·g-1。結(jié)論：HPLC應(yīng)用于中藥夏枯草活性成分測(cè)定，操作方便，而且快速，可將其作為成分測(cè)定的有效措施。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜中藥夏枯草活性成分

中藥屬于我國寶貴財(cái)富，其來源、成分等方面十分復(fù)雜，其中大部分來自礦物、植物等，每種中藥中含有復(fù)雜的多種成分，例如，人參中含有維生素、有機(jī)酸、肽類等成分[1]?？梢姡骄恐兴幊煞謱?duì)于充分發(fā)揮其作用具有現(xiàn)實(shí)意義[2]。高效液相色譜（HPLC），即通常所說的“近代柱色譜”，具有極易回收、降低樣品消耗量、高速、高壓等特點(diǎn)[3]。隨著色譜手段日漸完善，廣泛應(yīng)用在中藥探究領(lǐng)域，尤其是質(zhì)量控制領(lǐng)域。為此，本次研究HPLC測(cè)定中藥夏枯草活性成分含量，現(xiàn)詳細(xì)報(bào)道如下：

1　實(shí)驗(yàn)儀器以及試劑

1.1實(shí)驗(yàn)儀器：本次實(shí)驗(yàn)采用島津SPD-15C型號(hào)的高效液相色譜儀。其中，泵技術(shù)的具體參數(shù)為：40MPa最大壓力，0.3%精度，0.001～10.000mL/min流量范圍等。此外，本次實(shí)驗(yàn)還需選取賽多利斯BT125D電子天平（可讀性0.01mg）、KQ3200E超聲波清洗器（溫度：RT-80℃；頻率：40KHZ）、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器以及真空脫氣機(jī)等儀器[4]。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑：本次實(shí)驗(yàn)采用齊墩果酸（包裝規(guī)格：20mg，產(chǎn)品編號(hào)：MB6817，CAS號(hào)碼：508-02-1）、咖啡酸（CAS號(hào)：331-39-5，供應(yīng)商：Solarbio，保存條件：2℃～8℃，品牌：Solarbio）、熊果酸（供應(yīng)商：成都瑞芬思，品牌：瑞芬思，儲(chǔ)存環(huán)境：密封、避光、冷藏，CAS號(hào)：77-52-1）[5]。此外，本次實(shí)驗(yàn)還用到迷迭香酸（品牌：Solarbio，規(guī)格：20mg/支，存儲(chǔ)溫度：4℃，供應(yīng)商：Solarbio，CAS號(hào)：20283-92-5，保質(zhì)期：1年以上）。本次研究中選取的夏枯草來源于安徽、浙江、河南、山西、江蘇等省份[6]。其中，除了江蘇的藥材是野生的，其余全部是市面銷售藥材，而且經(jīng)過我科中藥師的鑒定。實(shí)驗(yàn)中藥材的產(chǎn)地以及批號(hào)信息詳見表1。其中，安徽AH1、AH2、AH3、AH4這四個(gè)樣品的批號(hào)分別是150258、150265、150264、150374；浙江ZJ1、ZJ2、ZJ3這三個(gè)樣品的批號(hào)分別是150665、150646、150641；河南HN1、HN2兩個(gè)樣品的批號(hào)是150714、150734；山西SX1、SX2這兩個(gè)樣品批號(hào)分別為150896、150875；江蘇JS1樣品的批號(hào)為150452。

表1　藥材的產(chǎn)地以及批號(hào)

2　結(jié)果

2.1色譜條件：本次研究中色譜柱選擇Phenomenex C18柱，詳細(xì)的參數(shù)信息為4.6mm×150mm，5μm；流速設(shè)置為1mL/min；流動(dòng)相為乙腈以及0.01%的磷酸溶液，比例為27∶73；檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)置為210nm；柱溫設(shè)置為30℃。此外，研究中通過二元梯度對(duì)藥材進(jìn)行洗脫，具體的梯度信息如下：①Time/min為0～20，Mobilephase（A/%）為95-80，Mobile phase（B/%）為5-20；②Time/min 為20～40，Mobilephase（A/%）為80-40，Mobile phase（B/%）為20-60；③Time/min為40～60；Mobilephase（A/%）為40 -5，Mobile phase（B/%）為60-95；④Time/min為60～75；Mobilephase （A/%）為5；Mobile phase（B/%）為95。

2.2制備對(duì)照樣品以及供試品：首先，通過精密儀器取0.0153g熊果酸以及0.0115g迷迭香酸，而且將其置于容量為10mL的兩個(gè)瓶?jī)?nèi)；通過精密儀器取0.0112g齊墩果酸以及0.0025g咖啡酸，將其置于容量為50mL的兩個(gè)瓶?jī)?nèi)。其次，將上述各種試劑都通過甲醇溶液稀釋，而且搖晃瓶子，使其達(dá)到均勻狀態(tài)，得到的溶液分別為1.59g/L、0.212g/L、1.21g/L、0.051g/L。最后，將上述溶液都放置在溫度為4℃的冰箱中保存。對(duì)于供試品，可通過精密儀器取0.01g夏枯草粉末放入燒瓶，然后緩慢添加濃度為75%的20mL乙醇溶液，然后經(jīng)過稱重、超聲、靜置、補(bǔ)足減失的重量等環(huán)節(jié)，通過濾膜對(duì)其進(jìn)行過濾，保存續(xù)濾液，即供試品。

2.3分析線性關(guān)系：本次研究中，從各個(gè)對(duì)照品種，取熊果酸、齊墩果酸、迷迭香酸、咖啡酸分別取900μL、300μL、150μL、60μL，然后緩慢添加甲醇溶液，使其達(dá)到刻度。橫坐標(biāo)為對(duì)照品進(jìn)樣量，設(shè)為X，縱坐標(biāo)為峰面積積分值，設(shè)為Y，利用其進(jìn)行工作曲線的制備。經(jīng)過線性分析，各個(gè)成分線性關(guān)系詳見表2。其中，熊果酸曲線為y=19.52x+2.47，R2=0.9998，范圍為4.75～158；齊墩果酸曲線為y=21.62x+5.74，R2=0.9997，范圍為0.58～19.87；迷迭香酸曲線為y=47.65x+6.34，R2=0.9999，范圍為3.45～108；咖啡酸曲線為y=169.54x+6.74，R2=0.9854，范圍為0.16～4.78。

表2　各個(gè)成分線性關(guān)系

2.4精密度、穩(wěn)定性等試驗(yàn)：①穩(wěn)定性。經(jīng)過試驗(yàn)，測(cè)量四個(gè)成分的峰面積，RSD結(jié)果表明，熊果酸為2.10%，齊墩果酸為4.21%，迷迭香酸為1.45%，咖啡酸為0.92%，說明全部供試品在一定時(shí)間內(nèi)處于十分穩(wěn)定的狀態(tài)。②精密度：經(jīng)過試驗(yàn)，測(cè)量四個(gè)成分的峰面積，RSD結(jié)果表明，熊果酸為1.45%，齊墩果酸為3.36%，迷迭香酸為0.87%，咖啡酸為0.81%，說明全部?jī)x器性能處于良好狀態(tài)。

2.5回收率：從已經(jīng)知道含量的樣品中利用精密稱量?jī)x器稱取0.051g，將其放入容量為25mL的量瓶，然后在其中加入適量的四種對(duì)照品溶液，依據(jù)試驗(yàn)品溶液的測(cè)定項(xiàng)下進(jìn)行處理，對(duì)回收率進(jìn)行計(jì)算。熊果酸回收率均值為98.65，RSD為3.98；齊墩果酸回收率均值為92.68，RSD為4.23；迷迭香酸回收率均值為96.24，RSD為4.21；咖啡酸回收率均值為108.49，RSD為2.98。此外，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)，熊果酸為3.98～8.26mg·g-1，齊墩果酸為0.256～0.598mg·g-1，迷迭香酸為0.97～2.68mg·g-1，咖啡酸為0.038～0.106mg·g-1。

3　討論

夏枯草屬于夏枯草植物的果穗，通常在夏天成熟，具有較高的藥用價(jià)值。因此，探究其成分顯得尤為重要。本次研究中，HPLC應(yīng)用于中藥夏枯草活性成分測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明，迷迭香酸為0.97～2.68mg·g-1，咖啡酸為0.038～0.106mg·g-1。因此，HPLC具有快速、極易操作等優(yōu)點(diǎn)，而且可有效測(cè)定各成分，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

[1]楊思敏，陳瑞戰(zhàn)，董航，等.高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用快速篩選并鑒定黃芩甲醇提取物中抗氧化活性成分[J].分析化學(xué)，2012，7 （6）：888-892.

[2]劉明鈺，李敏，陳娟娟，等.2，2-二苯基-1-苦肼基-高效液相色譜法快速篩選亞麻籽抗氧化活性成分[J].分析化學(xué)，2015，4（2）：245-250.

[3]梁慧，朱偉健，袁智泉，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對(duì)癍痧涼茶中18種活性成分的定量分析[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2015，9 （5）：558-563，569.

[4]李雙花，馮思，陳茵佳，等.高效液相色譜法測(cè)定糖化酶中葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶的活性[J].色譜，2014，9（5）：539-542.

[5]張清峰，付瑩娟，陳繼光，等.高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定虎杖中五種活性成分[J].現(xiàn)代食品科技，2014，6（3）：216-219.

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中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1672-8351（2016）04-0004-02