吉富羅非魚mIgD基因恒定區(qū)序列的原核表達及多克隆抗體的制備

王培+王蓓+魯義善+簡紀(jì)常+吳灶和

摘 要：實驗采用原核表達方法成功獲得吉富羅非魚mIgD基因恒定區(qū)融合蛋白，同時利用純化的MIGD融合蛋白，制備了兔抗MIGD多克隆抗體。ELISA檢測MIGD融合蛋白效價高達1∶512 000，說明MIGD蛋白具有較強的免疫原性，可以誘導(dǎo)羅非魚機體產(chǎn)生相應(yīng)較強的免疫應(yīng)答。

關(guān)鍵詞：吉富羅非魚；mIgD；原核表達；多克隆抗體

中圖分類號 S943 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2016）08-10-04

Abstract：This experiment adoptsed prokaryotic expression methods to successfully obtain the constant region mIgD gene fusion protein，and polyclonal antibody against mIgD fusion protein was raised in a New Zealand pedigree white rabbit immunized with the purified MIGD fusion protein and the antibodytiter reached 1∶512000.This shows that the MIGD protein has strong immunogenicity，tilapia body can be induced to produce a strong immune response.

Key words：GIFT strain of Nile tilapia；mIgD；Prokaryotic expression；Preparation of polyclonal antibody

IgD是免疫系統(tǒng)中重要的免疫因子，主要在成熟的B細胞產(chǎn)生[1]。在硬骨魚類中，IgD是繼IgM被發(fā)現(xiàn)后的第二種免疫球蛋白，不同種魚類IgD基因在結(jié)構(gòu)上存在較大的差異，主要是由于其重鏈恒定區(qū)基因經(jīng)過大量的剪切和復(fù)制，導(dǎo)致魚體IgD基因結(jié)構(gòu)差異較大。和IgM一樣，IgD基因根據(jù)其剪切方式的不同，也分為2種型，即膜結(jié)合型IgD（mIgD）和分泌型IgD（sIgD）。mIgD主要是在B細胞膜表面作為抗原識別受體參與到免疫應(yīng)答中，而sIgD則主要存在于血清和其它體液中，發(fā)揮著抗體的功能參與體液免疫中[2]。目前已經(jīng)有多種魚類的IgD已經(jīng)被報道出來[3-6]，但IgD功能的研究僅限于基因結(jié)構(gòu)的分析，其蛋白分子本身的功能卻研究很少。一般Ig主要分為多變區(qū)（VH）、恒定區(qū)（CH）以及跨膜區(qū)（TM）等區(qū)域，而恒定區(qū)（CH）為Ig分子中最為重要的區(qū)域。為了研究恒定區(qū)生物學(xué)功能，本實驗對已經(jīng)獲得的吉富羅非魚（Oreochromis niloticus）mIgD重鏈基因恒定區(qū)進行克隆[7]，通過擴增獲得編碼的mIgD恒定區(qū)的基因序列，利用原核表達的方法構(gòu)建融合表達載體，誘導(dǎo)表達后獲取重組蛋白。通過制備重組蛋白的多克隆抗體，進一步研究重組蛋白的免疫原性，同時對多抗的特異性進行檢測，以期為羅非魚mIgD的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗載體及菌株 質(zhì)粒載體pET-32a（+）、受體菌菌株大腸桿菌DH5α、BL21均為本實驗保存。

1.1.2 實驗動物 吉富羅非魚（體質(zhì)量為100g左右）采自湛江東海島養(yǎng)殖基地，健康、有活力；新西蘭純種大白兔（體質(zhì)量為2.1kg左右）購于廣東醫(yī)學(xué)院，暫養(yǎng)14d后用于實驗。

1.1.3 實驗儀器 PCR儀：Bio-Rad公司；DYY-III-8B恒壓恒流電泳儀：北京六一電泳儀廠；GDS-8000凝膠圖象分析儀：美國基因公司；JY92-2D超聲波細胞粉碎儀：HZQ-F160恒溫振蕩培養(yǎng)箱：上海南榮有限公司；HisTrapTM HP蛋白純化柱：GE公司；BTI-MQX200酶標(biāo)儀，美國BIO-TEK公司；上海新諾儀器設(shè)備有限公司等。

1.1.4 實驗試劑 IPTG、弗氏完全佐劑與弗氏不完全佐劑購自Sigma公司，試驗所需酶類均購自大連TaKaRa公司；DNA切膠回收試劑盒、GeneJET Gel ExtractionKit試劑盒購自美國Thermo公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）（貨號：AB10058）購自生工生物工程（上海）有限公司；HRP-標(biāo)記的鼠抗His-tag單抗、山羊抗鼠IgG、DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 吉富羅非魚mIgD基因恒定區(qū)原核表達載體的構(gòu)建 根據(jù)已經(jīng)獲得的吉富羅非魚mIgD基因的cDNA全長序列，利用Primer Premier5.0軟件設(shè)計一對特異性引物D-δ-F和D-δ-R，用來擴增mIgD重鏈基因的恒定區(qū)序列δ1～δ7區(qū)域，將限制性酶切位點BamHⅠ、EcoRⅠ和對應(yīng)的保護堿基分別引入2條引物的5'端。通過常規(guī)PCR擴增mIgD恒定區(qū)序列，通過回收、連接、轉(zhuǎn)化、篩選單克隆，測序驗證，利用常規(guī)方法構(gòu)建重組質(zhì)粒[8]。

1.2.2 大腸桿菌誘導(dǎo)表達及表達條件的優(yōu)化 將重組質(zhì)粒按照相應(yīng)比例（1∶100）接種于含有Amp+（50μg/mL）的LB培養(yǎng)基中，適宜條件下培養(yǎng)，當(dāng)酶標(biāo)儀中的OD600值達到0.4～0.6時，加IPTG誘導(dǎo)蛋白表達，樣品處理，聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析。分別設(shè)定28℃和37℃，IPTG濃度為0.2mmol/L誘導(dǎo)4h，離心后區(qū)上清液和下沉液SDS-PAGE分析；分別設(shè)定IPTG濃度為0.02～0.8mmol/L等8個濃度梯度，37℃誘導(dǎo)4h，處理樣品，SDS-PAGE分析；設(shè)定誘導(dǎo)時間分別為：0.5h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，7h，37℃，IPTG濃度為0.05mmol/L，樣品處理，聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。

1.2.3 重組融合蛋白的提取與純化 最優(yōu)表達條件誘導(dǎo)后的菌液于冰上超聲破碎，直至菌液澄清。離心后取上清和沉淀進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分析。采用HisTrapTM HP親和層析柱純化蛋白，分別用含30、50、75、100、150、200、250和300mmol/L咪唑的Elution Buffer洗脫樣品，并分別收集樣品，之后進行傳統(tǒng)Western blot 檢驗。

1.2.4 兔抗羅非魚MIGD多克隆抗體的制備 將購買的4月齡的新西蘭大白兔平均分成A組和B組，在動物進行免疫前，抽取少量血液作為空白對照組，之后分別將A、B組中的新西蘭大白兔平均分為實驗組和陰性對照組采用皮下注射法分別對實驗組大白兔注射免疫原，對陰性對照組注射同等劑量的PBS進行免疫。三免后耳緣靜脈采血，并用ELISA檢測抗血清效價，免疫后第57天終放血，ELISA檢測抗血清效價達到要求，頸動脈采全血，制備多克隆抗體[9]。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達載體pET32-δ-D的構(gòu)建及鑒定 根據(jù)設(shè)計的羅非魚mIgD恒定區(qū)引物，得到2160bp的恒定區(qū)片段。將mIgD基因的目的片段與pET-32a（+）載體連接、轉(zhuǎn)化。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pET32-δ-D進行雙酶切鑒定，得到一條長約2 160bp的條帶（圖1），結(jié)果序列比對結(jié)果正確，并無移碼或錯配現(xiàn)象存在，表明原核表達載體pET32-δ-D構(gòu)建成功。

2.2 重組質(zhì)粒pET32-δ-D在BL21中的表達分析 重組質(zhì)粒pET32-δ-D轉(zhuǎn)化入大腸桿菌E.coli BL21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，可以表達出約99.9ku的融合蛋白（圖2），而mIgD恒定區(qū)的蛋白分子量為79.5ku，標(biāo)簽蛋白pET-32a的分子量約為20.4ku。將經(jīng)過不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒與未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒分別進行SDS-PAGE分析（圖3）。通過對溫度、IPTG濃度及時間的優(yōu)化，確定重組質(zhì)粒pET32-δ-D最佳誘導(dǎo)條件為：28℃條件下，IPTG濃度為0.1mmol/L，誘導(dǎo)3h。從圖3（A）中可以看到，細菌經(jīng)過超聲破碎后，重組蛋白主要以包涵體的形式存在于沉淀中，而在上清液中幾乎不存在。

2.3 重組融合蛋白的純化及鑒定 將pET32-δ-D重組蛋白在最佳誘導(dǎo)條件下提取包涵體，用HisTrapTM HP親和層析柱進行純化。分別采用不同濃度的咪唑緩沖液洗脫，結(jié)果顯示，在250mmol/L咪唑濃度條件下洗脫純化效果最好（圖4）。Western Blot分析（圖5）顯示，純化后的pET32-δ-D重組融合蛋白可以與His-Tag單克隆抗體結(jié)合，蛋白大小一致，結(jié)合測序結(jié)果推斷，已成功表達出吉富羅非魚mIgD蛋白。

2.4 兔抗SIGM多克隆抗體的抗血清效價測定和特異性檢測 利用已純化的MIGD融合蛋白，按照常規(guī)方法制備了兔抗MIGD多克隆抗體。從酶標(biāo)儀在450nm波長下測得的OD值（表2）以及終放血后抗血清純化抗體效價檢測（圖6）中可以得出，B組新西蘭大白兔終放血后的抗血清按照1∶256 000稀釋時，血清效價值≥2.5×陰性值，檢測結(jié)果為陽性；同樣方法將A組終放血后抗血清按照1∶512 000稀釋時，檢測結(jié)果仍可判定為陽性。因此，ELISA檢測效價表明SIGM融合蛋白可以產(chǎn)生較高效價的抗體，抗體效價約為1∶512 000。Western-blotting結(jié)果顯示制備的SIGM多克隆抗體具有較高的免疫原性（圖7），可用于后續(xù)的實驗。

3 討論與結(jié)論

近年來，人們對于Ig的研究不僅從基因克隆和組織表達等方面入手，還可以通過原核表達系統(tǒng)體外獲得量大、高效的重組融合蛋白，使這些重組蛋白直接應(yīng)用于蛋白生物學(xué)特性等基礎(chǔ)研究中。本實驗首先構(gòu)建原核表達載體pET32-δ-D，再將經(jīng)過不同誘導(dǎo)條件誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒與未經(jīng)誘導(dǎo)的重組質(zhì)粒分別進行SDS-PAGE分析。通過對溫度、IPTG濃度、和時間等影響因素的優(yōu)化，確定重組質(zhì)粒的最佳誘導(dǎo)條件，從而得到大量高效的外源重組蛋白。隨著酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測體液中微量物質(zhì)的大量應(yīng)用，高質(zhì)量的抗體制備也越來越受到重視[10]。其中單克隆抗體的制備備受推崇，在其擁有穩(wěn)定性好、充分性好等優(yōu)點的同時存在一定的局限性[11-12]，如制備過程復(fù)雜，費時費力等。因此，目前廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)實驗中的主要是多克隆抗體[13]。在制備多抗的過程中，動物的選擇一般根據(jù)抗體的用途和量來決定，也與抗原本身的性質(zhì)有關(guān)，一般選擇哺乳動物或者是禽類為主[14]。如本實驗所要獲得的SIGM多克隆抗體主要用于間接的標(biāo)記性診斷，因此選用異源的健康雄性新西蘭大白兔作為制備多抗的實驗動物。為排除免疫應(yīng)答時所產(chǎn)生的個體差異，實驗時常常將若干只兔子同時進行免疫[15]。制備的抗體具有較高的抗體效價是在臨床診斷或者是治療病癥時的主要要求。實驗室最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附法，也就是常說的ELISA檢測法[16-17]，ELISA檢測的抗體效價越高，其所具備的免疫原性就越好。

本實驗利用傳統(tǒng)的多克隆抗體的制備方法得到的MIGD蛋白效價高達1：∶512 000，說明MIGD蛋白具有較強的免疫原性，可以誘導(dǎo)羅非魚機體產(chǎn)生相應(yīng)較強的免疫應(yīng)答，可用于后續(xù)的研究當(dāng)中。

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（責(zé)編：張宏民）