武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者MTHFR基因多態(tài)性分布分析

韓瑞玲，李艷

武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者MTHFR基因多態(tài)性分布分析

韓瑞玲，李艷

目的：探討武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因多態(tài)性的分布。方法：選取缺血性腦卒中患者167例為卒中組，健康體檢者110例為對照組。通過基因芯片法檢測缺血性腦卒中相關(guān)的MTHFR基因677位點，并按基因型別分為野生型（C677C）、雜合型（C677T）、純合型（T677T）。結(jié)果：卒中組中野生型22.2%，雜合型43.1%，純合型34.7%。與對照組相比，野生型顯著減少，純合突變型顯著增多，有顯著性差異（P＜0.01）。不同性別腦卒中患者在MTHFR基因分型上差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結(jié)論：武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者中分布有較多的純合突變型MTHFR基因。

缺血性腦卒中；亞甲基四氫葉酸還原酶；MTHFR基因；基因多態(tài)性

缺血性腦卒中是我國目前嚴重威脅中老年人生命與健康的主要疾病之一。高同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）血癥是此類疾病的獨立危險因素之一[1]。5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是Hcy在人體內(nèi)代謝途徑中的關(guān)鍵酶，MTHFR基因最常見的677位點的多態(tài)性將導(dǎo)致該酶含量不足和（或）活性下降，從而造成Hcy在體內(nèi)蓄積，引起高Hcy血癥，損傷血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞，同時通過誘導(dǎo)紅細胞促凝活性，使機體處于高凝狀態(tài)，促進血栓形成[2-4]。本研究應(yīng)用基因芯片法檢測MTHFR基因677位點多態(tài)性，研究MTHFR基因多態(tài)性在武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者中的分布。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2015年12月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性缺血性腦卒中患者167例為卒中組，均經(jīng)顱腦CT或/和MRI確診，符合2014年中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會修訂的中國急性缺血性腦卒中診治指南的診斷標準[5]，男89例，女78例；年齡43～82歲，中位年齡61歲。另選取健康體檢者110例為對照組，男54例，女56例；年齡40～80歲，中位年齡59歲。2組均否認家族遺傳病病史，漢族，無血緣關(guān)系，均排除原發(fā)性高血壓病、冠心病、糖尿病、癌癥、腎功能衰竭等。2組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 試劑和儀器

e-Hyb全自動雜交儀、BE-2.0生物芯片識讀儀、全血基因組DNA提取試劑盒、MTHFR基因檢測DNA微陣列芯片法試劑盒、基因芯片圖像分析軟件（Baio Array Doc-tor V 2.0）（購于上海百傲科技有限公司），T100 PCR儀（購于美國Bio-rad公司），臺式高速離心機（購于美國Thermo公司），金屬?。ㄙ徲诤贾輮W盛儀器有限公司），渦旋振蕩器（購于江蘇海門其林貝爾儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 外周血DNA提取 靜脈采集受試者外周血1～2 mL（EDTA抗凝管抽取，4℃保存），按照DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取和純化。

1.3.2 PCR擴增 將不同濃度MTHFR基因特異性熒光引物（生物素標記）進行PCR反應(yīng)，對DNA標本擴增，使擴增出的目的片段以單鏈為主。PCR擴增總反應(yīng)體系為25 μL，即取MTHFR擴增液22 μL，加入反應(yīng)液A 1 μL和DNA模板2 μL。擴增條件：50℃5 min；預(yù)變性94℃5 min；變性94℃25 s，56℃25 s，72℃25 s，35個循環(huán)；72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物置于4℃冰箱儲存。

1.3.3 雜交顯色 雜交顯色原理是將擴增產(chǎn)物（帶生物素標記）與固定在醛基基片上的特異性MTHFR基因型檢測探針進行特異性雜交反應(yīng)，然后通過酶促顯色反應(yīng)，使特異性雜交信號呈現(xiàn)出顏色。具體操作如下：取出雜交顯色試劑盒。將反應(yīng)液B低速離心，吸取10 μL加入雜交緩沖液瓶中混勻，備用。臨用前，取出1支抗體，低速離心，加入1 mL抗體稀釋劑，振蕩混勻，制成抗體使用液，備用。吸取190μL雜交緩沖液，加入10 μL MTHFR擴增產(chǎn)物，混勻，制成雜交反應(yīng)液，加入試管中，放入試管架。準備各管試劑于2 mL離心管中，并將準備好的離心管插入試管盒中，將試管架放入雜交儀中，按照說明書設(shè)置并運行雜交程序。

1.3.4 基因分型結(jié)果分析 使用BE2.0生物芯片識讀儀掃描芯片，得到樣品DNA與MTHFR（677）基因位點的野生型和突變型探針雜交，不同的探針信號雜交后顯示出不同的基因位點圖像；采用基因芯片圖像分析軟件進行圖像掃描與數(shù)據(jù)分析，判斷待檢樣品的基因型，輸出檢測結(jié)果。根據(jù)分型檢測說明書的定義說明，MTHFR基因677位點的野生型為CC，雜合突變型為CT，純合突變型為TT。其中，CC型為MTHFR酶222位丙氨酸純合子，酶活性正常；CT型為MTHFR酶222位丙氨酸/纈氨酸雜合子，酶活性居中；TT型為MTHFR酶222位纈氨酸純合子，在37℃時活性比CC編碼的酶活性降低50%～60%[6]。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。采用Hardy-Weinberg平衡定律計算各等位基因頻率分布數(shù)據(jù)的可靠性。

2 結(jié)果

MTHFR等位基因的頻率符合Hardy-Weinberg平衡定律（χ2=2.562，P=0.109），故認為群體基因遺傳平衡，數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體?；蚨鄳B(tài)性采用生物芯片檢測并分類，見圖1。性別對于MTHFR基因型的分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。卒中組MTHFR野生型基因分布低于對照組，純合突變型基因分布高于對照組（P＜0.01），T等位基因頻率高于對照組（P＜0.01），見表2。

圖1 MTHFR基因分型生物芯片識別圖

表1 MTHFR基因型在不同性別腦卒中患者中的分布[n(%)]

表2 MTHFR基因型及等位基因的分布頻率[n(%)]

3 討論

MTHFR是Hcy代謝過程中最重要的催化酶，參與催化亞甲基四氫葉酸還原為N-5-甲基四氫葉酸，從而為Hcy代謝提供甲基。因此，MTHFR具有防止細胞內(nèi)Hcy積聚、避免血漿中Hcy水平升高的作用。人類MTHFR基因最常見的多態(tài)性為677位點的胞嘧啶（C）被胸腺嘧啶（T）所取代，即C677T。677位點主要編碼MTHFR與葉酸結(jié)合部位的結(jié)構(gòu)蛋白，具有C677T多態(tài)性的MTHFR與葉酸結(jié)合能力下降，酶活性降低，導(dǎo)致血漿Hcy水平升高，增加血栓形成風險。目前，國外相關(guān)研究表明MTHFR基因C677T點突變是血栓性疾病的遺傳性風險因素之一[7,8]。

本研究結(jié)果顯示，武漢地區(qū)缺血性腦卒中患者中，不同性別患者MTHFR基因的多態(tài)性分布差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），這與其他地區(qū)的報道相似[9,10]，表明性別對MTHFR基因多態(tài)性的分布影響不顯著。此外，本研究表明具有多態(tài)性的雜合型和純合型占77.8%，這比相關(guān)文獻報道的68%突變率要高[11]，本研究里雜合突變型略高于此報道的34.8%，純合突變型與此報道的33.2%相近。本研究與這些報道的基因多態(tài)性分布不同的原因可能與研究例數(shù)不同、研究對象的選擇標準不同及研究對象的遺傳背景不同等有關(guān)，尚需進行更大樣本的調(diào)查分析，才能取得更有價值的資料。

總之，MTHFR基因多態(tài)性在武漢地區(qū)腦卒中人群中分布比較普遍，這對于臨床實踐具有重要的指導(dǎo)意義。筆者認為盡早進行MTHFR基因多態(tài)性篩選，并對MTHFR雜合突變型或純合突變型的人群早期采取VitB12、葉酸等干預(yù)[12-14]，以降低血Hcy水平，對預(yù)防缺血性腦卒中有一定價值。

[1]Almawi WY,Khan A,Al-Othman SS,et al.Case-control Study of methylenetetrahydrofolate reductase mutations and hyperhomocysteinemia and risk of stroke[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2009,18:407-408.

[2]Wiernicki I,Millo B,Safranow K,et al.MMP-9,homocysteine and CRP circulating levels are associated with intraluminal thrombusthickness of abdominal aortic aneurysms:new implication of the old biomarkers[J]. Dis Markers,2011,31:67-74.

[3]Xie R,Jia D,Gao C,et al.Homocysteine induces procoagulant activity of red blood cells via phosphatidylserine exposure and microparticles generation[J].AminoAcids,2014,46:1 997-2 004.

[4]曾憲卿,何俊.急性腦梗死患者血漿同型半胱氨酸及相關(guān)硫醇物、葉酸、維生素B12水平變化及相關(guān)性研究[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2013, 8:26-29.

[5]中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會,中華醫(yī)學會神經(jīng)病學分會腦血管病學組.中國急性缺血性腦卒中診治指南[J].中華神經(jīng)科雜志,2015,48:246-257.

[6]Ghodke-Puranik Y,Puranik AS,Shintre P,et al.Folate metabolic pathway single nucleotide polymorphisms:a predictive pharmacogenetic marker of methotrexate response in Indian(Asian)patients with rheumatoid arthritis[J].Pharmacogenomics,2015,16:2019-2034.

[7]Joachim E,Goldenberg NA,Bernard TJ,et al.The methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism(MTHFR c.677C>T)and elevated plasma homocysteine levels in a U.S.pediatric population with incident thromboembolism[J].Thromb Res,2013,132:170-174.

[8]Hultdin J,Van Guelpen B,Winkvist A,et al.Prospective study of first stroke in relation to plasma homocysteine and MTHFR 677C＞T and 1298A＞C genotypes and haplotypes-evidence for an association with hemorrhagic stroke[J].Clin Chem Lab Med,2011,49:1 555-1 562.

[9]柳華,邱亞,劉偉,等.亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與川東北人群缺血性腦卒中的關(guān)聯(lián)[J].西部醫(yī)學,2014,26:701-706.

[10]Romero-Sánchez C,Gómez-Gutierrez A,Gómez PE,et al.C677T (RS1801133)MTHFR gene polymorphism frequency in a colombian population[J].Colomb Med(Cali),2015,46:75-79.

[11]肖湘雪,白樹風.MTHFR基因多態(tài)性與腦卒中的關(guān)系研究[J].中國實驗診斷學,2012,16:1311-1313.

[12]Holmes MV,Newcombe P,Hubacek JA,et al.Effect modification by population dietary folate on the association between MTHFR genotype,homocysteine,and stroke risk:a meta-analysis of genetic studies and randomised trials[J].Lancet,2011,378:584-594.

[13]Tamura Y,Inoue A,Ijiri Y,et al.Short-and long-term treatment with folic acid suppresses thrombus formation in atherogenic mice in vivo[J]. Pathophysiology,2014,21:169-175.

[14]`陳忠云,高金穎,李婧,等.伴高同型半胱氨酸血癥的缺血性腦卒中患者的危險因素研究[J].神經(jīng)損傷與功能重建,2012,6:422-424.

（本文編輯：王晶）

Analysis of Polymorphism Distribution of MTHFR Gene in Ischemic Stroke Patients in Wuhan

HAN Rui-ling,LI Yan.
Department of Clinical Laboratory,Renmin Hospital of Wuhan University,Wuhan 430060,China

Objective:To analyze polymorphism distribution of methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) gene in ischemic stroke patients in Wuhan.Methods:Total 167 cases of ischemic stroke patients were enrolled as stroke group,and 110 healthy cases were enrolled as control group.MTHFR genotypes were detected by the gene chip method,and for different genotypes of patients were divided into wild type(C677C),heterozygous type(C677T)and homozygous type(T677T).Results:In the stroke group,wild type accounted for 22.2%,heterozygous mutant type and homozygous mutant type accounted for 43.1%,34.7%,respectively.Compared with the control group,the wild type was significantly reduced while the homozygous mutant was significantly increased(P＜0.05).Different gender had no statistical significance in MTHFR genotype differences(P＞0.05).Conclusion:There are more homozygous mutant MTHFR genes in ischemic stroke patients in Wuhan area.

ischemic stroke;methylenetetrahydrafolate reductase;MTHFR gene;gene polymorphism

R741;R743

ADOI10.16780/j.cnki.sjssgncj.2016.03.004

武漢大學人民醫(yī)院檢驗科

武漢 430060

國家自然科學基金（No.81501427）

2016-01-14

李艷

yanlitf1120@163. com