大孔樹脂純化杠板歸總黃酮的工藝研究

毛磊　王琦燕　陶鋒

摘 要：目的：研究大孔樹脂純化杠板歸總黃酮的最佳工藝參數(shù)條件。方法：用紫外分光光度法測定，以杠板歸總黃酮的吸附率和解吸附率為考察指標(biāo)，考察杠板歸總黃酮在3種不同類型大孔吸附樹脂（D101，AB-8，NKA-9）上的吸附和解吸附行為，通過動態(tài)吸附試驗(yàn)考察不同上樣濃度、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇、pH值對洗脫效果的影響等因素選擇其工藝參數(shù)。結(jié)果：在實(shí)驗(yàn)條件下，最佳純化工藝為在pH=6條件下，以AB-8型大孔樹脂為吸附劑，體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇為洗脫劑，上樣濃度為21.34 mg·mL-1。結(jié)論；該方法簡便易操作，純化工藝的效果比較好。

關(guān)鍵詞：杠板歸；總黃酮；大孔樹脂；純化工藝

中圖分類號：TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-8937（2016）14-0165-02

1 概 述

杠板歸是蓼科蓼屬植物杠板歸Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分[1]，又名貫葉蓼、蛇不過、河白草、梨頭刺、蛇倒退等[2]，具有清熱解毒、利水消腫、散瘀止血、止咳祛痰、抗氧化、抗炎抗菌、抗腫瘤、護(hù)肝、降血壓等功效[3]。有研究報(bào)道杠板歸中的主要成分是槲皮素為主的黃酮類化合物[4]，黃酮類化合物能預(yù)防和治療老年人的高血壓和腦溢血，且有治療冠心病和心絞痛的作用[5]，藥用價(jià)值高。有效分離純化杠板歸中的黃酮類物質(zhì)，對開發(fā)和利用杠板歸的資源有比較重大的意義。

本論文應(yīng)用大孔樹脂進(jìn)行純化工藝的研究，對杠板歸中的總黃酮進(jìn)行純化，應(yīng)用靜態(tài)吸附-解吸附試驗(yàn)在3種不同類型的大孔樹脂中進(jìn)行篩選，優(yōu)選出最佳的大孔樹脂的型號—AB-8型，并采用動態(tài)吸附試驗(yàn)選擇AB-8型大孔吸附樹脂的適宜工藝條件，為其相關(guān)大生產(chǎn)應(yīng)用提供理論的參數(shù)和依據(jù)。

2 材料和儀器

2.1 材 料

杠板歸（浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二門診部提供，經(jīng)浙江醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校陶鋒副教授鑒定為蓼科植物杠板歸的干燥地上部分），AB-8，D101，NKA-9型大孔樹脂，其余試劑均為分析純。

2.2 儀 器

Sartorius BP 110S電子天平（德國）紫外分光光度計(jì)。

3 方法與結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

精密準(zhǔn)確地稱取蘆丁對照品20 mg，放置在100 mL的容量瓶中，加適量60%的乙醇溶解后，振蕩，定容，即獲得蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)對照液（200μg/mL）。依次精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL蘆丁對照液于25 ml的容量瓶中，補(bǔ)充60%的乙醇達(dá)6ml，再依次精密加入5%亞硝酸鈉溶液0.75 ml，搖勻后放置6 min；再精密加入10%硝酸鋁溶液0.75 ml，搖勻后放置6 min；精密加入10 mL4%氫氧化鈉溶液10 ml，以60%的乙醇定容，搖勻；靜置15 min后，以第1瓶為空白調(diào)零，測定各瓶溶液的吸光度的值。并以蘆丁的濃度C為x，測得吸光度A為y，得到以下回歸方程：

A=7.5958C+0.0280，r2=0.9997

表明蘆丁在8.2 ～57.4 μg/mL的范圍內(nèi)其線性關(guān)系較良好。

3.2 大孔樹脂篩選

3.2.1 大孔樹脂的預(yù)處理

取3種類型的樹脂適量，用95%的乙醇將其浸潤24 h，使其充分溶解膨脹，倒出乙醇和雜物后濕法裝柱，用95%的乙醇反復(fù)沖洗，不定時(shí)的檢查其流出的液體，至其與水混合后不出現(xiàn)白色渾濁為止。接著用大量的蒸餾水反復(fù)沖洗，直到?jīng)]有醇味，待用。

3.2.2 粗提液的制備

將杠板歸粉碎至粗粉，并用60%的乙醇25倍量，于70 ℃萃取5 min，取濾液；相同的方法再重復(fù)操作一次，兩次提取液放一起，回收乙醇，得到濃縮至42.67 mg·mL-1的杠板歸粗提液。

3.2.3 樣品的含量測定

用移液管精確移取樣品1.0 mL，放置在10 mL的容量瓶中，用純化水定容；精確移取對照品1.0 mL，放置在10 mL的容量瓶中，用純化水定容，于500 nm波長下測定其吸光度，以對照品計(jì)算其黃酮的含量。

3.2.4 靜態(tài)吸附與解吸附

精密稱取1.00 g D101、AB-8、NKA-9三種型號的樹脂在 50 mL的具塞錐形瓶中，加入10.67 mg·mL-1濃縮液10 ml置于搖床中，在30 ℃的條件下震搖24h，過濾，得濾液1，測定其黃酮濃度（C1）。

取出飽和的樹脂，在樹脂中加入50%乙醇10 mL，相同情況下震搖24 h，再過濾，得濾液2，測定其總黃酮的濃度（C2）。

吸附率=（C0-C1）×100%/C0（1）

吸附量=（C0-C1）×V/C0 （2）

解吸率=C2×100%/（C0-C1） （3）

式中：C0為原液的濃度（mg·mL-1）；

C1為吸附后剩余溶液的濃度（mg·mL-1）；

C2為洗脫液濃度（mg·mL-1）；

V為洗脫液體積（mL），結(jié)果見表1。

結(jié)果表明：采用AB-8型號的吸附率和解吸附率最好，純化效果最強(qiáng)。

3.3 AB-8樹脂的純化工藝條件優(yōu)選

3.3.1 上樣濃度的選擇

精確稱量已經(jīng)預(yù)處理的濕樹脂10 g，濕法裝入層析柱中。將3種不同濃度的樣品液10.67，21.34，32.01 mg·mL-1分別依次上柱，進(jìn)行動態(tài)吸附試驗(yàn)，接取流出液，水洗至無色后，用50%的乙醇洗脫，收集洗脫液，濃縮干燥后成固體，計(jì)算其中總黃酮的含量，結(jié)果，見表2。

結(jié)果表明：總體考量總黃酮的洗脫率和其純凈度，總結(jié)得21.34 mg·mL-1為上樣液的濃度。

3.3.2 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的選擇

精密稱取6份各3 g（濕重）AB-8型樹脂，濕法裝柱，精密移取10.67 mg·mL-1濃縮液各5 mL，分別裝柱，以純化水洗至流出液無色后，分別用30%，50%，60%，70%，80%，95%不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇進(jìn)行動態(tài)洗脫到洗脫液無色，收集洗脫液。測定收集到的洗脫液的總黃酮的濃度，計(jì)算洗脫液的洗脫百分率，并將洗脫液干燥成固體，測定其總黃酮含量，結(jié)果，見表3。

結(jié)果表明：總體考量總洗脫率和產(chǎn)物純度，確定70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇對樹脂洗脫的效果最佳。

3.3.3 PH的選擇

精確稱量經(jīng)預(yù)處理的AB-8濕樹脂10克，濕量法裝柱，用稀鹽酸調(diào)節(jié)其pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。對各pH值下的樹脂的洗脫率進(jìn)行了比較，并分別測定其中的黃酮的固體產(chǎn)物純度，結(jié)果，見表4。

結(jié)果表明：總體考量其洗脫率和產(chǎn)物的濃度，總結(jié)得出pH=6為最好的酸堿度。

3.4 漏曲線與洗脫曲線考察

按上述條件上樣并用大量水沖洗，以每10mL為1份收集此過程的流出液，測定杠板歸總黃酮的含量，以y為累積的滲出濃度，x為體積作圖，繪制滲漏曲線，如圖1所示。

4 討 論

通過比較3種不同極性的大孔樹脂（D101是非極性，AB-8是弱極性，NKA-9是極性），發(fā)現(xiàn)弱極性AB-8型的大孔吸附樹脂對杠板歸總黃酮的純化效果最好，富集能力比較強(qiáng)。用50%的乙醇洗脫，洗脫率達(dá)到71.1%，綜合性能好，適用于杠板歸總黃酮的純化。

經(jīng)過對純化工藝參數(shù)進(jìn)行考察，驗(yàn)證了中草藥杠板歸中總黃酮的適宜工藝為：上樣體積是10 mL，上樣液的濃度為 21.34 mg·mL-1，洗脫率達(dá)到67.34%，其純度達(dá)到74.03%；70%體積分?jǐn)?shù)的乙醇為洗脫濃度，洗脫率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而提高，產(chǎn)物的純度在70%的乙醇體積分?jǐn)?shù)下達(dá)到峰值74.76%；確定pH=6為最佳pH值，洗脫率雖然在pH=5相對較高，但綜合考慮產(chǎn)物的純度，得出pH=6時(shí)的純度較高，為62.14%，由此可見弱酸性或偏中性比較適合洗脫。該純化工藝操作簡易，可重復(fù)利用，可以作為杠板歸總黃酮的有效純化方法，能得到理想的純度，為進(jìn)一步利用開發(fā)中草藥杠板歸提供了研究基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 高雅，李豪，鐘明利，等.杠板歸總黃酮抗肝纖維化大鼠的作用及其機(jī)制 研究[J].華西藥學(xué)雜志，2015，（2）..

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