青藤堿對細(xì)胞凋亡的影響研究進(jìn)展

謝怡敏　高永翔

摘要：青藤堿是青風(fēng)藤的單體提取物，臨床廣泛運用于內(nèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和內(nèi)風(fēng)濕疾病，近來越來越多的文獻(xiàn)顯示青藤堿對細(xì)胞的凋亡有調(diào)節(jié)作用。本文就青藤堿對細(xì)胞的凋亡的影響作用做一綜述。

關(guān)鍵詞：青藤堿；凋亡

調(diào)亡，又稱程序性細(xì)胞死亡，是機體內(nèi)調(diào)控細(xì)胞死亡的一種重要機制，在多細(xì)胞生物的生長、發(fā)育及維持機體穩(wěn)態(tài)等方面發(fā)揮著非常重要的作用。調(diào)亡與壞死不同，壞死作為細(xì)胞死亡的另一種形式，它會導(dǎo)致急性的炎癥反應(yīng)，而調(diào)亡卻是指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序的主動死亡。調(diào)亡過多或過少都會導(dǎo)致疾病的發(fā)生。調(diào)亡的上調(diào)會造成細(xì)胞丟失紊亂，而下調(diào)則可能造成細(xì)胞增殖失控，進(jìn)而導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡包括一系列生物化學(xué)事件，引起細(xì)胞發(fā)生特征性形體變化和生物化學(xué)改變。形態(tài)學(xué)觀察細(xì)胞凋亡的變化是多階段的，細(xì)胞凋亡往往涉及單個細(xì)胞，即便是一小部分細(xì)胞也是非同步發(fā)生的。首先出現(xiàn)的是細(xì)胞體積縮小，連接消失，與周圍的細(xì)胞脫離，然后是細(xì)胞質(zhì)密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細(xì)胞色素C到胞漿，核質(zhì)濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約180～200bp片段；胞膜有小泡狀形成，膜內(nèi)側(cè)磷脂酰絲氨酸外翻到膜表面，胞膜結(jié)構(gòu)仍然完整，最終可將凋亡細(xì)胞遺骸分割包裹為幾個凋亡小體，無內(nèi)容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應(yīng)，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細(xì)胞吞噬。生物化學(xué)變化：①DNA的片段化：細(xì)胞凋亡的一個顯著特點是細(xì)胞染色體的DNA降解，這是一個較普遍的現(xiàn)象。這種降解非常特異并有規(guī)律，所產(chǎn)生的不同長度的DNA片段約為180-200bp的整倍數(shù)，而這正好是纏繞組蛋白寡聚體的長度，提示染色體DNA恰好是在核小體與核小體的連接部位被切斷，產(chǎn)生不同長度的寡聚核小體片段，實驗證明，DNA的有控降解是一種內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶作用的結(jié)果，該酶在核小體連接部位切斷染色體DNA，這種降解表現(xiàn)在瓊脂糖凝膠電泳中就呈現(xiàn)特異的梯狀Ladder圖譜，而壞死呈彌漫的連續(xù)圖譜；②大分子合成：細(xì)胞凋亡的生化改變不僅僅是DNA的有控降解，在細(xì)胞凋亡的過程中往往還有新的基因的表達(dá)和某些生物大分子的合成作為調(diào)控因子。如TFAR-19就是在細(xì)胞凋亡時高表達(dá)一種分子，再如在糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)鼠胸腺細(xì)胞凋亡過程中，加入RNA合成抑制劑或蛋白質(zhì)合成抑制劑即能抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

細(xì)胞凋亡主要有三種通路[1]：一種是以Fas和TNFR為代表死亡受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，凋亡發(fā)生過程中伴有caspase-8的活化；第二種是以線粒體為核心的凋亡途徑，細(xì)胞色素C從線粒體釋放到胞漿與凋亡相關(guān)因子1（APaf-1）繼而與Caspase-9結(jié)合，引起Caspase-9自身剪切激活，啟動凋亡過程中伴有caspase-9的活化；第三種是以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為核心的凋亡途徑，凋亡過程中伴有caspase-12的活化。

調(diào)控細(xì)胞凋亡的調(diào)控涉及許多基因，包括一些與細(xì)胞增殖有關(guān)的原癌基因和抑癌基因。其中研究較多的有ICE、Apaf-1、Bcl-2、Fas/APO-1、c-myc、p53、ATM等。

青藤堿（Sinomenine，SIN）是從防己科植物青藤（Sinomenium acutum （Thumb.） Rehd. Et Wils）及毛青藤（Sinomenium acutm （Thunb.） Rehd. et Wil. Var cinerrum Rehd. et al）的干燥藤莖青風(fēng)藤的單體提取物，其分子式為C19H23NO4，分子量為329.28，是青風(fēng)藤中所含的主要生物堿。青風(fēng)藤味苦性平，歸肝、脾經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、鎮(zhèn)痛、利小便之功效，用于治療風(fēng)濕痹痛、關(guān)節(jié)腫痛、麻痹瘙癢、水腫、腳氣等，其化學(xué)成分主要含有青藤堿、青風(fēng)藤堿、雙青藤堿等，其中青藤堿具有抗炎、免疫抑制、鎮(zhèn)痛、降壓、抗心律失常等多種藥理作用[2]。20世紀(jì)初期，Ishiwari從日本青風(fēng)藤中分離得到青藤堿單體，60年代我國學(xué)者朱任宏從國產(chǎn)青風(fēng)藤中也發(fā)現(xiàn)青藤堿。臨床已有正清風(fēng)痛寧片、緩釋片、鹽酸青藤堿注射液、毛青藤總堿片等制劑用于治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及心律失常，且取得良好療效，近年來還有用于治療慢性腎炎、抗氧化、抗腫瘤、戒毒的報道。對于青藤堿的作用以往較多關(guān)注于抗炎止痛方面，而對于青藤堿對凋亡的作用，了解較少。近來越來越多的文獻(xiàn)顯示青藤堿對細(xì)胞的凋亡有調(diào)節(jié)作用。本文就青藤堿對細(xì)胞的凋亡作用做一綜述。

1 組織細(xì)胞

張茵 [3]等通過流式檢測細(xì)胞凋亡率，MTT比色法檢測SIN對成纖維細(xì)胞生長的抑制作用，發(fā)現(xiàn)光鏡及熒光顯微鏡下可見核固縮，變圓。熒光染色增強等凋亡形態(tài)學(xué)變化。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，隨著SIN濃度及作用時間的增加，被處理的成纖維細(xì)胞凋亡率增加。

李樂[4]觀察不同劑量青藤堿對建立H2O2損傷模型的SD大鼠乳鼠心肌細(xì)胞凋亡率發(fā)現(xiàn)與空白對照組比較，心肌細(xì)胞凋亡率顯著增加，并隨時間延長其凋亡率不斷提高，SIN明顯抑制H2O2所誘導(dǎo)各個時間段的心肌細(xì)胞凋亡率，其機制可能與抗脂質(zhì)氧化、抑制心肌細(xì)胞表達(dá)NF-kB有關(guān)。

王文君[5]運用細(xì)胞培養(yǎng)，流式細(xì)胞術(shù)等方法，觀察SIN對體外培養(yǎng)的RBL-2H3肥大細(xì)胞增殖凋亡以及活化脫顆粒的影響，結(jié)果顯示SIN對肥大細(xì)胞增殖有明顯抑制作用，并能促進(jìn)肥大細(xì)胞凋亡，且對肥大細(xì)胞脫顆粒有較強抑制作用，因此發(fā)揮抗炎抗休克作用。

南華大學(xué)戴潤林通過流式檢測凋亡率，WB檢測p-ERK1/2蛋白表達(dá)，ELISA檢測IL-2表達(dá)，發(fā)現(xiàn)SIN能抑制IL-2的合成，并能誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的凋亡，其分子生物學(xué)機制可能與其抑制p-ERK1/2蛋白信號及IL-2相關(guān)。

但也有研究顯示雖然SIN能影響細(xì)胞的增殖，但與凋亡無關(guān)。王海東[6]采用MTT及磷脂酰絲氨酸外翻分析發(fā)現(xiàn)SIN能顯著抑制刀豆蛋白（ConA）和混合淋巴細(xì)胞MLC激活的單個核細(xì)胞增殖，隨著濃度的增加其抑制作用加強，并與環(huán)孢素A（CsA）能夠顯著抑制ConA激活單個核細(xì)胞增殖，其作用途徑不是通過誘導(dǎo)單個核細(xì)胞的凋亡。

2 腫瘤細(xì)胞

蔣廷樞[7]等采用MTT法檢測SIN對非小細(xì)胞肺腺癌細(xì)胞NCI-H460細(xì)胞增殖，采用流式細(xì)胞AnnexinV/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，TUNNEL法觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，掃描電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)：隨著SIN濃度的加大和作用時間的延長，其對細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，呈現(xiàn)明顯的時間-劑量效應(yīng)關(guān)系。流式檢測表明，SIN作用48h，有明顯劑量依賴效應(yīng)，隨濃度加大，早期凋亡和晚期凋亡細(xì)胞的比例都逐漸增加，通過電鏡觀察，SIN作用后，凋亡細(xì)胞體積變小，胞質(zhì)濃縮，胞漿內(nèi)空泡增多，染色質(zhì)固縮、邊集或碎裂成不規(guī)則塊狀，線粒體腫脹。

王曉潔[8]等采用MTT，流式，RT-PCR，WB檢測發(fā)現(xiàn)ERK，p-ERK表達(dá)隨處理濃度的增加而降低，MEK/ERK通路活化受抑制，且iSAPP-mRNA基因表達(dá)明顯降低，發(fā)現(xiàn)SIN能抑制肺癌細(xì)胞株Calu-1增殖，促進(jìn)凋亡，其機制與MEK及ERK通路抑制有關(guān)。

吳敏[9]通過MTT法檢測SIN及其卡鉑聯(lián)合對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響，及流式對SIN處理后宮頸癌Hela細(xì)胞周期及凋亡觀察，發(fā)現(xiàn)SIN對Hela細(xì)胞的增殖有抑制作用，其機制可能與影響細(xì)胞周期分布、促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

龔立[10]應(yīng)用形態(tài)學(xué)方法、AnnexinV熒光染色和流式檢測肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞凋亡，定量檢測ApO2.7及凋亡相關(guān)基因Bcl-2和Fas的表達(dá)，結(jié)果顯示SIN對HepG2細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用，并誘導(dǎo)凋亡，其機制可能與Bcl-2和Fas基因表達(dá)，改善線粒體功能有關(guān)。

張增弟[11]發(fā)現(xiàn)SIN在體外能抑制食管癌EC109細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡，其機制與抑制COX-2和Survivin蛋白表達(dá)有關(guān)。

張毅[12]等通過電鏡、MTT、流式檢測等發(fā)現(xiàn)SIN對人前列腺癌DU145細(xì)胞增殖有抑制作用，同時促進(jìn)DU145的凋亡，能有效抑制人前列腺癌。

Zhang JX[13]等運用CCK-8，Hoechst33258及Annexin V/PI研究SIN和5-FU（5氟尿嘧啶）單獨寄聯(lián)合使用對結(jié)腸癌的作用研究中，發(fā)現(xiàn)SIN和5-FU單獨及聯(lián)合運用于LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞株移植的裸鼠后，能明顯抑制腫瘤的生長，SIN或5-FU單獨使用，可抑制LoVo結(jié)腸癌細(xì)胞株的增殖和促進(jìn)凋亡，聯(lián)合使用效果較單獨使用效果明顯。WB顯示SIN和5-FU聯(lián)合作用的機制為促進(jìn)Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)，同時，聯(lián)合作用后未見明顯副作用。

Li X[14]等在研究鹽酸青藤堿對乳腺癌的作用時發(fā)現(xiàn)鹽酸青藤堿引起了MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌細(xì)胞株G1/S細(xì)胞周期停滯，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，引起了ATM/Chk2和ATR/Chh1通路調(diào)控的DNA損傷，而鹽酸青藤堿導(dǎo)致的DNA損傷是通過超氧化反應(yīng)增強使活性氧（ROS）增加導(dǎo)致，用抗氧化劑NAC預(yù)處理后能阻斷鹽酸青藤堿導(dǎo)致的DNA 損傷。鹽酸青藤堿的抗腫瘤促凋亡作用與MAPK信號通路有關(guān)，鹽酸青藤堿能引起細(xì)胞株p-ERK，p-JNK，p-p38劑量依賴性的增加。而NAC預(yù)處理后，鹽酸青藤堿引起的這些信號分子的增加減弱。

通過眾多研究者的結(jié)果向我們展示了青藤堿在細(xì)胞凋亡中的效應(yīng)。根據(jù)現(xiàn)有的資料，我們可以認(rèn)為，不同的細(xì)胞類型，不同的發(fā)育狀態(tài)及多種因素的影響，決定了青藤堿在特定環(huán)境中發(fā)揮促凋亡的效應(yīng)。進(jìn)一步深入研究青藤堿對凋亡的分子機制，將使我們更好地理解青藤堿對內(nèi)風(fēng)濕等免疫性疾病的治療機制，同時為克服腫瘤尋找新的方法。

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編輯/哈濤