生物反應(yīng)器工藝生產(chǎn)水痘疫苗的可行性研究

關(guān)瑜 孫衛(wèi)華

摘 要：目的：研究生物反應(yīng)器培養(yǎng)人二倍體MRC-5細(xì)胞，并用來制備水痘疫苗的可行性。方法： 將MRC-5細(xì)胞接種1L生物反應(yīng)器，使用GE公司Cytodex 1 微載體，濃度為：3g/L，工作體積300ml，待細(xì)胞長滿單層后接種水痘病毒，當(dāng)細(xì)胞病變約達(dá)75%以上時結(jié)束培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物及培養(yǎng)液，-80℃快速凍融一次，過濾除去微載體及細(xì)胞碎片，收獲病毒懸液，測定水痘病毒滴度。結(jié)果： 細(xì)胞接種反應(yīng)器后，大約3小時貼壁完成，5小時后開始伸展為長梭形，3天后細(xì)胞長成致密單層，接種水痘病毒后大約48小時病變，72小時收獲。收獲后的病毒滴度檢測結(jié)果為120，000 PFU/mL。結(jié)論 ：二倍體細(xì)胞可以在生物反應(yīng)器中正常生長，并且接種水痘病毒后產(chǎn)生病變，本試驗證明了應(yīng)用生物反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)二倍體細(xì)胞擴增水痘病毒，生產(chǎn)水痘疫苗的方法可行。

關(guān)鍵詞：水痘；疫苗；生物反應(yīng)器

中圖分類號： Q-3.2 文獻標(biāo)識碼： A 文章編號： 1673-1069（2016）15-195-2

0 引言

目前針對水痘和帶狀皰疹還沒有有效的治療方法，接種疫苗是預(yù)防水痘感染的唯一有效手段[1-2]。國外生產(chǎn)水痘疫苗采用細(xì)胞工廠工藝進行疫苗制造[3-4]，而國內(nèi)生產(chǎn)水痘疫苗仍然采用傳統(tǒng)的克氏瓶或轉(zhuǎn)瓶工藝進行疫苗生產(chǎn)[5-6]。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有勞動強度大，占地空間大，單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小，細(xì)胞生長密度低，瓶間差異較難控制等缺點，越來越不適應(yīng)GMP和WHO認(rèn)證的要求。生物反應(yīng)器培養(yǎng)技術(shù)在國外已有四十多年的應(yīng)用歷史，近十年來在中國開始逐漸普及[7]。由于其便捷安全的操作方式，可控性好，占用較少的空間等優(yōu)點，生物反應(yīng)器已被越來越多的國內(nèi)疫苗生產(chǎn)企業(yè)所接受，如遼寧成大、廣州諾成等生物科技有限公司生產(chǎn)的凍干人用狂犬病疫苗和乙腦疫苗[8-9]，另外國內(nèi)有些公司也逐漸開始研究微載體反應(yīng)器替代轉(zhuǎn)瓶或細(xì)胞工廠工藝生產(chǎn)甲肝疫苗、麻疹疫苗等產(chǎn)品[10]。本課題將生物反應(yīng)器工藝引入水痘疫苗的生產(chǎn)中研究其可行性，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及毒株

MRC-5細(xì)胞株來源：購買于ATCC；工作代細(xì)胞批號為：WCB20100901，代次為24代。

水痘毒株Oka株來源：購買于ATCC；工作代毒種批號為：20120201 W，代次為47代。

1.2 主要耗材

175cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶（CORNING）；細(xì)胞工廠（CORNING）；多道移液器、單道移液器（規(guī)格：20～200ul；100～1000 ul，Eppendorf）；玻璃刻度吸管（規(guī)格：5mL，10mL等）； 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（CORNING）；Cytodex 1 微載體（GE公司）。

1.3 主要設(shè)備

荷蘭Applikon生物反應(yīng)器；天津泰特儀器設(shè)備有限公司 電熱恒溫水浴箱；Thermo生物安全柜；三洋37℃ CO2恒溫培養(yǎng)箱；OLYMPUS CKX41倒置顯微鏡。

1.4 微載體培養(yǎng)方法

將MRC-5細(xì)胞接種1L生物反應(yīng)器，待細(xì)胞長滿單層后接種水痘病毒，具體步驟如下：

復(fù)蘇24代MRC-5細(xì)胞，至T175細(xì)胞瓶中，按1：2比例傳代3次至8瓶，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)為成纖維細(xì)胞形態(tài)，呈梭形，細(xì)胞排列致密無空隙，準(zhǔn)備用于生物反應(yīng)器培養(yǎng)。

反應(yīng)器用二甲基二氯硅烷硅化處理，微載體經(jīng)PBS溶脹并清洗處理后加入反應(yīng)器中，高壓濕熱滅菌反應(yīng)器及微載體，準(zhǔn)備培養(yǎng)細(xì)胞。（微載體使用量3g/L ，培養(yǎng)體積300mL，按培養(yǎng)面積比1：2上罐傳代）

用0.25%胰酶消化8瓶長滿單層T175細(xì)胞后，加入預(yù)熱的細(xì)胞生長液吹打均勻，接種至1L反應(yīng)器中，使用體積為300mL。將1L反應(yīng)器控制設(shè)定溫度：37℃；pH值：7.2；溶氧值：40%；調(diào)整適當(dāng)攪拌速度，以微載體混勻且不沉淀的最小攪拌速度為最佳。每天換液300mL，同時取樣觀察細(xì)胞生長狀態(tài)。待微載體表面的細(xì)胞長滿均一單層時接種水痘病毒，設(shè)定溫度：35℃；pH值：7.3；溶氧值：35%；觀察細(xì)胞病變情況，待細(xì)胞病變約達(dá)75%以上時結(jié)束培養(yǎng)，收獲細(xì)胞培養(yǎng)物及培養(yǎng)液，-80℃快速凍融一次，過濾除去微載體及細(xì)胞碎片，收獲病毒懸液，測定水痘原液病毒滴度。

1.5 檢驗方法

測定病毒滴度是用蝕斑試驗的方法，取人二倍體細(xì)胞MRC-5，以pH7.2、含10%小牛血清的MEM細(xì)胞培養(yǎng)基接種6孔板，每孔加密度為1×105個/mL的MRC-5細(xì)胞懸液3mL，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～4天，待MRC-5細(xì)胞形成均勻、致密的細(xì)胞單層后，棄去原有的生長液。用含3%小牛血清、5%蔗糖和1%谷氨酸鈉的PBS緩沖液將待檢品做10倍系列稀釋，一般取10-2～10-5稀釋度的樣品接種6孔板，每稀釋度接種2孔，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱吸附60分鐘，期間每20分鐘輕輕振搖一次。吸附完畢補加pH 7.4、含3%小牛血清的MEM培養(yǎng)基維持液，3m1/孔，置37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)7天。培養(yǎng)到期后，棄去原生長液，每孔加1～2mL 0.25%的考馬斯亮藍(lán)染液，染色5～10分鐘，棄去考馬斯亮藍(lán)染色液，將六孔板用PBS沖洗干凈，在閱片燈燈光背景下點數(shù)空斑個數(shù)，計算病毒滴度，計算方法如下：

空斑個數(shù)×稀釋倍數(shù)×10= PFU/mL，即為待檢樣品的滴度。

2 結(jié)果

在顯微鏡下觀察到細(xì)胞接種反應(yīng)器后，細(xì)胞懸液中游離細(xì)胞逐漸減少，大約3小時貼壁完成。5小時后開始伸展為長梭形，每天換液300ml，大約3天后細(xì)胞長成致密單層，接種水痘病毒后大約48小時發(fā)現(xiàn)病變，72小時病變達(dá)到75%，收獲水痘病毒原液。

2.1 細(xì)胞接種反應(yīng)器后的生長狀況

2.2 收獲液病毒滴度

收獲后的水痘原液病毒滴度檢測結(jié)果為120，000 PFU/mL。

3 討論

人二倍體細(xì)胞作為病毒培養(yǎng)基質(zhì)細(xì)胞，最重要的優(yōu)點是安全性強，無內(nèi)外源病毒因子感染，而且已證明無致癌性，但二倍體細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)條件下難以生產(chǎn)獲得高滴度的病毒，因此如何使用人二倍體細(xì)胞獲得高滴度水痘疫苗，成為近年來的研究重點。而生物反應(yīng)器條件下培養(yǎng)不但可以增加細(xì)胞的密度與數(shù)量，且可通過主動通氣加強氣體交換，穩(wěn)定的控制溫度溶氧pH等參數(shù)，創(chuàng)造利于細(xì)胞生長和病毒繁殖的環(huán)境，易獲得高滴度的病毒原液，生產(chǎn)高品質(zhì)疫苗原液。

通過本試驗發(fā)現(xiàn)二倍體細(xì)胞在反應(yīng)器中長勢良好，接種病毒后產(chǎn)生正常病變，且滴度較高，本試驗初步證明反應(yīng)器動態(tài)培養(yǎng)二倍體細(xì)胞，擴增水痘病毒，生產(chǎn)水痘疫苗的方法可行。該方法的工藝參數(shù)及疫苗產(chǎn)量還有待進一步深入的進行研究。

參 考 文 獻

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