海南黃芩揮發(fā)油成分分析及生物活性研究

陳欣 陳光英 陳文豪 韓長日 宋小平 吳燕

摘 要 采用水蒸氣蒸餾法提取海南黃芩揮發(fā)油，用GC-MS對其化學成分進行分離鑒定；采用微量稀釋法對揮發(fā)油進行抗菌活性測試和MTT比色法進行抗腫瘤活性測試。結果從海南黃芩揮發(fā)油中分離得到71個峰，鑒定了其中的54個成分，占揮發(fā)油總量的90.42%，其主要成分為：10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.3%）、石竹烯（7.92%）、鄰苯二甲酸單乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）。藥理活性研究表明，海南黃芩揮發(fā)油對白色葡萄球菌等7種菌株未顯示抑制活性，而對宮頸癌（Hela）細胞和肺腺癌（A549）細胞具有較好的抑制活性，其IC50值分別為36.56和29.21 μg/mL。海南黃芩揮發(fā)油具有豐富的化學成分，藥理活性表明，海南黃芩具有較好的抗腫瘤活性。

關鍵詞 海南黃芩 ；揮發(fā)油 ；化學成分 ；抗腫瘤活性

中圖分類號 TS201.2 文獻標識碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.05.019

Abstract The essential oil is extracted by steam distillation and the chemical composition of oil is separated and identified by GC-MS. The antibacterial and antitumor activities of volatile oils are tested by microdilution methods and the MTT assay， respectively. 71 chromatographic peaks are detected and 54 compounds are identified， which accounted for 90.42% of the total essential oil. The main components were 10S， 11S-himachala-3（12），4-diene （15.3%）， caryophyllene （7.92%）， monoethyl hexylphthalate （6.99%） and 2-methoxy-4-vinylpheno （6.54%）. The analysis of pharmacological activity shows that the essential oil has no inhibitory activity agaist Staphylococcus albus， but has inhibitory activity agaist Hela and A549. The IC50 values were 36.56 and 29.01 μg/mL， respectively. The Hainan Scutellaria's volatile oil have abundant types of chemical constituents， its antitumor activity is strong.

Keywords Scutellaria hainanensis ； essential oil ； chemical constituent ； anti-tumor activity

唇形科黃芩屬（Scutellaria）植物廣泛分布于溫帶和熱帶山脈地區(qū)，遍及歐洲、北美和東亞，約有360多個物種。在我國明確記載的有102種，50個變種，多為藥用。2010年版《中國藥典》中收錄了2種：黃芩（S. baicalensis）和半枝蓮（S. barbata D）[1]?，F(xiàn)代研究表明，黃芩屬植物具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗驚厥、抗菌、抗病毒和保肝等作用。其中，黃酮和萜類化合物是黃芩屬植物的特征成分，黃酮如黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素具有抗腫瘤、抗HIV、抗菌、抗炎和抗驚厥活性；而萜類化合物Jodrellin A、Jodrellin B、scutalbin A和scutecyprol B表現(xiàn)出很好的抗拒食活性[2]。海南黃芩為唇形科黃芩屬植物，為多年生草本，長于石山上，是海南特有物種[3]。目前尚未見關于海南黃芩化學成分與藥理活性的文獻報道。本文采用水蒸氣蒸餾的方法提取海南黃芩的揮發(fā)油，并且采用GC-MS聯(lián)用技術對其揮發(fā)油進行成分分析，同時采用紙片瓊脂擴散法和MTT比色法分別研究其抗菌和抗腫瘤活性。本研究對海南黃芩揮發(fā)油的化學成分及其抗菌抗腫瘤活性進行了研究，以期為海南黃芩的開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料

海南黃芩（Scutellaria hainanensis），2014年9月采自海南省昌江黎族自治縣，經(jīng)中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所海南分所李蓉濤研究員鑒定，標本存放于海南師范大學熱帶藥用植物化學教育部重點實驗室。

供試菌種及腫瘤細胞：白色葡萄球菌（Staphylococcus）、蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、大腸桿菌（Escherichia coli）、四聯(lián)球菌（Pediococcus） 和藤黃八疊球菌（Micrococcus luteus）均購于中國科學院微生物研究所；宮頸癌（Hela）、肺腺癌（A549）為中科院上海生物所提供。

1.1.2 儀器與試劑

5975B/6890N 型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國安捷倫公司）、Elx800型酶標儀（美國寶特公司）、智能恒溫恒濕箱（寧波海曙賽福實驗儀器廠）、高壓滅菌鍋（日本森展企業(yè)有限公司）、ELx808吸收光酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）、超凈工作臺（蘇州凈化設備廠）、可調(diào)式移液器（BRAND公司）、96孔細胞培養(yǎng)板（Pore公司）、電子天平（Sartious公司）、二甲基亞砜（DMSO）（天津市化學試劑二廠）、RPMI 1640培養(yǎng)液（Gibco公司）、胰酶（Gibco公司）、四甲基偶氮唑藍（MTT）（Sigma公司）、胎牛血清（杭州四季青生物科技有限公司）。實驗所用試劑均為市售分析純，水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 實驗條件

GC-MS分析色譜條件：石英毛細管柱HP-FFAP（250 m×30 m×0.25 m），初始溫度50℃，保持1 min，以2℃/min速率升溫到70℃保持2 min，以5℃/min升溫速率到280℃保持至完成分析，載氣為He（99.99%），柱流量1.0 mL/min，進樣口溫度250℃，分流比50∶1。質(zhì)譜條件：電離方式為EI電子源，電子能量為70 eV，離子源溫度為230℃，四級桿溫度為150℃，溶劑延遲為2.5 min，全掃描（Scan）采集模式，質(zhì)量范圍m/z 38～698，掃描間隔0.50 s，EM電壓1 400 V。

1.2.2 揮發(fā)油的提取

海南黃芩揮發(fā)油的提?。簩敫稍锏暮Ｄ宵S芩總重量230 g，剪碎，分2次用水蒸氣蒸餾法[5]提取揮發(fā)油，再用無水乙醚萃取3次，萃取液加無水硫酸鈉干燥，30℃水浴蒸餾回收乙醚，最后得到具有芳香性氣味，淡黃色油狀液體，重量為1.296 g，得油率為0.56%。

1.2.3 體外抗菌實驗

采用微量稀釋法，對以下7種致病菌菌株進行抗菌測試：藤黃八疊球菌（Micrococcus luteus）ATCC 11001，大腸桿菌（Escherichia coli）ATCC 25922，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 27154，白色葡萄球菌（Staphylococcus albus）ATCC 8799，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）ACCC 11077，四聯(lián)球菌（Micrococcus tetragenus）ATCC 13623和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）ACCC 11060。將一定量的海南黃芩揮發(fā)油溶于1 mL的DMSO中，得到儲備溶液。菌種在37℃條件下，接種于營養(yǎng)肉湯中震蕩過夜，使用時稀釋至106 cfu/mL。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基作空白對照，DMSO用作陰性對照，環(huán)丙沙星作陽性對照。

1.2.4 體外抗腫瘤實驗

揮發(fā)油抗腫瘤活性測試：用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液（DMEM）配成單個細胞懸液，以每孔5 000個細胞接種到96孔板，每孔體積100 μL，貼壁細胞提前12 h接種培養(yǎng)。加入待測樣品溶液（固定濃度40 μg/mL初篩，在該濃度對腫瘤細胞生長抑制在50%附近的化合物設5個濃度進入梯度復篩）100 μL，每孔終體積100 μL，每種處理均設3個復孔。37℃培養(yǎng)48 h后，每孔加MTT溶液20 L。繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加150 L的DMSO溶液，使結晶物充分溶解。選擇490 nm波長，酶標儀（BioTek ELx800）讀取各孔光吸收值，記錄結果。計算化合物的IC50值[6]。

2 結果與分析

2.1 海南黃芩揮發(fā)油成分

本實驗利用水蒸氣蒸餾法制備海南黃芩揮發(fā)油得到特殊香氣的淺黃色油狀物。用毛細管色譜法對揮發(fā)油樣品進行測定，GC共分析出71個峰，通過色譜峰面積歸一化法測得揮發(fā)油中各組分的相對百分含量[4]，根據(jù)GC-MS聯(lián)用所得的質(zhì)譜信息，經(jīng)用標準質(zhì)譜檢索庫計算機檢索，共鑒定出54個化學成分，占揮發(fā)油總質(zhì)量的90.42%。其主要成分為10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.3%）、石竹烯（7.92%）、鄰苯二甲酸單乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）（表1）。

2.2 海南黃芩揮發(fā)油抗菌結果與分析

目前，針對黃芩屬植物揮發(fā)油抗菌活性研究較少，但均表現(xiàn)出很好的抑制活性。如：Charu C. Pant等[7]對Scutellaria grossa的揮發(fā)油進行抗菌活性測試，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、革蘭氏陰性菌、肺炎克雷伯菌和沙門氏菌有顯著的抑制活性；Anan d B. Melkani等[8]對Scutellaria repens進行研究，發(fā)現(xiàn)其揮發(fā)油對大腸桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯菌有顯著的抑制活性。因此，本實驗利用微量稀釋法對海南黃芩揮發(fā)油抑菌活性進行研究，然而，發(fā)現(xiàn)其對白色葡萄球菌、蠟狀芽孢桿菌等7種細菌未顯示抑制活性，MIC值均大于20 μg/mL。測試結果見表2。

2.3 海南黃芩揮發(fā)油抗腫瘤結果與分析

目前，鮮見關于黃芩屬植物揮發(fā)油的抗腫瘤活性測試的報道。本實驗采用MTT比色法對揮發(fā)油進行抗腫瘤活性研究，發(fā)現(xiàn)其對宮頸癌（Hela）和肺腺癌（A549）2種細胞株具有較好的抑制活性，IC50值分別為36.56和29.21 μg/mL 。

3 討論與結論

本實驗通過對海南黃芩的揮發(fā)油成分進行研究，分析出71個峰，并鑒別出了其中的54個成分，占揮發(fā)油總量的90.42%。其中主要成分為10S，11S-雪松醛-3（12），4-二烯（15.30%）、石竹烯（7.92%）、鄰苯二酸單乙基己基酯（6.99%）和4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（6.54%）等。藥理活性實驗結果表明，海南黃芩揮發(fā)油未顯示抗菌活性，而對宮頸癌（Hela）和肺腺癌（A549）2種細胞株有較好的抑制活性，IC50值分別為36.56和29.21 μg/mL。

在海南黃芩的揮發(fā)油的主要成分中，石竹烯（含量為7.92%）對皮膚炎癥及消化系統(tǒng)潰瘍有較好的療效，具有抗氧化作用[9]，廣泛應用于香料、食品工業(yè)、和藥物合成中間體等領域。因此，可以考慮將海南黃芩揮發(fā)油作為食品的抗氧化劑，當然其在食品貯藏期間的穩(wěn)定性有待進一步研究。將海南黃芩揮發(fā)油與張福維等[10]報道的黃芩地上部分揮發(fā)性物質(zhì)成分和鞏江等[11]報道的半枝蓮揮發(fā)性成分進行比較，同屬的3種植物揮發(fā)性物質(zhì)的組成和含量有較大的差異。本實驗為黃芩、半枝蓮和海南黃芩3種藥用植物的中藥標準提供了理論依據(jù)。

參考文獻

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