小麥紋枯病菌拮抗菌株X2—3的鑒定及其抗菌特性分析

湯谷月 劉朝霞 趙寶梅 劉春菊 韓超

摘 要：從小麥根際土中分離到一株對(duì)小麥紋枯病菌拮抗活性較高的菌株X2-3，為進(jìn)一步利用該菌株，對(duì)其進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其抗菌特性進(jìn)行了分析。根據(jù)菌落形態(tài)和產(chǎn)酶特征及16S rDNA分析，將菌株X2-3鑒定為辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）。平板對(duì)峙法測(cè)定其抑菌譜發(fā)現(xiàn)，X2-3對(duì)Rhizoctonia cerealis、Thielaviopsis basicola等多種植物病原真菌和Phytophthora parasitica等卵菌表現(xiàn)明顯的抑菌活性，但對(duì)Xanthomonas oryzae pv. oryzae和Ralstonia solanacearum等革蘭氏陰性細(xì)菌沒有拮抗活性?？咕镔|(zhì)穩(wěn)定性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粗提純的抗菌物對(duì)蛋白酶K和溫度不敏感，表明該物質(zhì)可能屬于非線性蛋白，且具有一定的耐熱性。

關(guān)鍵詞：辣椒溶桿菌； 鑒定； 抗菌物質(zhì)； 拮抗活性

中圖分類號(hào)：S482.2+92文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2016）05-0093-05

Abstract A strain X2-3 that showed higher antifungal activity to Rhizoctonia cerealis was isolated from wheat rhizosphere soil. Then it was identified and its antifungal characteristics were analyzed for further utilization. The strain X2-3 was identified as Lysobacter capsici based on the cultural properties and 16S rDNA sequence. Antimicrobial spectrum analysis indicated that X2-3 showed obvious antimicrobial activities to plant pathogenic fungi Rhizoctonia cerealis， Thielaviopsis basicola and oomycetes Phytophthora parasitica， but not to gram-negative bacteria such as Xanthomonas oryzae pv. oryzae and Ralstonia solanacearum. The stability analysis results showed that the antimicrobial substance crudely purified from strain X2-3 were not sensitive to protease K and high temperature， which indicated that it might be nonlinear protein and had certain heat resistance.

Key words Lysobacter capsici；Identification； Antifungal substance； Antimicrobial activity

溶桿菌屬（Lysobacter）在自然環(huán)境中多見于土壤和水體等，由于該類細(xì)菌生長較慢，與芽孢桿菌、假單孢桿菌等細(xì)菌相比，其分離純化較為困難，分離出現(xiàn)的比例相對(duì)較低[1]。溶桿菌為革蘭氏陰性菌，菌體桿狀，無鞭毛，可滑行，基因組G+C含量較高，在NA培養(yǎng)基菌落乳白色或淡黃色，圓形，表面光滑。目前已知的溶桿菌有20個(gè)種，包括產(chǎn)酶溶桿菌（Lysobacter enzymogenes）、抗生素溶桿菌（L. antibioticus）和膠狀溶桿菌（L. gummosus）等[2]。溶桿菌屬因具有如下特性而備受關(guān)注：（1）溶桿菌可產(chǎn)生蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和纖維素酶等多種胞外酶，這些酶類對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌和線蟲具有溶菌活性；（2）可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類、大環(huán)肽類和縮肽類等多種抗生素，在抗生素的研制和開發(fā)中有重要價(jià)值[3]。溶桿菌在植物病害防治中已有一些研究和報(bào)道，其中研究較多的為L. enzymogenes，研究發(fā)現(xiàn)，L. enzymogenes菌株C3對(duì)小麥赤霉病、高羊茅葉斑病和菜豆銹病等都有較好的防治效果[4，5]。

紋枯病是小麥的重要病害之一，由于該病的病原菌主要存在于病田土壤，藥劑防治較為困難，利用土壤有益微生物防治該類病害是有效的措施之一。本研究從小麥根際土壤中分離到一株對(duì)紋枯病菌表現(xiàn)較強(qiáng)抑菌活性的菌株，經(jīng)16S rDNA序列比對(duì)，結(jié)合培養(yǎng)特征等，對(duì)菌株X2-3進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步利用該菌株提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

菌株材料：菌株X2-3參照韓超等[6]的方法從小麥根際土壤中篩選獲得。用于抗菌作用測(cè)定的病原菌包括小麥根腐病菌（Bipolaris sorokiniana）、小麥紋枯病菌 （Rhizoctonia cerealis）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasitica）和群結(jié)腐霉（Pythium myriotylum）等，所用菌株詳細(xì)見表1。所用供試病原菌均由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供。

培養(yǎng)基： 細(xì)菌篩選、培養(yǎng)用NA培養(yǎng)基；細(xì)菌抗菌物質(zhì)產(chǎn)生及分析用LB培養(yǎng)基；真菌培養(yǎng)及抗菌作用分析用PDA培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 菌株鑒定 菌落形態(tài)觀察：將篩選出的菌株X2-3劃線于NA培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落特征，包括菌落形態(tài)、大小、顏色等。

產(chǎn)酶特性分析：以NA為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以0.1%（W/V）昆布多糖替代葡萄糖為唯一碳源，分析該菌株是否具有產(chǎn)葡聚糖酶的能力；蛋白酶分析以終濃度為1%（W/V）的脫脂奶粉代替蛋白胨，分析該菌株是否具有產(chǎn)蛋白酶的能力。將在NA培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的X2-3菌體稀釋至OD600為0.5，取10 μL滴于測(cè)試用培養(yǎng)基平板，28℃培養(yǎng)3 d，觀察透明圈有無及大小，分析是否具有產(chǎn)酶能力。

分子鑒定：菌株X2-3在LB培養(yǎng)基28℃下振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，8 000 r/min離心收集菌體。參照Rainey等（1996）[7]的方法提取基因組DNA。用16S rDNA通用引物（27F： AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R： GGTTACCTTGTTACGACTT）進(jìn)行PCR擴(kuò)增[8]。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：Taq酶（ 5 U/μL） 0.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L） 2.0 μL，10 ×Buffer （Mg2+） 2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，最后補(bǔ)足17.0 μL雙蒸水。PCR反應(yīng)條件參照韓超等[6]的方法。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，用膠回收試劑盒回收目的片段，送上海生工測(cè)序。將所測(cè)16S rDNA序列用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性比對(duì)，用分析軟件DNAMAN v5.2.2進(jìn)行序列同源性分析。

1.2.2 X2-3的抑菌活性測(cè)定 以表1病原菌作為供試菌進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。菌株X2-3在NA培養(yǎng)基培養(yǎng) 2 d，用無菌水稀釋至OD600為0.5，取15 μL菌液滴于PDA或NA平板的中心位置（抗真菌或卵菌分析用PDA培養(yǎng)基，抗細(xì)菌分析用NA培養(yǎng)基），于28℃培養(yǎng)2 d，備用。

用直徑5 mm打孔器從培養(yǎng)的真菌和卵菌的菌落邊緣打取菌落圓片，移至PDA培養(yǎng)基，距X2-3菌落約3 cm。28℃繼續(xù)培養(yǎng)2～5 d，觀察記錄抑菌圈大小，根據(jù)抑菌圈大小判斷該菌株的拮抗效果。

對(duì)細(xì)菌的抑菌能力采用平板噴霧法測(cè)定，把培養(yǎng)好的Xanthomonas oryzae pv. oryzae和Ralstonia solanacearum分別制成1×108 cfu/g左右的孢子懸浮液，用無菌微量噴霧器均勻噴在X2-3菌落周圍，28℃繼續(xù)培養(yǎng)2 d，觀察記錄抑菌圈有無及大小。

1.2.3 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測(cè)定 菌株X2-3在LB培養(yǎng)液經(jīng)28℃、180 r/min培養(yǎng)72 h，于10 000 r/min、4℃離心20 min，重復(fù)2次，得到無菌濾液。參照任嘉紅等[9]的方法，將1 L無菌濾液經(jīng)硫酸銨沉淀、甲醇萃取、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等處理后，共得到0.3 g 粗提物，用無菌水將粗提物配置成濃度約250 mg/mL，備用。

以立枯絲核菌為指示菌，采用瓊脂孔擴(kuò)散對(duì)峙法，測(cè)定X2-3粗提物對(duì)溫度和蛋白酶K的穩(wěn)定性。

熱穩(wěn)定性測(cè)定：將粗提液用1.5 mL離心管分裝，分別在40、50、60、70、80、90℃和100℃等溫度下處理30 min，備用。將直徑 5 mm的立枯絲核菌菌絲塊移至PDA平板中央，并在距菌絲塊約2 cm處分別打孔，每孔加入30 μL上述粗提液，以室溫（25℃）保存的未經(jīng)加熱處理的粗提液為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。28℃培養(yǎng)2 d，測(cè)量記錄抑菌圈大小，分析抑菌效果。

蛋白酶K穩(wěn)定性測(cè)定：取0.5 mL粗提液，加入蛋白酶K溶液使其終濃度為0.1 mg/mL，充分混勻后，置37℃水浴鍋中溫育2 h使其充分反應(yīng)，以未加蛋白酶K處理為對(duì)照。參照上述方法測(cè)定抑菌活性，每處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株X2-3的培養(yǎng)特征

菌落形態(tài)特征：菌株X2-3在NA培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h形成圓形菌落，乳白色至淡黃色、不透明、有光澤、不產(chǎn)生熒光，表面光滑、無褶皺、邊緣整齊，菌落粘稠，流動(dòng)性強(qiáng)（圖1a）。

產(chǎn)酶特性：圖1b和1c分別是X2-3在以昆布多糖為唯一碳源和脫脂奶粉為氮源的培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特征。可見，X2-3在昆布多糖和脫脂奶粉培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)3 d，在菌落周圍都可產(chǎn)生明顯的透明圈，表明該菌株具有β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶產(chǎn)生能力，顯示菌株X2-3具有溶桿菌的培養(yǎng)特征。

2.2 菌株X2-3的分子鑒定

對(duì)菌株X2-3的DNA進(jìn)一步用細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在1 400 bp左右擴(kuò)增出一條單一條帶。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行了序列測(cè)定，對(duì)所測(cè)序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中與已報(bào)道的細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行BLAST比較，并用MEGA 5.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系（圖2）。結(jié)果顯示，菌株X2-3與已報(bào)道的辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）菌株AZ78（基因登錄號(hào)KF196834）和YC5194（基因登錄號(hào)NR044250）親緣關(guān)系最近，相似性在99.8%，分在同一分支，進(jìn)一步確定該菌株為Lysobacter capsici（X2-3基因登錄號(hào)為KP978015）。

2.3 菌株X2-3抗菌活性分析

利用平板對(duì)峙法，分析了菌株X2-3對(duì)10種病原菌的抑制作用，結(jié)果見表1。從表1可見，X2-3對(duì)R. cerealis、Thielaviopsis basicola、B. sorokiniana等植物病原真菌和P. parasitica、P. myriotylum等植物病原卵菌均表現(xiàn)較強(qiáng)的抑菌效果，其中，以對(duì)R. cerealis、T. basicola和B. sorokiniana抑菌效果最好，抑菌圈半徑均在10 mm以上，對(duì)R. solani和P. myriotylum效果較差，抑菌圈直徑大約在7～8 mm之間；對(duì)X. oryzae pv. oryzae和R. solanacearum等革蘭氏陰性細(xì)菌沒有抑菌作用。部分抑菌效果見圖3。

2.4 菌株X2-3抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

以立枯絲核菌為指示菌，分析了X2-3粗提物對(duì)蛋白酶K和溫度的敏感性。圖4A是不同溫度處理后粗提物的抗菌活性，可見，粗提物在不同溫度下處理30 min，其抗菌活性差異明顯。隨處理溫度的升高，抑菌圈直徑越來越小，即抗菌活性越來越小，其中40℃處理后其抗菌活性與對(duì)照幾乎沒有差異，50～80℃處理，粗提物仍有較好的抑菌作用，相互間差異不顯著， 90～100℃時(shí)活性雖顯著降低，但仍有部分抑菌活性，表明該物質(zhì)對(duì)溫度有一定忍耐力。

蛋白酶K 是一種作用廣譜的蛋白酶，能夠以線性蛋白為底物降解多種蛋白質(zhì)。X2-3粗提物經(jīng)蛋白酶K處理2 h，其抗菌活性與對(duì)照幾乎沒有差異（圖4B），說明該物質(zhì)對(duì)蛋白酶K不敏感，可能不屬于線性蛋白。

3 結(jié)論與討論

植物根際微生物群體存在多樣性，它們?cè)谥参锊『Ψ乐?、促進(jìn)植物生長等方面發(fā)揮了重要作用。溶桿菌作為其中的重要類群之一，也顯示多種生物功能。據(jù)Christensen和Cook報(bào)道，溶桿菌對(duì)真菌、革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌及病原線蟲都有一定的拮抗作用[10]。目前關(guān)于溶桿菌的研究多集中于產(chǎn)酶溶桿菌[3，11]，對(duì)其它種類溶桿菌的研究相對(duì)較少。本研究通過培養(yǎng)特征及分子生物學(xué)分析，將分離自小麥根際土的菌株X2-3鑒定為辣椒溶桿菌（Lysobacter capsici）。通過抗菌作用分析，發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)多種真菌、卵菌有較強(qiáng)的抑菌活性，但對(duì)革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌沒有拮抗活性。

許多研究表明，溶桿菌可通過分泌胞外酶、產(chǎn)生表面活性物質(zhì)和抗生素等多種機(jī)制，破壞病原物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或抑制病原物生長[2]。研究發(fā)現(xiàn)，L. enzymogenes可產(chǎn)生不止一種抗菌物質(zhì)，據(jù)Lou等報(bào)道，L. enzymogenes菌株OH11和C3都可產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酰胺類抗真菌成分，該成分具有抗菌譜廣和熱穩(wěn)定等特征[12]。本研究初步分析發(fā)現(xiàn)，辣椒溶桿菌X2-3產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)也具有耐熱性，并且對(duì)蛋白酶K不敏感，表明該抗菌物質(zhì)可能是一種環(huán)形肽，但與L. enzymogenes產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)在結(jié)構(gòu)上是否有相同之處，有待進(jìn)一步研究。

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