酸奶中乳酸菌計數(shù)方法的探討

陳曉燕

摘 要：目的是通過方法的選擇對乳酸菌計數(shù)方法進行優(yōu)化。方法：采用涂布法和傾注法分別對6種市售的酸奶制品進行檢測，并分別用生理鹽水、PBS緩沖液、CYS緩沖液進行乳酸菌計數(shù)結(jié)果比較。結(jié)果：6種酸奶制品分別用傾注法和涂布法所得的乳酸菌數(shù)結(jié)果從統(tǒng)計學意義上均無差別；6份樣品在三種不同稀釋液的計數(shù)結(jié)果里CYS緩沖液為最優(yōu)稀釋液。結(jié)論：傾注法和涂布法對乳酸菌計數(shù)無影響，若僅對樣品中乳酸菌做計數(shù)要求，則可選擇采用傾注法進行檢測，選擇CYS緩沖液進行乳酸菌計數(shù)明顯優(yōu)于國標方法，可以用于食品中乳酸菌計數(shù)。

關(guān)鍵詞：大豆蛋白酶解產(chǎn)物 生物活性肽 輕度酶解 苦味肽 功能特性

近年來，由于人們生活水平和健康意識的提高，酸奶已成為一種深受廣大消費者喜愛的乳制品之一，但其在生產(chǎn)制作或運輸過程中如儲存不當，會使當中乳酸菌的數(shù)量減少，而酸奶營養(yǎng)價值主要來源于其中乳酸菌的數(shù)量多少，故酸奶中活性乳酸菌的數(shù)量減少直接影響酸奶的質(zhì)量[1]。確計數(shù)活性乳酸菌制品中的乳酸菌，衛(wèi)生部于2010年發(fā)布了修訂版《食品微生物檢驗 乳酸菌檢驗》GB 4789.35-2010[2]，與2008版相比修訂版中修改了乳酸菌總數(shù)、乳桿、雙岐桿菌、嗜熱鏈球菌的計數(shù)方法。但該標準中僅規(guī)定了一種平板涂布法作為檢測樣品中乳酸菌數(shù)量的方法，且要求操作者從樣品稀釋到平板涂布在15分鐘內(nèi)必須完成。筆者以多年從事乳酸菌數(shù)量檢測工作經(jīng)驗認為，對于少量樣品的檢測，按照國標來操作是完全可以實現(xiàn)的，但在實際工作中，往往由于種種原因的限制，對于大樣本大樣本量（n>20），仍采用國際來進行檢測，具有非常大的實際困難。因此，本文從市面上隨機選取6種品牌的酸奶，通過比較平板涂布法與傾注培養(yǎng)法之間的差異，以及不同稀釋液結(jié)果比較，以保證真實反映酸奶中乳酸菌數(shù)量可供進一步修改國標的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 隨機選擇6份不同商品名的含活性乳酸菌含量較高、均勻性較好的酸奶制品。

1.1.2 稀釋液：（1）生理鹽水、（2）PBS緩沖液、（3）CYS緩沖液（L-半胱氨酸磷酸鹽緩沖液：L-半胱氨酸鹽酸鹽0.20g，磷酸氫二鈉2.40g，磷酸二氫鉀1.80g，吐溫800.24g，于400mL純化水中，攪拌使其充分溶解；以NaOH溶液調(diào)pH為6.8～7.0，滅菌條件121℃、15min）。

1.2方法

1.2.1 平板法：將上述樣品根據(jù)待檢樣品活菌數(shù)估計，選擇2～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取0.1mL樣品勻液分別置于2個MRS瓊脂平板，使用L形玻璃棒進行表面均勻涂布，每個稀釋度更換一個L形玻璃棒。同時做空白對照。

1.2.2 傾注法：將上述樣品根據(jù)待檢樣品活菌數(shù)估計，選擇2～3個連續(xù)的適宜稀釋度，每個稀釋度吸取1mL樣品勻液分別置于2個空培養(yǎng)皿中，傾入50℃左右的MRS瓊脂約20mL，輕輕振搖混勻，待凝固后翻轉(zhuǎn)平皿。

1.2.3 統(tǒng)計分析：采用 SPSS11.5統(tǒng)計軟件，用數(shù)據(jù)表示，采用“兩獨立樣本t檢驗”以P<0.05表示統(tǒng)計學差異。

2 結(jié)果：

2.1涂布法和傾注法對乳酸菌計數(shù)結(jié)果的影響

樣品稀釋過程按照GB 4789.35-2010食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗操作，分別進行平板涂布和常規(guī)傾注進行培養(yǎng)。分別采用涂布法和傾注法，以稀釋時間為立即，對六份樣品中乳酸菌總數(shù)檢測結(jié)果見表1。

6份樣品分別用傾注法和涂布法所得的乳酸菌數(shù)結(jié)果從統(tǒng)計學意義上均無差別。

2.2 三種稀釋液中乳酸菌計數(shù)結(jié)果比較

6份樣品經(jīng)不同稀釋液稀釋后分別采用涂布法對乳酸菌測定的結(jié)果見表2。

3. 討論：

本實驗采用成組設(shè)計的兩樣本均數(shù)檢驗（Independent Sample t Test）分析方法，對6種市售酸奶制品分別采用涂布法和傾注法來計數(shù)酸奶中乳酸菌菌落數(shù)，結(jié)果表明，該兩種方法測得的結(jié)果之間的差異無統(tǒng)計學意義。根據(jù)研究結(jié)果顯示，涂布法和傾注法對乳酸菌計數(shù)無影響是一致的。涂布法培養(yǎng)后乳酸菌生長在瓊脂表面，便于挑取菌種做驗證試驗和保存菌種等，但缺點是其樣品稀釋液用L形棒涂布必須均勻否則乳酸菌生長不均對結(jié)果造成影響[4]傾注法為常規(guī)檢測方法即樣品加樣后再傾注培養(yǎng)基混勻進行培養(yǎng)，技術(shù)操作簡便，樣品混勻后能均勻生長，然而培養(yǎng)后菌落大多生長在瓊脂內(nèi)部，如需鑒定試驗時會帶來一定的困難。另外，通過優(yōu)化方法不同稀釋液中結(jié)果比較，6份樣品在CYS緩沖液中結(jié)果較高。由于生理鹽水沒有緩沖能力，會導(dǎo)致某些樣品不能夠溶解和分散充分，影響最終的計數(shù)結(jié)果。PBS和CYS中磷酸鹽可提供緩沖能力，而CYS中L半胱氨酸能夠為乳酸菌的生長提供還原性的環(huán)境，吐溫80能夠使菌體分散更充分，為乳酸菌生長提供有利環(huán)境。

綜上所述，若在一批檢測樣本數(shù)量較多的情況下，僅要求對乳酸菌進行計數(shù)的條件下，筆者建議可采用傾注法培養(yǎng)。因為實驗表明傾注法與國標推薦的涂布法對乳酸菌計數(shù)結(jié)果無統(tǒng)計學差異，且傾注法在操作技術(shù)上優(yōu)于涂布法，可大大縮短操作時間，提高實驗結(jié)果的準確性。另外將CYS作為稀釋液更適用于益生菌食品中乳酸菌檢驗，建議在國標修訂時可考慮更換稀釋液。

參考文獻：

[1]周凌華，王豪，王蔭榆，等. 功能性益生乳酸菌的研究進展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012（7）： 990-995.

[2]GB 4789.35-2010 食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗[S].北京：中國標準出版社，2010.

[3]朱寶玉，張秀麗，廖興，等. 活性乳酸菌制品中乳酸菌計數(shù)條件的優(yōu)化研究 [J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2004，14（5）：561-563.

[4]俞漪，曲勤鳳，胡雪蓮.食品中乳酸菌含量傾注法與涂布法結(jié)果差異性研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工·學刊2012.8（8）：137-139

[5]王彬，馬永娟，張少紅.培養(yǎng)方式對乳酸菌檢出率的影響[J].職業(yè)與健康2008.2（3）：225-226.