益氣化瘀法對(duì)大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面組織中VEGF表達(dá)的影響

秦曉靜 丁博文 劉學(xué) 蔡亮亮

摘要：目的 觀察益氣化瘀法對(duì)大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合過(guò)程中VEGF表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討益氣化瘀法促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用機(jī)制。方法 將 30只SD大鼠完全隨機(jī)分為模型組（10只）、對(duì)照組（10只）、治療組（10）只，于術(shù)后第7 d，取創(chuàng)面全層組織，通過(guò)免疫組化檢測(cè)創(chuàng)面組織中 VEGF含量表達(dá)水平和血管數(shù)，并觀察創(chuàng)面愈合時(shí)間。結(jié)果 治療組大鼠創(chuàng)面組織中 VEGF含量表達(dá)水平顯著增加，與對(duì)照組、模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.001）。治療組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯優(yōu)于模型組和對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 益氣化瘀法明顯促進(jìn)實(shí)驗(yàn)大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的愈合，通過(guò)上調(diào)VEGF表達(dá)，促進(jìn)血管的新生，加速創(chuàng)面的愈合。

關(guān)鍵詞：血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；益氣化瘀；創(chuàng)面修復(fù)；肛周膿腫

中圖分類號(hào)：R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2016）06-0068-03

【Abstract】Objective： To observe the effect of Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method on VEGF expression in postoperative wound tissue of rat perianal abscess and further explore its mechanism to promote wound healing. Methods： 30 SD rats were randomly divided into a model group（10）and a control group（10）and a treatment group（10）. In the seventh day after surgery，the wound full tissue of the rats was taken and VEGF content expression and number of blood vessels in the wound tissue were detected by immunohistochemistry and wound healing time was observed. Results： VEGF expression level in the wound tissue of the treatment group significantly increased. Compared with the control group and the model group，the difference was statistically significant （P<0.001）. The healing time of the treatment group was quicker than that of the model group and the control group，and the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion： Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method significantly promotes the postoperative wound healing of the rat perianal abscess and also promotes the rebirth of vascular and accelerates wound healing by upregulating the expression of VEGF.

【Key words】vascular endothelial growth factor，Tonifying Qi to Dispering Blood Stasis Method，wound healing，perianal abscess

肛周膿腫是肛腸科常見(jiàn)疾病，手術(shù)為主要治療手段[1～2]，但術(shù)后由于特殊的解剖結(jié)構(gòu)，加之糞便污染、炎癥刺激等因素，創(chuàng)面的修復(fù)一直是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。中醫(yī)益氣化瘀法對(duì)慢性難愈性創(chuàng)面的修復(fù)有著較好的臨床療效。本研究旨在觀察根據(jù)益氣化瘀法自制生肌扶正油紗對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肛周膿腫術(shù)后感染創(chuàng)面的促愈作用，并通過(guò)觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular factor，VEGF）在大鼠肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面愈合過(guò)程中的表達(dá)變化，進(jìn)一步探討與闡明益氣化瘀法在創(chuàng)面愈合過(guò)程中的作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑 石蠟（上海國(guó)藥集團(tuán)69018961）、甲醛（上海國(guó)藥集團(tuán)10010018）、二甲苯（上海國(guó)藥集團(tuán)10023418）、無(wú)水乙醇（上海國(guó)藥集團(tuán)10092680）、30%H2O2（上海國(guó)藥集團(tuán)10011218）、快捷型酶標(biāo)羊抗鼠/兔IgG聚合物（福州邁新生物技術(shù)有限公司KIT-5020）、DAB濃縮型試劑盒（北京索萊寶生物科技有限公司DA1010）、蘇木素（BASO714094）、中性樹(shù)脂（上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司G8590）、10%水合氯醛。

1.1.2 主要儀器及耗材 正置顯微鏡（OLYMPUS公司 CX41）、移液器（吉爾森P型移液器公司P2、P10、P20、P100、P200、P1000）、恒溫烘箱（上海恒一科學(xué)儀器有限公司DHG-9023A）、石蠟切片機(jī)（徠克公司SQ2125）、攤片機(jī)（徠克公司PPTHK-21B）、IMS圖象分析系統(tǒng)（上海哈靈生物科技有限公司）、數(shù)碼相機(jī)（NIKON公司D5100）。

1.1.3 藥物組成及制備 扶正生肌油紗條的制作方法：處方：黃芪500 g，黨參500 g，當(dāng)歸500 g，乳香500 g，沒(méi)藥500 g，玄胡索300 g，黃柏300 g，珍珠300 g，冰片80 g；制法：以上九味分別粉碎成細(xì)粉，過(guò)篩，加食用植物油6000 g，浸漬5～7天，炸枯，去渣，濾過(guò)，煉至滴水成珠；將無(wú)菌紗布剪成2cm×3cm大小的紗條置于鋁制容器內(nèi)；將煉好的藥液與適量的凡士林加熱混勻后倒入上述容器內(nèi)；然后進(jìn)行高溫高壓消毒后即可使用。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 動(dòng)物來(lái)源清潔級(jí)SD（sprague-dawly）大鼠，雄性，體重250 g，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（批號(hào)：醫(yī)動(dòng)字第02-22-2號(hào)）。

1.2.2 動(dòng)物模型 參照付小兵[3]及鄭雪平等[4]制造污染創(chuàng)面愈合的動(dòng)物模型方法，加以改進(jìn)后，擬造肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的動(dòng)物模型。大鼠背部手術(shù)區(qū)域備皮，以10%水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射麻醉，碘伏常規(guī)消毒，剪去直徑2.0 cm大小皮膚，破壞皮膚全層及皮下淺筋膜直至肌層，止血后在創(chuàng)面上滴加大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC25922，由南京便診生物科技有限公司提供）0.1mL（1麥?zhǔn)蠁挝唬?。七?hào)絲線縫合創(chuàng)面，48 h后拆除縫線，見(jiàn)傷口有膿性分泌物者為造模成功，即造成類似于臨床肛周膿腫術(shù)后的創(chuàng)面。以后每次治療前30 min在創(chuàng)面上滴加大腸埃希菌0.1 mL。

1.2.3 隨機(jī)分組 將造模后的30只大鼠，隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組和治療組，每組各10只。

1.2.4 治療方法 于術(shù)后第l天開(kāi)始治療，每天1次。治療組：大鼠創(chuàng)面清潔消毒后，扶正生肌油紗覆蓋創(chuàng)面；對(duì)照組：大鼠創(chuàng)面清潔消毒后，凡士林油紗覆蓋創(chuàng)面；模型組：大鼠創(chuàng)面清潔消毒后不作任何其他處理。

1.2.5 標(biāo)本采集 大鼠造模成功，采用不同方法的治療后，于術(shù)后第7天時(shí)，腹腔注射麻醉后，于創(chuàng)面中心取約0.5 cm的肉芽組織，10%甲醛溶液固定標(biāo)本。

1.2.6 檢測(cè)指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.2.6.1 創(chuàng)面愈合時(shí)間 觀察30只大鼠從創(chuàng)面用藥起到創(chuàng)面完全上皮化所需時(shí)間。

1.2.6.2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)VEGF表達(dá) 將采集固定好的標(biāo)本，于甲醛溶液中固定24h后脫水，石蠟包埋，切片。然后進(jìn)行烤片和脫蠟、水化、抗原修復(fù)、阻斷系列處理；一抗孵育：滴加一抗（選擇最佳稀釋比例），濕盒孵育，室溫下放置1 h（或者4℃孵育過(guò)夜）。0.02M PBS沖洗3 min×3次。二抗孵育：滴加HRP標(biāo)記廣譜二抗，濕盒孵育，室溫下放置20 min～30 min。0.02M PBS沖洗3 min×3次。顯色：DAB染色，觀察到切片有顏色改變時(shí)，立即用自來(lái)水洗去染色液。蘇木素染色：蘇木素復(fù)染3 min，1%鹽酸酒精分化，顯微鏡下觀察，控制染色程度。自來(lái)水沖洗10 min，放入65℃烘箱中烘干水分。透明和封片：將玻片置于二甲苯中透明3 min×2次，中性樹(shù)膠封片，放入65℃烘箱中15 min。通過(guò)顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位，計(jì)算陽(yáng)性面積。

1.2.6.3 圖像分析法分析微血管數(shù) 每張石蠟切片，隨機(jī)選取肉芽數(shù)組織區(qū)域的2個(gè)視野，計(jì)數(shù)每個(gè)視野的新生微血管（有完整管腔）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，所有的結(jié)果均以（x±s）表示組間比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面愈合時(shí)間 見(jiàn)表1。

3 討論

肛周膿腫術(shù)后創(chuàng)面的愈合一直是肛腸科醫(yī)生致力解決的關(guān)鍵問(wèn)題。術(shù)后換藥技術(shù)與局部創(chuàng)面的愈合時(shí)間及肛門(mén)功能恢復(fù)程度密切相關(guān)，決定著其最終治愈的效果。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人是一整體，局部潰瘍愈合，關(guān)系全身氣血的運(yùn)行?！夺t(yī)林改錯(cuò)》曰：“元?dú)饧忍?，必不能達(dá)于血管，血管無(wú)氣，必停留而瘀”氣為血帥，正氣虛損則無(wú)力推動(dòng)血行，血行不暢，瘀血內(nèi)生，瘀血不去，新血不生，正氣無(wú)由恢復(fù)，則正氣耗損亦劇。兩者互為因果，形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致創(chuàng)面難愈。故以益氣化瘀之法，使得正氣充沛，瘀血化除，氣行則血行，經(jīng)脈流暢，創(chuàng)面生長(zhǎng)迅速。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，益氣化瘀之法能有效促進(jìn)創(chuàng)面愈合。益氣類中藥能夠影響創(chuàng)面的肉芽生長(zhǎng)狀態(tài)及創(chuàng)面微血管的密度，改善二者的關(guān)系，促進(jìn)創(chuàng)而的愈合，從而印證了“補(bǔ)虛生肌”、“化瘀生肌”的學(xué)術(shù)理論[5]。張平等研究發(fā)現(xiàn)活血化瘀、去腐生肌中藥能在創(chuàng)面愈合的炎癥和肉芽組織形成期促進(jìn)bFGF和Hyp的生成，而在重組期減少其生成。這樣既能加速創(chuàng)面愈合，又能減少疤痕產(chǎn)生[6]。

創(chuàng)面愈合是一個(gè)動(dòng)態(tài)的、復(fù)雜的過(guò)程，受多種因素的影響。一旦表皮和真皮的保護(hù)屏障被打破，傷口愈合的生理過(guò)程就立即進(jìn)行。創(chuàng)面愈合涉及不同的凝血、炎癥、增生和組織重塑的重疊階段。肉芽組織形成是創(chuàng)面修復(fù)愈合的關(guān)鍵步驟之一，而肉芽組織的本質(zhì)是大量的毛細(xì)血管和豐富的成纖維細(xì)胞。豐富的新生毛細(xì)血管數(shù)量和形態(tài)，能充實(shí)肉芽組織且改善創(chuàng)面微循環(huán)，為組織修復(fù)提供所必須的氧及豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而有利于創(chuàng)面愈合。在創(chuàng)傷愈合中血管的形成是至關(guān)重要的一步，血管形成傷口愈合和組織再生的重要環(huán)節(jié)，VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂原，是血管形成的關(guān)鍵調(diào)控因素之一[7]，它能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，具有維持血管正常形態(tài)和完整性、提高血管通透性、促進(jìn)血管生成等作用[8]，在創(chuàng)面愈合過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

本科在益氣化瘀法的指導(dǎo)下，自制了生肌扶正油紗，在長(zhǎng)期的臨床實(shí)踐中印證了該油紗在肛周膿腫術(shù)后換藥中，能明顯促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，但缺乏有效的科學(xué)實(shí)驗(yàn)來(lái)闡明其作用機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)大鼠模擬肛周膿腫術(shù)后感染創(chuàng)面，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯縮短，觀測(cè)VEGF在創(chuàng)面肉芽組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示扶正生肌油紗組陽(yáng)性面積表達(dá)顯著升高，血管數(shù)亦高于對(duì)照組和模型組，因此反應(yīng)了益氣化瘀中藥能通過(guò)上調(diào)創(chuàng)面組織VEGF表達(dá)量，誘導(dǎo)血管新生，在一定程度上改善創(chuàng)面組織的缺血、缺氧狀態(tài)，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。

本研究為臨床上應(yīng)用益氣化瘀法中藥治療感染性難愈性創(chuàng)面提供了科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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（收稿日期：2016-03-28）