基于SYBR Green檢測小麥黃花葉病毒的兩步法qPCR

劉成 鈴木孝子 佐久間俊 宋健民 李豪圣 劉愛峰 曹新有 韓冉

摘要：小麥黃花葉病毒病是其常發(fā)病，常造成嚴(yán)重減產(chǎn)。為建立可用于定量檢測小麥黃花葉病毒（WYMV）拷貝數(shù)的qPCR方法，本研究對不同來源的WYMV小種序列進(jìn)行比對分析，在序列保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物11對，對其退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而建立各引物的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，11對引物的擴(kuò)增效率在50.60%～116.04%之間，僅2對引物可用于后續(xù)研究，擴(kuò)增效率分別為97.21%（WY-05和WY-06）和91.85%（WY-F2和WY-R2）。利用其中的WY-F2和WY-R2對高抗和高感WYMV的小麥品種進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，抗感小麥品種WYMV拷貝數(shù)差異極顯著。對抗感分離群體266個(gè)單株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)該qPCR方法靈敏度顯著高于酶聯(lián)免疫吸附劑測定法，更適用于抗感雜交分離群體的表型鑒定，因而可以用于抗WYMV基因的遺傳定位與圖位克隆工作。

關(guān)鍵詞：小麥黃花葉病毒；兩步法qPCR；酶聯(lián)免疫吸附劑測定法

中圖分類號：S435.121.4+9文獻(xiàn)標(biāo)識號：A文章編號：1001-4942（2016）07-0118-07

小麥黃花葉病毒（Wheat yellow mosaic virus，WYMV）是一種由禾谷多黏菌（Polymyxa graminis）介導(dǎo)才能侵染寄主的土傳病原微生物，最早在日本發(fā)現(xiàn)[1]，后在中國和加拿大等國發(fā)現(xiàn)[2，3]。感病小麥表現(xiàn)為根系發(fā)育差、植株松散[2]、葉片發(fā)黃、生長發(fā)育遲緩甚至矮化[2，4]，分蘗力、成穗率和產(chǎn)量降低[2，5]，對小麥品質(zhì)也有不利影響[6]。我國小麥黃花葉病毒病分布范圍廣，包括北部冬麥區(qū)的膠東沿海副區(qū)、黃淮冬麥區(qū)大部、長江中下游麥區(qū)和西南麥區(qū)部分地區(qū)等[7]，該病害受寄主感病程度、病毒毒力以及氣候因子特別是溫度影響較大[5]。近10年來，我國小麥黃花葉病毒病呈逐年加重之勢[2]，僅2006年，就有9個(gè)省爆發(fā)該病，受災(zāi)面積達(dá)到200萬公頃，造成小麥減產(chǎn)15億千克[8]。

WYMV及其載體在土壤中的潛伏期很長。研究顯示，有WYMV發(fā)病土地，即使10年不種植小麥，10年后仍然對小麥具有較強(qiáng)的致病毒力[9]。所以，一旦某一麥區(qū)暴發(fā)該病將很難根除，對小麥生產(chǎn)威脅較大。因此，研究清楚抗小麥黃花葉病毒病品種的抗病機(jī)制對小麥分子育種具有重要意義，定位并圖位克隆抗WYMV基因進(jìn)而進(jìn)行基因功能驗(yàn)證是研究抗WYMV機(jī)制的基礎(chǔ)?；诖耍覀冮_展了抗WYMV基因的精細(xì)定位與圖位克隆工作（待發(fā)表）。而精確鑒定分離群體抗病性則為能否成功精細(xì)定位并圖位克隆到基因的關(guān)鍵，因此，材料抗病性鑒定方法就成為問題的重要一環(huán)。目前，對WYMV的鑒定方法有形態(tài)學(xué)調(diào)查[10]、蛋白水平檢測[11，12]和分子水平檢測[8，13]等。然而，上述方法均是檢測WYMV的定性分析方法，不能定量獲得植株感染病毒拷貝數(shù)進(jìn)而對植株抗病程度進(jìn)行精確界定。為了解決這一問題，本研究擬通過建立一種基于SYBR Green檢測WYMV的兩步法實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR），并對抗感分離群體進(jìn)行病毒拷貝數(shù)定量分析，確認(rèn)可應(yīng)用于WYMV病毒數(shù)鑒定的方法。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

高抗WYMV的美國小麥品種Madsen由日本國家研究中心提供。日本小麥品種（系）Hokushin（感WYMV）、TK-2（抗WYMV）和Shinchunaga（未鑒定WYMV抗性）由日本北海道中央農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站提供，其中TK-2是Hokushin/Madsen的BC5F4近等基因系。編號為#001～#266的植株為Hokushin/TK-2的F2抗感WYMV分離群體。除Shinchunaga外，其余試驗(yàn)材料全部種植于富含WYMV的日本北海道中央試驗(yàn)農(nóng)場編號為Minami-Mareppu 40的區(qū)域地塊里，當(dāng)年秋季播種，次年4月中旬待植株充分發(fā)病后取樣進(jìn)行病毒數(shù)檢測。所有參試材料均測定來自同一地塊不同位點(diǎn)的三個(gè)不同單株（取旗葉下的第二葉）的病毒拷貝數(shù)，減少因種植過于集中且土壤含病毒不均勻或病毒感染上傳不充分造成的誤差。除此之外，Madsen、Hokushin和Shinchunaga還被種植于日本國立農(nóng)業(yè)生物資源研究所（筑波）不含WYMV的試驗(yàn)農(nóng)場中，作為前述種植于含WYMV地塊中樣品的陰性對照。

DNA酶Ⅰ購自TaKaRa公司，RNA純化及反轉(zhuǎn)錄所用試劑耗材、連接載體均購自Invitrogen公司。 qPCR所需試劑購自日本東洋紡公司，48孔反應(yīng)板及高透光封口膜購自ABI公司。 滅菌DEPC移液槍頭和RNase AWAY分別購自QSP和MBP公司，ELASI試劑盒購自WAKO公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1總RNA提取、檢測與純化取200 mg 鮮葉片放于加入氧化鋯珠的2 mL 離心管中，利用Retsch MM300混合型碾磨儀在25 Hz下震蕩1.5 min；加入Trizol 500 μL，室溫放置5 min；接著加入氯仿100 μL，室溫放置3 min，4℃、10 000×g條件下離心15 min；轉(zhuǎn)移上清液到另一新離心管中，加入異丙醇300 μL輕輕混勻，室溫放置10 min，4℃、10 000×g條件下離心10 min；棄上清，加入預(yù)冷的75%乙醇清洗，4℃、7 000×g條件下離心5 min，重復(fù)兩次；待RNA干燥后加入50 μL DEPC水溶解后保存于-20℃冰箱備用。

RNA的完整性在瓊脂糖凝膠中檢測，完整性較好的RNA濃度檢測在Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計(jì)下進(jìn)行。RNA中DNA污染的去除：50 μL的總反應(yīng)體系包含50 μg總RNA、10 U的DNA酶Ⅰ、20 U的RNA酶抑制劑和DEPC水，輕輕混勻，37℃條件下處理2 h；處理完畢后，加入3 mol/L醋酸鈉（pH=5.2） 5 μL，輕輕混勻后加入異丙醇56 μL，混勻后在4℃、10 000×g條件下離心10 min；棄上清，用預(yù)冷的75%乙醇清洗，4℃、7 000×g條件下離心5 min，重復(fù)兩次；待RNA干燥后加入50 μL DEPC水溶解。

1.2.2高質(zhì)量RNA的選擇與反轉(zhuǎn)錄純化后的RNA再次利用瓊脂糖凝膠檢測其完整性，完整性較好的RNA濃度再次利用Thermo Scientific NanoDrop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行檢測。分光光度計(jì)下A260/A280值在1.9～2.1范圍內(nèi)且A260/A230值在2.0～2.4范圍內(nèi)的用于后續(xù)反轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。

反轉(zhuǎn)錄體系：包含總RNA 1 μg、2.5 mmol/L dNTPs 4 μL、Oligo（dT）12～18引物0.5 μL，DEPC水補(bǔ)至10 μL，65℃條件下處理5 min，迅速置于冰上；隨后，加入5×第一鏈緩合成緩沖液4 μL、0.1 mol/L二硫蘇糖醇（DTT） 1 μL、20 U的RNA酶抑制劑和25 U的SuperScriptTMⅢ 反轉(zhuǎn)錄酶，最后用DEPC水補(bǔ)足到20 μL后輕輕混勻。反應(yīng)條件：25℃反應(yīng)5 min，然后，50℃反應(yīng)3 h，緊接著70℃反應(yīng)15 min。反應(yīng)完成后離心機(jī)瞬時(shí)離心，加入DEPC水80 μL，輕輕混勻使得cDNA終濃度為10 ng/μL，保存于-20℃冰箱備用。

1.2.3序列比對與引物設(shè)計(jì)對NCBI數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中注冊的多條WYMV序列進(jìn)行比對，在序列保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。序列比對在軟件DNAMAN上進(jìn)行，引物設(shè)計(jì)利用在線軟件Primer 3（http：//frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）進(jìn)行。根據(jù)序列比對結(jié)果共設(shè)計(jì)7條引物，包含左引物3條（WY-05、WY-F1和WY-F2），右引物4條（WY-R1、WY-R2、WY-06和WY-16），序列分別如下：WY-05： 5′-ACCAATGCCGCCACCAAAG-3′；WY-F1： 5′-TCGAACACGACAACTCCATC-3′；WY-F2： 5′-CCGTCAACGCAGGACTAAA-3′； WY-R1： 5′-CAGAGCGATGGAGTTGTCG-3′；WY-R2： 5′-TGGTGATGCCAAGACTGGT-3′；WY-06： 5′-GCATGGTCTGGCTTTCTGC-3′；WY-16： 5′-GCCCATTTTGTGACAATCTTGTG-3′。上述左引物和右引物分別組合（表1），用于qPCR最適引物篩選；其中WY-05和WY-16還用于小麥黃花葉病毒序列克隆。用作內(nèi)參的Actin基因特異引物DN182500F425和DN182500R533的序列參照文獻(xiàn)[14]，所有WYMV拷貝數(shù)均用相應(yīng)Actin拷貝數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2.4qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線建立將克隆的WYMV序列與內(nèi)參Actin基因序列分別連接到pCR4-TOPO載體上，分別用引物WY-05和WY-16、DN182500F425和DN182500R533進(jìn)行陽性克隆的篩選。陽性克隆在含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，提取質(zhì)粒。利用上述序列克隆引物對獲得質(zhì)粒進(jìn)行測序，確認(rèn)連接序列的正確性。將含WYMV序列與內(nèi)參Actin基因序列的質(zhì)粒DNA從107拷貝等比稀釋到10個(gè)拷貝（共7個(gè)濃度梯度），用于計(jì)算每對引物的擴(kuò)增效率及后續(xù)絕對定量分析。樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)及2個(gè)技術(shù)重復(fù)，平均log拷貝數(shù)及對應(yīng)Ct值用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。

1.2.5qPCR反應(yīng)與酶聯(lián)免疫吸附劑測定qPCR總體積為20 μL，包括TBSYBR混合液10 μL，3 mmol/L左右引物各2 μL，10 ng/μL cDNA 2 μL，參考染料0.4 μL，滅菌雙蒸水3.6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 1 min；主反應(yīng)為35個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，60～65℃ 45 s（依據(jù)引物反應(yīng)的優(yōu)化溫度）；最后熔解曲線建立為1個(gè)循環(huán)，95℃ 15 s，55～65℃ 45 s（依據(jù)引物），95℃ 15 s。酶聯(lián)免疫吸附劑測定法（ELISA）參照文獻(xiàn)[11]。

1.2.6小麥黃花葉病毒數(shù)絕對量計(jì)算按照如下步驟計(jì)算：（1）質(zhì)粒DNA的長度為空質(zhì)粒3 956 bp（未連接小麥黃花葉病毒序列）+本研究所用小麥黃花葉病毒序列長度440 bp=4 396 bp；（2）質(zhì)粒DNA分子量=質(zhì)粒DNA長度（bp）×堿基平均分子量330道爾頓（D）×2（堿基/bp）=2 901 360 D（D=g/mol）；（3）1個(gè)拷貝的DNA重量=質(zhì)粒DNA分子量（g/mol）÷（6.023×1023分子/mol）（阿佛加德羅常數(shù)）=481 713×10-23g/分子≈4.82×10-18 g/分子；（4）1 ng RNA中含病毒拷貝數(shù)=1 ng÷1個(gè)拷貝DNA重量（g/分子）=2.07×108分子（拷貝）/ng RNA。利用log（拷貝數(shù)/ng RNA）數(shù)值與ELISA數(shù)值進(jìn)行方法學(xué)比較分析。

2結(jié)果與分析

2.1qPCR引物的選擇及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

設(shè)計(jì)的qPCR引物在克隆的440 bp WYMV序列上的位置如圖1所示。左引物和右引物分別組合，獲得11個(gè)引物對（表1），用于qPCR最適引物的選擇。各引物對進(jìn)行最適退火溫度優(yōu)化，最適溫度的確定用擴(kuò)增產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果判定，其中引物對WY-F2和WY-R2、WY-05和WY-06在60℃、63℃和65℃條件下的產(chǎn)物熔解曲線如圖2所示。兩對引物在60℃和63℃條件下產(chǎn)物不單一或出現(xiàn)雙峰（圖2A、B、D和E），而65℃條件下兩引物對產(chǎn)物熔解曲線峰值單一（圖2 C和F），因此，該兩對引物的最適退火溫度均為65℃。各引物對的擴(kuò)增片段長度、PCR效率和退火溫度等信息如表1所示。

利用合成的11對引物在其最適退火溫度下分別建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過對qPCR決定系數(shù)和引物PCR效率等指標(biāo)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所有引物對的qPCR決定系數(shù)均在0.99以上（表1），但僅引物對WY-05和WY-06、WY-F2和WY-R2的擴(kuò)增效率（97.21%和91.85%）在可接受范圍90%～110%之內(nèi)，可用于后續(xù)qPCR試驗(yàn)。二者對應(yīng)計(jì)算公式分別為y=-3.3782x+41.081和y=-3.3933x+38.580，其中，y為Ct值，而x為log拷貝數(shù)。利用內(nèi)參基因特異引物DN182500F425和DN182500R533建立標(biāo)準(zhǔn)曲線（引物間序列長度為130 bp），獲得計(jì)算公式為y=-3.2379x+40.159。

2.2原始親本的qPCR檢測

對種植于含WYMV地塊的Madsen和Hokushin，種植于未感染W(wǎng)YMV地塊的Madsen、Hokushin和Shinchunaga的葉片、莖稈、根和麥穗分別提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。用擴(kuò)增片段較短的WY-F2和WY-R2（相對于引物對WY05和WY06）對上述樣品以及絕對陰性對照ddH2O進(jìn)行qPCR分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，種植于含WYMV地塊的Hokushin含病毒數(shù)高達(dá)幾十萬個(gè)拷貝/ng RNA（log拷貝數(shù)值在5～6之間，圖3），而種植于不含WYMV地塊的Madsen、Hokushin和Shinchunaga各器官以及ddH2O含病毒數(shù)均為10個(gè)左右（log拷貝數(shù)值約為1，圖3，Madsen和Hokushin結(jié)果未列出），因此，種植于不含WYMV的植株以及種植于含WYMV地塊Madsen中的病毒數(shù)是由于試驗(yàn)背景造成的。種植于含WYMV地塊的Madsen和Hokushin病毒數(shù)量差異極顯著，種植于不含WYMV地塊的植株病毒數(shù)一致極低，說明以WY-F2和WY-R2為引物進(jìn)行的兩步法qPCR結(jié)果是準(zhǔn)確可信的。

2.3抗感分離群體的qPCR和ELISA檢測

利用WY-F2和WY-R2對Hokushin/TK-2的F2抗感WYMV分離群體共266個(gè)單株進(jìn)行qPCR分析，結(jié)果顯示，log（拷貝數(shù)/ng RNA）值在0～1（區(qū)間最大值的植株數(shù)包含在下一區(qū)間，下同）區(qū)間的有29株；在1～2區(qū)間的植株數(shù)最多，為186株；在2～3區(qū)間的有8株；在3～4區(qū)間的有15株；在4～5區(qū)間的有28株（圖4A）。原始雜交親本Madsen和Hokushin的log（拷貝數(shù)/ng RNA）值分別在0～1和5～6區(qū)間，即Hokushin/TK-2的F2單株的log（拷貝數(shù)/ng RNA）值均在兩原始親本log（拷貝數(shù)/ng RNA）范圍內(nèi)。

利用ELISA對該群體進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA值在0～0.5的植株最多，為220株；在0.5～1.0區(qū)間的僅有1株；在1.0～1.5區(qū)間的有3株；在1.5～2.0區(qū)間的僅有1株；未檢測到ELISA值在2.0～2.5區(qū)間的植株；ELISA值在2.5～3.0區(qū)間的有4株；在3.0～3.5區(qū)間的有37株（圖4B）。原始雜交親本Madsen和Hokushin的ELISA值分別在0～0.5和3.0～3.5之間，因此，Hokushin/TK-2的F2單株的ELISA值也均在兩原始親本ELISA值范圍內(nèi)。

為了清晰地比較兩種方法，筆者對266個(gè)單株中編號為#228～#266植株以及原始雜交親本Madsen和Hokushin的log（拷貝數(shù)/ng RNA）值和ELISA值進(jìn)行散點(diǎn)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA可以把供試植株分為ELISA值小于1（本研究中定義為抗?。┖痛笥?.5（感病）兩類；qPCR也可以把供試植株分為log（拷貝數(shù)/ng RNA）值小于2.5（抗?。┖痛笥?.5（感?。﹥深悾▓D5A）。兩種方法均能把供試材料分成抗病和感病兩類，但是，編號為#243、#262和#266植株的ELISA值均低于1（圖5B），被認(rèn)定為抗WYMV，但是三者的log（拷貝數(shù)/ng RNA）值卻高于3.5（圖5A、C），屬于感病類型，這表明本研究建立的兩步法qPCR較ELISA靈敏度高。

3討論與結(jié)論

迄今，檢測或鑒定WYMV的方法有肉眼鑒定法[10]、酶聯(lián)免疫吸附劑測定法[11]、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法[8]、蛋白免疫印跡法[12]和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[13]，但是，這些方法僅能獲得植株是否感染W(wǎng)YMV信息，不能對植株感染病毒拷貝數(shù)進(jìn)行精確鑒定。qPCR因?yàn)榫哂胁僮骱唵?、檢測方便和可以定量分析等優(yōu)勢，已經(jīng)在植物研究中得到廣泛應(yīng)用[15]。Liu等[16]建立了依據(jù)TaqMan檢測小麥WYMV的一步法RT-qPCR，該方法對鑒定小麥WYMV拷貝數(shù)非常有效，然而，其價(jià)格相對于SYBR Green qPCR成本高3～5倍，且一步法RT-qPCR是將反轉(zhuǎn)錄和qPCR一次性完成，一旦試驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)問題，將無法返回檢測。完成小麥抗病基因的圖位克隆往往需要篩選幾千甚至是上萬個(gè)單株才能實(shí)現(xiàn)獲得所需重組體[17，18]，因此，成本問題往往是需要考慮在內(nèi)的。本研究建立的基于SYBR Green的兩步法qPCR能夠彌補(bǔ)上述一步法的不足之處，對大群體或較多樣本W(wǎng)YMV拷貝數(shù)鑒定可以優(yōu)先選用。

因?yàn)閃YMV需通過真菌感染小麥根部，進(jìn)而向上進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)制，最終在小麥葉片上表現(xiàn)出來[19]，兩步法qPCR在種植于無WYMV土壤中的Houkushin 的根部、莖稈、葉片、麥穗和絕對陰性對照ddH2O中均檢測到10個(gè)拷貝的WYMV，說明這10個(gè)拷貝是試驗(yàn)背景造成的，該背景的無法消除性說明該方法在材料絕對拷貝數(shù)的檢測進(jìn)而研究抗WYMV機(jī)理方面可能具有一定局限性。然而，10個(gè)拷貝的背景相對于感病植株幾十萬個(gè)WYMV拷貝差異極其顯著，因而，完全可以應(yīng)用于抗感分離群體的表型鑒定。

qPCR能夠檢測到ELISA無法檢測到的感病植株，表明前者在對植株表型鑒定上具有明顯優(yōu)勢。之前，Takeuchi等利用ELISA對Hokushin/Madsen重組自交系進(jìn)行研究，認(rèn)為來自Madsen的WYMV抗性可能受1個(gè)單顯性核基因控制[11]。近期，該課題組對這一結(jié)論進(jìn)行了修正，認(rèn)為來自Madsen的WYMV抗性受來自2DL和3BS染色體上的兩個(gè)主效QTL控制[20]。本研究利用qPCR對Hokushin/TK-2的F2 266個(gè)分離群體單株進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這些F2單株的log（拷貝數(shù)/ng RNA）值不是完全正態(tài)分布的，而是分布于0～5的每個(gè)區(qū)間，說明該群體的WYMV抗性是一個(gè)數(shù)量性狀，而不是由單個(gè)基因控制的，與文獻(xiàn)[20]的研究結(jié)果相互印證。雖然文獻(xiàn)[20]依據(jù)ELISA對小麥表型鑒定的研究結(jié)論與本研究兩步法qPCR結(jié)果類似，但是依據(jù)本研究中兩種方法的比較結(jié)果，在條件允許的情況下，應(yīng)優(yōu)先推薦使用兩步法qPCR。該方法不僅可以應(yīng)用于遺傳群體的抗WYMV表型鑒定，還有望被應(yīng)用于抗WYMV小麥品種或種質(zhì)的鑒定工作。

致謝：感謝日本國立農(nóng)業(yè)生物資源研究所李超博士后、默罕默德博士后、王寧博士后和寧順宗博士的有益討論及小山晴美女士的技術(shù)支持。

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