等溫擴增熒光技術(shù)快速檢測金黃色葡萄球菌方法的建立

王耕 張薇 陳安東 王振超

等溫?zé)晒鈹U增技術(shù)--Isothermal Amplification Fluorescent Method（IAFT）是核酸體外擴增和熒光法技術(shù)的結(jié)合，在恒溫條件下進行，通過添加特殊的DNA聚合酶和特異性引物，在擴增的同時加入熒光基團，通過熒光信號累積實時監(jiān)控擴增過程，實現(xiàn)核酸快速擴增和檢測，并對產(chǎn)物做溶解曲線分析。本研究針對金黃色葡萄球菌特異性的femA基因片段設(shè)計并篩選出了IAFT法的特異性引物，驗證特異性和靈敏度，并與傳統(tǒng)檢測方法做對比，結(jié)果符合率為100%。

實驗儀器及材料

材料：金黃色葡萄球菌菌液，藤黃八疊球菌菌液，大腸桿菌菌液，引物（5條），IMM（optigene Limited公司），細菌基因組核酸提取試劑盒（STP），儀器：Optigene limited Genie Ⅲ。

實驗步驟

（1）引物稀釋：將引物稀釋成下表濃度：FIP（上游內(nèi)引物）40pmol/uL，BIP（下游內(nèi)引物）40pmol/uL，F(xiàn)3（上游外引物）5pmol/uL，B3（下游外引物）5pmol/uL，LF（上游環(huán)引物）20pmol/uL；

（2）實驗體系：IMM15ul；引物 FIP、BIP、F3、 B3，LF 各1ul，樣品5ul；

（3）反應(yīng)程序設(shè)定，65℃反應(yīng)40min，溶解曲線 98-80℃。0.05℃為一個循環(huán)；

（4）樣本制備：分別使用提取試劑盒和加煮沸法制備核酸同時檢測，比對實驗結(jié)果。試劑盒提取時參照試劑盒說明書，煮沸法取菌液1ml，95℃加熱10分鐘，離心取上清。

實驗結(jié)果：

圖1 實驗結(jié)果顯示，只有金黃色葡萄球菌對應(yīng)的1、2孔有陽性擴增，其他菌株和陰性對照均未出現(xiàn)擴增，結(jié)果特異。其中使用試劑盒提取的樣本起峰時間較早，煮沸法的樣本出峰時間較晚。

圖2 特異性溶解曲線分析，針對產(chǎn)物做溫度退火同時檢測熒光值，相同樣本峰值重合。

綜上所述，本研究通過金黃色葡萄球菌的基因分析和比對，設(shè)計和篩選特異性引物，優(yōu)化樣品前處理，確立實驗程序和規(guī)范，完成特異性實驗，常規(guī)方法比較，驗證和建立了金黃色葡萄球菌的快速檢測技術(shù)。

討論

本研究使用等溫擴增熒光法 （IAFT）為基礎(chǔ)建立了金黃色葡萄球菌的檢測體系，與傳統(tǒng)方法進行對比，其結(jié)果符合率達到100%。根據(jù)上述實驗結(jié)果，樣本僅需一步增菌即可上機進行檢測，除了可以使用試劑盒提取純度較高的核酸樣本進行擴增和檢測外，煮沸法抽提同樣適用，且準(zhǔn)確率與傳統(tǒng)方法一致。

結(jié)論

（1）集成核酸等溫擴增核心技術(shù)，以等溫擴增熒光快速檢測技術(shù)為基礎(chǔ)建立了金黃色IAFT法快速檢測技術(shù)體系。

（2）分析金黃色葡萄球菌及同源性較高的其他細菌的特異性核酸序列，經(jīng)序列比對找到靶基因進行引物設(shè)計和篩選，保證所選引物對金黃色葡萄球菌核酸序列的擴增高度特異

（3） 經(jīng)與傳統(tǒng)方法以及PCR法進行比價和評價，其準(zhǔn)確率與傳統(tǒng)培養(yǎng)法完全一致，且更為特異、敏感、精確、快速和便捷，適合于任何條件下的現(xiàn)場快速檢測，可對由金黃色葡萄球菌和其他常見的致病微生物進行快速鑒定和診斷，可作為微生物檢測的快速鑒定技術(shù)，推廣和應(yīng)用前景廣闊。

（作者單位：北京晟泰勃科技有限公司 ）