實(shí)時熒光定量RT—PCR內(nèi)參基因的選擇

白金萍 劉芳 李麗

【摘 要】 實(shí)時熒光定量RT-PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光化學(xué)基團(tuán)，并通過實(shí)時熒光定量PCR儀，進(jìn)行實(shí)時、自動檢測整個PCR擴(kuò)增過程中的熒光信號，從而對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行實(shí)時定量分析的方法。它具有高靈敏、高通量、定量準(zhǔn)確、可重復(fù)、污染少等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因診斷，病毒篩選，細(xì)胞和組織中RNA的定量等。在采用RT-PCR進(jìn)行研究的過程中，我們通常需要加入內(nèi)參基因作為參考，內(nèi)參基因又稱為管家基因，它主要是用來平衡樣本之間濃度和純度的差異，減少實(shí)驗(yàn)誤差，使得實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，所以內(nèi)參基因的選擇尤為重要。

【關(guān)鍵詞】 實(shí)時 熒光定量RT-PCR 內(nèi)參基因

1 理想內(nèi)參基因的選擇

理想的內(nèi)參基因應(yīng)該滿足以下條件：①不存在假基因（pseudogene）， 以避免基因組 DNA的擴(kuò)增；②高度或中度表達(dá)， 排除太高或低表達(dá)；③穩(wěn)定表達(dá)于不同類型的細(xì)胞和組織（如正常細(xì)胞和癌細(xì)胞）， 而且其表達(dá)量是近似的，無顯著性差別；④表達(dá)水平與細(xì)胞周期以及細(xì)胞是否活化無關(guān)；⑤其穩(wěn)定的表達(dá)水平與目標(biāo)基因相似；⑥不受任何內(nèi)源性或外源性因素的影響， 如不受任何實(shí)驗(yàn)處理措施的影響。排除內(nèi)參基因的條件則為：①在正常和異常的細(xì)胞/組織中的表達(dá)存在差異；②呈現(xiàn)細(xì)胞周期依賴的表達(dá)；③定位于 X染色體[1]。

2 內(nèi)參基因選擇存在的誤區(qū)

我們做RT-PCR實(shí)驗(yàn)時通常存在兩個誤區(qū)，①選擇常用的內(nèi)參基因，沒有經(jīng)過實(shí)驗(yàn)進(jìn)行篩選，如β-actin、18SrRNA、B2M等是我們常選擇的內(nèi)參基因，但有研究表明β-actin 當(dāng)細(xì)胞向惡性轉(zhuǎn)化時，表達(dá)量會增加；B2M在軟骨細(xì)胞、吞噬細(xì)胞中均能夠穩(wěn)定表達(dá)，但在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)較差[2，3]。②只選擇一個內(nèi)參基因校正數(shù)據(jù)，而目前沒有一種內(nèi)參基因可以適用于所有的組織和細(xì)胞，以及能夠滿足各種不同的實(shí)驗(yàn)條件，如錯誤的選擇一種內(nèi)參基因，可能導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的錯誤，甚至與結(jié)論背道而馳，所以選擇2個或以上的內(nèi)參基因有助于發(fā)現(xiàn)偏差，以確保結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

3 內(nèi)參基因的不穩(wěn)定性

GAPDH和β-actin是常選擇的內(nèi)參基因，但Glare等研究發(fā)現(xiàn)在哮喘氣道組織中這兩個內(nèi)參基因表達(dá)并不穩(wěn)定，不適合作為內(nèi)參校正數(shù)據(jù)[4]。Radonic等證實(shí)GAPDH和β-actin這兩個內(nèi)參基因明顯地受有絲分裂原刺激的調(diào)節(jié)，表現(xiàn)出在實(shí)驗(yàn)條件下細(xì)胞內(nèi)看家基因的激活[5]。也有研究報道Let-7a在結(jié)直腸癌中表達(dá)穩(wěn)定適合作為內(nèi)參基，，而另有實(shí)驗(yàn)證明Let-7a對結(jié)直腸癌有抑癌作用，不適合作為內(nèi)參基因[6，7]。

4 內(nèi)參基因穩(wěn)定性分析

由于內(nèi)參基因在不同實(shí)驗(yàn)條件下、不同組織和細(xì)胞中表達(dá)量不同，甚至差異明顯，這為內(nèi)參基因的選擇出了難題。針對這一問題，Jo Vandesompele，Claus 和 Michael等分別編寫 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 程序用于進(jìn)行比較內(nèi)參基因的表達(dá)變化和穩(wěn)定性評價[8，9]，以便篩選出表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因，保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性。

GeNorm程序是Jo Vandesompele于2002年編寫的專門用來篩選RT-PCR內(nèi)參基因的程序，后來該程序得到進(jìn)一步改進(jìn)[10]，其核心原理是：無論在何種實(shí)驗(yàn)條件下或何種細(xì)胞內(nèi)，兩個理想內(nèi)參基因表達(dá)水平的比值應(yīng)該在所有標(biāo)本中一致，表達(dá)水平不受基因間表達(dá)豐度差別和極端比值的影響，比值變異度的增加意味著二者中其一或全部基因表達(dá)穩(wěn)定性的降低。該程序主要通過計算某一基因與其他所有基因間兩兩比值的對數(shù)轉(zhuǎn)換值的平均變異度M作為基因穩(wěn)定性的評價指標(biāo)， M 值越小，表示內(nèi)參基因的表達(dá)越穩(wěn)定，確定最穩(wěn)定的內(nèi)參基因，并通過對標(biāo)準(zhǔn)化因子進(jìn)行配對差異分析來判定所需內(nèi)參基因的最適數(shù)目[11-13]。

NormFinder程序是基于一個固定的統(tǒng)計學(xué)框架方差分析，通過測定每個基因的穩(wěn)定值，根據(jù)穩(wěn)定值的大小排序，最終將表達(dá)穩(wěn)定值最小的基因作為最穩(wěn)定的基因。但是它的不足之處在于只能選擇1個最合適的內(nèi)參基因[14]。

BestKeeper程序可以分析基因表達(dá)穩(wěn)定性和基因表達(dá)水平，它通過把原始數(shù)據(jù)輸入BestKeeper軟件的Excel表格中，對內(nèi)參基因和目標(biāo)基因進(jìn)行單獨(dú)分析。它的優(yōu)點(diǎn)是不僅可以分析內(nèi)參基因的穩(wěn)定性還可以比較目標(biāo)基因的表達(dá)水平，這是GeNorm和NormFinder程序不能達(dá)到的。但BestKeeper 程序只能計算一次配對相關(guān)系數(shù)，當(dāng)排除某個基因后該程序不能重新計算，這也是其不足之處。

內(nèi)參基因選擇是否正確直接影響著實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，這三種內(nèi)參基因分析軟件分別采用不同的統(tǒng)計學(xué)分析方法，從不同方面幫助篩選適合的內(nèi)參基因，綜合三種軟件分析的結(jié)果，可為正確選擇內(nèi)參基因提供更加可靠的依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳鳳花，王琳，胡麗華.實(shí)時熒光定量RT-PCR內(nèi)參基因的選擇[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2005，23（5）：393-395.

[2] Farrokhi A，Eslaminejad M B，Nazarian H，et al.Appropriate reference gene selection for real-time PCR data normalization during rat mesenchymal stem cell differentiation[J].Cell Mol Biol （Noisy-le-grand），2012，58 Suppl：L1660-L1670.

[3] Stephens A S，Stephens S R，Morrison N A.Internal control genesfor quantitative RT-PCR expression analysis in mouse osteoblasts， osteoclasts and macrophages[J].BMC Res Notes，2011，4：410.

[4] Glare E M.，Divjak M， Bailey M J，et al.b-Actin and GAPDH housekeeping gene expression in asthmatic airways is variable and not suitable for normalising mRNA levels[J].Thorax， 2002， 57：765-770.

[5] Radonic A，Thulke S，Mackay IM，etal.Guideline to reference geneselection for quantitative real-time PCR [J].Biochem Biophys Res Commun，2004，313（4）：856-862.

[6] Monzo M.Navarro A，Bandres E，et al.Owerlapping expression of microRNAs in human embryonic colon and colorectal cancer [J].Cerll Res，2008，18（8）：823-833.

[7] Akao Y.Nakagawa Y.Naoe T.MicroRNAs 143 and 145 are possible common onco-microRNAs in human cancers[J].Oncol Rep.2006.16（4）：845-850.

[8] Claus Lindbjerg Andersen，Jens Ledet Jensen，Torben Falckrntoft.Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-PCR Data：A Model-Based Variance EstimationApproach to Identify Genes Suited for Normalization，Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets[J].CANCER RESEARCH，2004，64（8）： 5245-5250.

[9] Michael W Pfaffl，Ales Tichopad，Christian Prgomet，et al.Determination of stable housekeeping genes，differentially regulated targetgenes and sample integrity：BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations[J].Biotechnology Letters，2004，26：509-515.

[10] VandesomPeleJ，DePreterK，PattynFetal.Aeeurate norlnalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal eontrol genes[J].Genomebiology.2002，3（7）：researehO034.

[11] Peltier HJ，Latham GJ.Normalization of microRNA expression levels in quantitative RT-PCR assays：identification of suitable reference RNA targets in normal and cancerous human solid tissues[J].RNA.2008，14（5）：844一852.

[12] Mestdagh P，Van Vlierberghe P，De Weer A et al. A novel and universal method for microRNA RT-qPCR date normalizationg[J].Genome Biol.2009，10（6）：R64.

[13] Vandesompele J，Preter K D，Pattyn F，et al. Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes [J].Genome Biol，2002，3 （7）：research0034.1-0034.11.

[14] Ferreira E， Cronjé MJ （2012）. Selection of suitable reference genes for quantitative real-time PCR in apoptosis-induced MCF-7 breast cancer cells. Mol Biotechnol，50：121-128.