人參發(fā)狀根低聚糖對小鼠肝臟生理活性指標(biāo)的影響

王超　秦晶晶　韓怡來　王康宇　孫春玉　張美萍　王義

摘 要：研究人參發(fā)狀根低聚糖對小白鼠肝脂，抗氧化等生理活性指標(biāo)的影響。把低聚糖分成5個(gè)不同分子量的組分，各個(gè)組分分別配制5個(gè)不同飼喂?jié)舛?，陽性藥組，陰性組，總苷組，共計(jì)28組，飼喂周期10d，摘取肝臟，然后對肝臟提取液進(jìn)行測定各項(xiàng)生理指標(biāo)。發(fā)狀根低聚糖能顯著降低膽固醇和甘油三酯含量，顯著升高肝臟中谷胱甘肽含量，提高過氧化氫酶酶活性。25個(gè)低聚糖組分中B2在5mg/kg/d水平組和C在5mg/kg/d水平組具有降肝脂，提高抗氧化能力等生理活性。

關(guān)鍵詞：低聚糖；膽固醇；甘油三酯；過氧化氫酶；谷胱甘肽

中圖分類號：S567.51 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20160532001

人參 （PanaxginsengC.A.Mey.）為五加科人參屬植物，名貴的保健品，以其根和根莖入藥，味甘、微苦，微溫，歸脾、肝、心、腎經(jīng)，具有大補(bǔ)元?dú)?、?fù)脈固脫、補(bǔ)肝益脾、生津養(yǎng)血、安神益智等功效[1]。人參的化學(xué)組成非常復(fù)雜，主要含有皂苷類、多肽類和糖類等多種活性成分，糖類又可分為單糖、多糖和低聚糖[2]。人參發(fā)狀根是經(jīng)發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株浸染人參外植體遺傳轉(zhuǎn)化而成，屬非天然植物[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，低聚糖具有多種生物活性，在臨床上有廣泛的使用價(jià)值。低聚糖的保健功能是目前保健食品功能因子中研究的熱點(diǎn)之一，包括調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、抗突變、抗腫瘤、降血脂降血糖等活性[5]。楊艷燕等[6]人研究發(fā)現(xiàn)魔芋低聚糖能降低小鼠血糖含量和提高抗氧化能力的影響。國內(nèi)今年來亦有文獻(xiàn)報(bào)道，毛新民等[7]研究發(fā)現(xiàn)大豆低聚糖降脂和提高抗氧化能力功能的研究。本課題對已提取分離純化后人參發(fā)狀根低聚糖進(jìn)行活性低聚糖組分鑒定，探討發(fā)狀根低聚糖對小鼠肝脂，抗氧化能力等生理活性指標(biāo)的影響，為研制具有保健性功能食品提供一定的理論根據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料，試劑，儀器

人參發(fā)狀根低聚糖5個(gè)組分A、B1、B2、C、D：人參基因資源開發(fā)與用工程研究中心提供；雄性BALB/C小白鼠，體重20±1g，購于吉林大學(xué)。

膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品，甘油三酯標(biāo)準(zhǔn)品，過氧化氫酶標(biāo)準(zhǔn)品，還原性谷胱甘肽標(biāo)準(zhǔn)品，膽固醇酯酶，膽固醇氧化酶，過氧化氫酶，4-AAP，苯酚，甘油激酶，脂蛋白酯酶，甘油磷酸氧化酶，ATP，鉬酸銨：長春百金生物科技有限公司；30%雙氧水，異丙醇，氯仿，甲醇均為國產(chǎn)分析純。

755紫外分光光度計(jì)：人參基因資源開發(fā)與用工程研究中心。

1.2 方法

1.2.1 小白鼠分組與飼喂方案

根據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》關(guān)于人與小鼠體表面積換算的飼喂量公式[8]可知：

小鼠給藥量=人的給藥量×成人平均體重×0.0026×50

陽性對照組ginseng complex plus royal jelly給藥量為38mg/d，經(jīng)上述公式和單位換算公式折算出小鼠給藥量為6.916～7mg/kg/d。以此為依據(jù)，設(shè)計(jì)給藥量梯度為9 mg/kg/d、7 mg/kg/d、5 mg/kg/d、3 mg/kg/d、1 mg/kg/d，陽性藥對照組及發(fā)狀根總苷組給藥量均為7 mg/kg/d，陰性對照組飼喂蒸餾水

根據(jù)發(fā)狀根生物量低聚糖提取萃取率每克干樣品數(shù)量，按陽性對照ginseng complex plus royal jelly的給藥量折算出小鼠的給藥量（見表1），以此配制藥液，各稱取90mg、70mg、50mg、30mg、10mg低聚糖干樣及70mg陽性藥及70mg發(fā)狀根總苷于三角瓶，溶于20mL H2O，充分溶解，系好封口膜，標(biāo)注記號。

取20±1g雄性BALB/C小鼠，隨機(jī)分組，每組7只，按照表1分組，一共28組，共計(jì)196只。

通過灌胃的方式給予各組藥物，每天1次，1次1只飼喂0.2mL給藥組，周期10d，末次給藥后進(jìn)食10h，隨后禁食。

第11天進(jìn)行脫勁處死，并解剖小鼠取其肝臟液氮速凍后，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 實(shí)驗(yàn)分組與劑量表

實(shí)驗(yàn)分組 藥物名稱 藥物濃度/（mg/kg/d）

陽性對照組 ginseng complex plus royal jelly 7

陰性對照組 蒸餾水 –

總苷對照組 發(fā)狀根總皂苷 7

給藥組1 低聚糖組分A 9、7、5、3、1

給藥組2 低聚糖組分B1 9、7、5、3、1

給藥組3 低聚糖組分B2 9、7、5、3、1

給藥組4 低聚糖組分C 9、7、5、3、1

給藥組5 低聚糖組分D 9、7、5、3、1

1.2.2 指標(biāo)測定

指標(biāo)測定對象：小鼠肝臟提取液。

肝膽固醇的測定：總膽固醇酶氧化法；肝甘油三酯的測定：甘油三酯酶氧化法；過氧化氫酶的測定：可見光分光光度法；谷胱甘肽的測定：DTNB法。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：單因素方差分析檢驗(yàn)組間顯著性差異，5%顯著水平用*表示，1%極顯著水平用**表示；主要成分分析（PCA）歸納具有生物相關(guān)性成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 人參發(fā)狀根低聚糖對小鼠肝臟谷胱甘肽的影響

對正常小鼠給藥后，陽性藥對照組及低聚糖給藥組基本升高了小鼠肝谷胱甘肽含量，其中組分C在5mg/kg/d水平組的肝谷胱甘肽升高百分率為62.18%，與陽性藥對照組肝谷胱甘肽升高百分率66.22%相比，水平基本相近，與陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01）?？梢?，發(fā)狀根低聚糖可有效升高正常小鼠的肝臟谷胱甘肽水平（見表2）。

表2 肝臟谷胱甘肽GSH含量（mg/mL）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

陰性組 37.993±0.614 – – – – –

陽性組 – – 112.4793±0.717 – – –

總苷組 – – 98.9693±0.221 – – –

A – 36.0721±0.049 34.2108±0.717 50.8524±0.331 53.6788±0.653 23.9167±0.614

B1 – 57.5915±0.717 44.8561±0.501 46.5049±0.798 91.2571±0.922* 56.747±0.127

B2 – 20.9735±0.922 81.8232±0.819 29.7205±0.223 38.6515±0.364 44.4473±0.204

C – 11.4911±0.364 45.3812±0.508 100.4628±0.653** 36.0721±0.732 34.6558±0.522

D – 44.1021±0.221 30.1585±0.881 32.5391±0.512 22.3971±0.434 20.59±0.102

注：*為差異顯著（P<0.05），**為差異極顯著（P<0.01）

2.2 人參發(fā)狀根低聚糖對小鼠肝臟總膽固醇的影響

對正常小鼠給藥后，陽性藥對照組及低聚給藥組基本降低了小鼠肝臟總膽固醇含量，其中組分B2在5mg/kg/d水平組的肝膽固醇下降百分率為35.23%，與陽性藥對照組肝膽固醇下降百分率35.68%相比，水平基本相近，與陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01）。可見，發(fā)狀根低聚糖可有效降低正常小鼠的肝臟總膽固醇水平（見表3）。

表3 肝臟總膽固醇Total cholesterol含量（mg/mL）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

陰性組 5.0664±0.02 – – – – –

陽性組 – – 3.2587±0.0042 – – –

總苷組 – – 2.8663±0.0041 – – –

A – 4.2607±0.0024 4.6266±0.0052 4.4219±0.0069 4.5918±0.0076 4.1175±0.0085

B1 – 4.2907±0.037 4.4129±0.013 5.0389±0.008 3.9762±0.003 3.4338±0.0073

B2 – 4.1465±0.005 4.0715±0.012 3.2813±0.003** 4.6251±0.0014 4.6243±0.028

C – 5.0288±0.0032 4.5473±0.0012 3.3518±0.047* 3.9512±0.028 4.3858±0.0025

D – 4.3792±0.0023 4.6414±0.0032 3.8152±0.004 3.7778±0.0013 4.3269±0.0076

注：*為差異顯著（P<0.05），**為差異極顯著（P<0.01）

2.3 人參發(fā)狀根低聚糖對小鼠肝臟甘油三酯的影響

對正常小鼠給藥后，陽性藥對照組及低聚糖給藥組基本降低了小鼠肝臟甘油三酯含量，其中組分B2在5mg/kg/d水平組和組分C在7mg/kg/d水平組的肝甘油三酯下降百分率分別為33.17%、31.22%，與陽性藥對照組肝甘油三酯下降百分率27.6%相比，水平基本相近，與陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01）?？梢姡l(fā)狀根低聚糖可有效降低正常小鼠的肝臟甘油三酯水平（見表4）。

表4 肝臟甘油三酯Triglyceride含量（mg/mL）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

陰性組 2.1648±0.006 – – – – –

陽性組 – – 1.4467±0.0023 – – –

總苷組 – – 1.531±0.0031 – – –

A – 1.9875±0.0034 1.9735±0.0036 2.0248±0.0044 1.9104±0.0042 2.0127±0.009

B1 – 1.8308±0.0026 1.9653±0.0032 1.899±0.0074 2.0047±0.0054 2.1008±0.0034

B2 – 2.0488±0.0015 1.8979±0.0042 1.5672±0.001** 1.852±0.0032 1.7643±0.0042*

C – 1.9611±0.0034 1.489±0.0023** 1.5633±0.0044 1.9635±0.0048 2.0488±0.0043

D – 1.9431±0.0035 2.1952±0.0023 2.0563±0.0026 1.8928±0.0016 2.1108±0.0011

注：*為差異顯著（P<0.05），**為差異極顯著（P<0.01）

2.4 人參發(fā)狀根低聚糖對小鼠肝臟過氧化氫酶活性的影響

對正常小鼠給藥后，陽性藥對照組及低聚糖給藥組基本提高了小鼠肝過氧化氫酶的活性，其中組分C在5mg/kg/d水平組的肝過氧化氫酶酶活性升高百分率為68.28%，與陽性藥對照組肝過氧化氫酶酶活性升高百分率69.99%相比，水平基本相近，與陰性對照組比較差異極顯著（P<0.01）?？梢?，發(fā)狀根低聚糖可有效地提高正常小鼠的肝臟過氧化氫酶酶活性水平（見表5）。

（注：1976年國際生化協(xié)會(huì)酶學(xué)委員會(huì)對酶活性單位定義為：在特定的條件下，1 min能轉(zhuǎn)化1μmol底物的酶量，即1IU=1μmol/min。推薦采用國際單位（IU）來統(tǒng)一表示酶活性的大小。）

表5 肝臟過氧化氫酶CAT酶活性單位（IU）

H2O 9mg/kg/d 7mg/kg/d 5mg/kg/d 3mg/kg/d 1mg/kg/d

陰性組 305.1251±0.34 – – – –

陽性組 – 1016.7384±0.35 – – –

總苷組 – 621.9767±0.64 – – –

A 289.1447±0.84 274.9604±0.38 125.6012±0.27 171.034±0.74 144.6145±0.88

B1 396.9413±0.74 339.0024±0.74 408.7712±0.74 611.019±0.54 210.8157±0.54

B2 944.2217±0.43* 201.1598±0.63 339.1583±0.47 154.3688±0.18 159.9067±0.64

C 282.6878±0.63 651.1603±0.64 961.977±0.28** 344.068±0.43 336.9789±0.47

D 271.2865±0.74 480.3654±0.57 327.6615±0.47 299.0952±0.74 539.0581±0.47

注：*為差異顯著（P<0.05），**為差異極顯著（P<0.01）

2.5 活性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)主要成分分析（PCA）分析

由主要成分（PCA）分析旋轉(zhuǎn)空間成分分布圖（圖1）所示：

第一生物相關(guān)性成分有谷胱甘肽、過氧化氫酶；

第二生物相關(guān)性成分有血糖、膽固醇、甘油三酯。

2.6 人參發(fā)狀根低聚糖活性實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果總結(jié)

通過以上1～5的結(jié)果綜合分析可知，如表6所示。

表6

生物相關(guān)性成分 第一生物相關(guān)性成分 第二生物相關(guān)性成分

活性指標(biāo)名稱 谷胱甘肽、過氧化氫酶 膽固醇、甘油三酯。

活性寡糖組分 谷胱甘肽：C在5mg/kg/d

過氧化氫酶：C在5mg/kg/d 膽固醇： B2在5mg/kg/d

C在7mg/kg/d

甘油三酯：B2在5mg/kg/d

由表6可知，低聚糖劑量組B2在5mg/kg/d、C在5mg/kg/d水平組滿足小鼠肝臟中肝脂和抗氧化能力生理指標(biāo)的活性要求。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)對人參發(fā)狀根的次生代謝產(chǎn)物低聚糖的活性進(jìn)行了探索，通過對PCA分析結(jié)果與單因素方差分析結(jié)果相結(jié)合，研究結(jié)果顯示：人參發(fā)狀根低聚糖C在5mg/kg/d水平上肝谷胱甘肽、肝過氧化氫酶活性相對陰性對照組均差異極顯著升高，且略低于陽性藥對照組水平，差異不顯著。B2在5mg/kg/d水平上肝膽固醇、肝甘油三酯相對陰性對照組均差異極顯著降低，且略高于陽性藥對照組水平，差異不顯著。說明了人參發(fā)狀根低聚糖具有降肝脂，提高抗氧化等活性。

本實(shí)驗(yàn)對肝臟中總膽固醇，甘油三酯，還原型谷胱甘肽，過氧化氫酶活進(jìn)行的測定方法，相比利用ELISA試劑盒來說，節(jié)約成本，且結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)差小，對動(dòng)物活性實(shí)驗(yàn)測定方法的匯總有著一定意義。

本實(shí)驗(yàn)利用的是正常雄性BALB/C小白鼠，相比利用建模型小鼠，雖然能夠說明一定問題，但我們要從科研實(shí)驗(yàn)嚴(yán)謹(jǐn)度考慮，對下一步活性實(shí)驗(yàn)小鼠造模問題有待實(shí)施。

本實(shí)驗(yàn)以單因素方差分析與主要成分分析相結(jié)合的方式處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。對于兩種分析方法相結(jié)合讓活性數(shù)據(jù)分析更加系統(tǒng)化，能說明動(dòng)物活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果可靠，對于數(shù)據(jù)分析是本實(shí)驗(yàn)一大創(chuàng)新點(diǎn)。

肝臟是人體內(nèi)臟中最大的器官，其中含有大量肝脂質(zhì)和抗氧化酶，在脂質(zhì)，抗氧化方面扮演著重要角色。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明：人參發(fā)狀根低聚糖對降肝脂，提高抗氧化能力有著明顯影響，本實(shí)驗(yàn)的創(chuàng)新點(diǎn)在于檢測了低聚糖對肝臟脂質(zhì)和抗氧化酶的活性指標(biāo)，對利用細(xì)胞工廠技術(shù)培育植物次生代謝產(chǎn)物，為新型降肝脂，抗氧化制劑研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

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作者簡介：王超（1989-），男，在讀碩士，專業(yè)方向：生物大分子結(jié)構(gòu)與功能。