不同濃度肝素對高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白的影響

李鴿　肖偉　桂永豐　丁敬韜　任澤銀　趙久陽

【摘要】 目的：研究不同濃度梯度的肝素對高糖誘導(dǎo)的人腹膜間皮細(xì)胞水通道蛋白AQP1、AQP3蛋白表達(dá)的影響。方法：采用免疫組化法檢測試驗組與對照組AQP1、AQP3蛋白的表達(dá)。結(jié)果：與對照組比較，試驗組AQP1和AQP3蛋白陽性表達(dá)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；且AQP1和AQP3蛋白表達(dá)水平在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組呈現(xiàn)明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；免疫組化示2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組細(xì)胞可見胞核及胞漿有空泡樣改變。結(jié)論：大劑量肝素在高糖環(huán)境中可顯著誘導(dǎo)AQP1、AQP3的表達(dá)，且能使胞漿及胞核出現(xiàn)明顯的空泡樣改變。

【關(guān)鍵詞】 肝素； 人腹膜間皮細(xì)胞； 水通道蛋白

The Effect of Different Concentrations of Heparin on the Expression of Aquaporins of Human Peritoneal Mesothelial Cells Induced by Glucose/LI Ge，XIAO Wei，GUI Yong-feng，et al.//Medical Innovation of China，2016，13（09）：017-021

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of different concentrations of heparin on the expression of aquaporin-1（AQP1） and aquaporin-3（AQP3） of human peritoneal mesothelial cells（HPMCs） induced by glucose.Method：The expression levels of AQP1 and AQP3 were detected by immunohistochemistry in the control group and the experimental group.Result：Compared with the control group，the expression of AQP1 and AQP3 were upregulated in the experimental group treated by 2.5% glucose and 1.5×10-2 mg/mL of heparin，the differences were statistically significant（P<0.05）.Vacuolation was observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and 1.5×10-2 mg/mL of heparin by immunohistochemistry.Conclusion：The expression of AQP1 and AQP3 can be upregulated by glucose and high concentration of heparin.Vacuolation can be observed in the nucleus and cytoplasm treated by glucose and high concentration of heparin.

【Key words】 Heparin； Human peritoneal mesothelial cells； Aquaporin

First-authors address：The First Peoples Hospital of Changde，Changde 415000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2016.09.005

腹膜透析是腎臟替代治療方法之一，相對于血液透析而言，其具有維持血液動力學(xué)穩(wěn)定、保護(hù)殘余腎功能等優(yōu)勢。長期以來，一直認(rèn)為腹膜透析中水分子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)方式為簡單擴(kuò)散，但Agre等[1]發(fā)現(xiàn)了28KD通道構(gòu)成整合膜蛋白，提出了通道介導(dǎo)的水轉(zhuǎn)運(yùn)方式。Rippe等[2]用電腦模型，首次對水的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)用三孔模型進(jìn)行了解釋。超微孔（3-5?）被證實對水分子具有選擇通透性，水通道蛋白（aquaporins，AQPs）為超微孔的對應(yīng)物，可選擇性地跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)水分子，某些小分子溶質(zhì)如甘油、尿素等也可被水通道蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)。水通道蛋白（aquaporin，AQP）廣泛存在于動、植物及微生物的細(xì)胞膜上，迄今為止，已發(fā)現(xiàn)200余種水通道蛋白，在哺乳動物中，已克隆并鑒定出13種水通道蛋白，分為別AQP0～AQP12[3]。在與吸收和分泌液體有關(guān)的上皮細(xì)胞和協(xié)同水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的內(nèi)皮細(xì)胞中這些AQPs廣泛存在。研究表明，在某些特定條件下，水通道蛋白的表達(dá)受到激素、滲透壓改變和某些藥物的影響[4]。Tang等[5]提出AQP1存在于腹膜間皮細(xì)胞上，滲透劑（如葡萄糖）可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。Lai等[6]發(fā)現(xiàn)AQP3亦存在于腹膜間皮細(xì)胞上。臨床上腹透管堵塞為腹膜透析患者常見并發(fā)癥，為預(yù)防腹透管堵塞，肝素抗凝經(jīng)常使用于腹透液中。有研究顯示，大劑量肝素添加于含葡萄糖的腹透液中可使腹膜透析的超濾量增加[7]，這是否是通過影響了腹膜間皮細(xì)胞中AQP1、AQP3的表達(dá)而實現(xiàn)的，未見相關(guān)報道。故本實驗觀察腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3經(jīng)高糖誘導(dǎo)后肝素對其表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 （1）主要試劑：AQP1、AQP3一抗，美國Santa Cruz公司產(chǎn)品；細(xì)胞消化液（0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA-Na2，Sigma公司產(chǎn)品；1640培養(yǎng)液，Invitrogen公司產(chǎn)品；胎牛血清（FBS），天津TBD公司產(chǎn)品；DAB顯色液，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；免疫組化SP試劑盒：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；D-葡萄糖（分析純），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；肝素鈉注射液（12 500 U/2 mL，12 500 U相當(dāng)于100 mg），江蘇萬邦生化醫(yī)藥股份有限公司。PBS液、D-Hanks平衡鹽溶液為本實驗室自行配置，過濾滅菌分裝，室溫保存。（2）主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱，德國賀力式公司；垂直層流潔凈工作臺，上海上凈凈化設(shè)備有限公司；高速臺式冷凍離心機(jī)，德國賀力式儀器公司；紫外可見分光光度計（型號UV-9100），北京瑞利分析儀器公司生產(chǎn)；紫外分析儀（型號WFH-201）：溫州市孚華分析儀器廠；倒置相差顯微鏡：日本奧利巴斯公司生產(chǎn)。

1.2 人腹膜間皮細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定 本實驗從連續(xù)性腹膜透析患者透出液中分離并提取人腹膜間皮細(xì)胞，無菌條件下收集患者流出液標(biāo)本，于4 ℃1000 r/min離心10 min，棄除上清。用D-Hanks平衡鹽溶液洗滌沉淀2次，將細(xì)胞接種于含10%（V/V）胎牛血清的1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于CO2培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，光鏡下觀察貼壁生長情況，待貼壁良好后用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液，此后約每3天換液一次。待細(xì)胞生長融合成單層細(xì)胞后，用0.125%胰蛋白酶-0.01%EDTA 2 mL混合液消化細(xì)胞，吸管吹打均勻，使細(xì)胞密度保持在（1×105～1×106）/mL。第二代細(xì)胞用于形態(tài)學(xué)及免疫組化鑒定，第三代細(xì)胞進(jìn)行實驗研究。免疫組化顯示抗細(xì)胞角蛋白抗體陽性、抗波形蛋白抗體染色陽性，這正是間皮細(xì)胞的免疫學(xué)特征?？沟冖蜃涌贵w和抗白細(xì)胞CD45抗體染色陰性，由此可排除血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等。

1.3 分組與處理 將培養(yǎng)至第三代的人腹膜間皮細(xì)胞均勻接種在6孔培養(yǎng)板上，當(dāng)細(xì)胞貼壁生長達(dá)約80%融合狀態(tài)時，用無血清的1640培養(yǎng)液同步化24 h，使多數(shù)細(xì)胞處于G0期。用一定劑量的無菌注射用水稀釋肝素鈉注射液（50 mg/mL），配置不同濃度的肝素溶液；無菌稱取葡萄糖25 g，將其溶于無菌三蒸水1000 mL中，配置成2.5%高糖溶液。然后按照不同實驗要求隨機(jī)分為以下五組：（1）無葡萄糖、無肝素對照組；（2）2.5%葡萄糖組；（3）2.5×10-3mg/mL肝素+2.5%葡萄糖組；（4）5.0×10-3 mg/mL肝素+2.5%葡萄糖組；

（5）1.5×10-2 mg/mL肝素+2.5%葡萄糖組。

1.4 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測AQP1、AQP3蛋白表達(dá) 吸取6孔培養(yǎng)板中的培養(yǎng)液，用pH=7.4的PBS液沖洗3次，再用2%多聚甲醛冰上固定30 min。再用PBS沖洗，5 min/次，沖洗3次。待自然風(fēng)干后，用3%H2O2室溫避光孵育30 min以滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS沖洗5 min，洗3次，正常血清封閉非特異性抗原10 min后，加Ⅰ抗AQP1、AQP3多克隆抗體（1∶200稀釋），置于4 ℃孵育過夜。PBS洗3次，5 min/次，加入生物素化Ⅱ抗37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次，加入鏈酶親和素-生物素-堿性磷酸酶復(fù)合物，37 ℃孵育30 min，PBS洗3次，5 min/次。在蓋玻片上滴加DAB顯色液，顯微鏡下觀察10 min，鏡下觀察至出現(xiàn)棕黃色陽性信號，蒸餾水水洗終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，碳酸鋰水溶液（pH7.0～8.0）返藍(lán)；梯度乙醇逐級脫水；透明，過二甲苯溶液；中性樹膠封片，自然風(fēng)干。光鏡下觀察拍照，每張切片鏡下隨機(jī)取5個視野，用Image Pro Plus6.0圖像分析軟件測量出積光密度值（IOD），并計算平均光密度。著色越深，則IOD值越大，表明該蛋白表達(dá)水平越高，最后對各組的AQP1和AQP3蛋白表達(dá)水平進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，看是否具有統(tǒng)計學(xué)差異。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間的比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

免疫組化結(jié)果顯示：無糖無肝素組、2.5%葡萄糖組中AQP1、AQP3蛋白均有表達(dá)（圖1～3），但在2.5%葡萄糖加不同濃度梯度的肝素組中AQP1、AQP3陽性表達(dá)均明顯高于無糖無肝素對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（F=6.82，P<0.05），胞核上亦可見棕黃色深染顆粒；與2.5%葡萄糖組比較，AQP1蛋白在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組中的表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=3.92，P<0.05）；以及2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組與2.5%葡萄糖加2.5×10-3 mg/mL及5.0×10-3 mg/mL肝素組比較，AQP1的表達(dá)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.25、4.59，P<0.05）；而2.5%葡萄糖組、2.5%葡萄糖組加2.5×10-3 mg/mL肝素組、2.5%葡萄糖組加5.0×10-3 mg/mL肝素組之間，組間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.54，P>0.05），見圖4～6、圖10。與2.5%葡萄糖組比較，AQP3蛋白在2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組中表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.51，P<0.05）；2.5%葡萄糖加

1.5×10-2 mg/mL肝素組與2.5%葡萄糖加

2.5×10-3 mg/mL、5×10-3 mg/mL肝素組比較，AQP3蛋白表達(dá)比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.04、4.88，P<0.05）；而2.5%葡萄糖組與2.5%葡萄糖加2.5×10-3 mg/mL、5×10-3 mg/mL肝素組比較，AQP3蛋白表達(dá)無明顯統(tǒng)計學(xué)差異（F=1.91，P>0.05），見圖7～9、圖11。2.5%葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組細(xì)胞免疫組化圖片可見，胞核及胞漿有空泡樣變，而2.5%葡萄糖加常規(guī)劑量肝素組胞漿胞核未見明顯空泡樣變。

3 討論

自三孔模型的提出以來，水通道蛋白的研究逐漸引起人們的重視，它們對轉(zhuǎn)運(yùn)細(xì)胞內(nèi)外的水分子有重要作用，某些小分子溶質(zhì)在特定情況下也可被其跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)?，F(xiàn)有的研究提示在人的腹膜間皮細(xì)胞中存在AQP1、AQP3蛋白質(zhì)的表達(dá)[8]。AQP1為選擇性水通道蛋白，AQP3不僅對水通透，而且能介導(dǎo)甘油或尿素等小分子的通透性。研究證實，AQP3與腎臟尿濃縮能力密切相關(guān)，如果AQP3缺失將會導(dǎo)致小鼠多飲多尿及腎萎縮等[9-10]。大鼠腹膜細(xì)胞上的AQP1經(jīng)HgCl2阻斷后，66%的水分子轉(zhuǎn)運(yùn)受到抑制[11]。目前認(rèn)為在腹膜間皮細(xì)胞跨膜水轉(zhuǎn)運(yùn)中AQP1、AQP3是其主要通道，其蛋白數(shù)量、結(jié)構(gòu)或功能的改變，均對腹膜透析的水超濾改變有一定影響。研究表明，高糖腹透液可以促進(jìn)腹膜間皮細(xì)胞AQP1的表達(dá)[12]，且能增加AQP1由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞膜上，從而增加該細(xì)胞對水的通透性。這種穿梭機(jī)制的存在提示AQP1在細(xì)胞內(nèi)分布的改變可能也與腹膜超濾衰竭的發(fā)生有關(guān)[13]。長期的腹膜透析可引起腹膜組織纖維化，導(dǎo)致超濾衰竭，使患者被迫放棄透析治療，極大影響腎衰竭患者的生活質(zhì)量。臨床上肝素作為常用抗凝劑，主要用于防止血栓形成或栓塞性疾病、DIC，亦用于血液透析、腹膜透析預(yù)防腹透管堵塞等抗凝。研究表明，低分子肝素還能延緩早期腎功能不全進(jìn)展，且對腎病綜合征患者療效較好[14-15]。但肝素或低分子肝素對經(jīng)高糖誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞AQP1、AQP3的表達(dá)是否有影響，國內(nèi)外相關(guān)報道甚少。由此筆者猜想肝素是否通過對高糖環(huán)境中腹膜間皮細(xì)胞上的水通道蛋白表達(dá)的影響來增加超濾及尿素排泄的。

本研究通過人腹膜間皮細(xì)胞（HPMCs）的體外培養(yǎng)實驗表明，與無糖無肝素對照組比較，2.5%葡萄糖組及不同濃度梯度的試驗組中AQP1和AQP3蛋白陽性表達(dá)均明顯增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）；且AQP1和AQP3蛋白表達(dá)水平在葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組呈現(xiàn)明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；免疫組化示葡萄糖加1.5×10-2 mg/mL肝素組細(xì)胞可見胞核及胞漿有空泡樣改變。本實驗主要闡述了肝素對腹膜間皮細(xì)胞上AQP表達(dá)的影響及1.5×10-2 mg/mL肝素對腹膜透析中腹膜間皮細(xì)胞可能存在的損傷作用，這種表現(xiàn)的具體過程及分子機(jī)制有待深入研究。筆者進(jìn)一步推測人腹膜間皮細(xì)胞中AQP1、AQP3表達(dá)或功能的改變可影響跨腹膜水轉(zhuǎn)運(yùn)，甚至可導(dǎo)致腹膜超濾衰竭的發(fā)生。

總之，本研究證實了在2.5%高糖環(huán)境下1.5×10-2 mg/mL大劑量肝素對體外培養(yǎng)的人腹膜間皮細(xì)胞上AQP1、AQP3的表達(dá)有明顯上調(diào)作用，并致胞漿胞核出現(xiàn)空泡樣改變，而在常規(guī)劑量下未見此改變，提示中低劑量的肝素對人腹膜間皮細(xì)胞可能具有一定程度的保護(hù)作用。

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（收稿日期：2015-10-08） （本文編輯：歐麗）