胡桃楸種仁殼黃酮二次純化及體外抗氧化作用研究

徐紅艷　包怡紅

摘要：利用HPD600大孔樹脂二次純化胡桃桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）種仁殼黃酮，并分析二次純化黃酮的體外抗氧化作用。結(jié)果表明，純化后黃酮純度進一步提高到54.39%，二次純化胡桃楸種仁殼黃酮表現(xiàn)出較好的清除ABTS、DPPH、羥自由基的能力和明顯的脂質(zhì)過氧化抑制作用，IC₅₀值分別為9.52μg/mL，1.273、1.479、1.678mg/mL，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系，且脂質(zhì)過氧化抑制作用優(yōu)于維生素C，可進一步開發(fā)成食品添加劑或功能性食品。

關(guān)鍵詞：胡桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）；種仁殼；黃酮；抗氧化作用

中圖分類號：TS255.1 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2339-05

自由基是指含有孤立、不成對價電子的原子或原子基團。生物體在自然的新陳代謝過程中，會產(chǎn)生如超氧陰離子自由基（O₂^-·）、羥自由基（·OH）和過氧化氫（H₂O₂）等活性氧自由基。研究表明，哺乳動物的機體具有某些抵抗和減少氧化損傷的防御機制，但是由于活性氧自由基的高度活化，能夠破壞脂類、蛋白質(zhì)、酶類、DNA以及RNA等，所以當(dāng)這些活性氧自由基過量產(chǎn)生而又不能被及時清除時，就會對機體造成極大的損害，甚至引發(fā)疾病?？寡趸锞哂羞€原性，在反應(yīng)過程中由于提供基團和氫原子而自身被氧化，因此發(fā)揮著自由基清除和氧化反應(yīng)鏈阻斷的作用，流行病學(xué)調(diào)查也顯示含有抗氧化特性食物的攝入，特別是黃酮類和其他多酚化合物可提高機體的抗氧化功能，對人類的健康十分有益。

胡桃楸（JuglansmandshuricaMaxim.）已在民間和傳統(tǒng)醫(yī)藥中用于治療多種疾病，現(xiàn)代研究表明，胡桃楸具有抗氧化、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、抗HIV等廣泛的生物活性。胡桃楸種子是林業(yè)副產(chǎn)品，其種仁（俗稱山核桃仁）營養(yǎng)價值很高。早已成為人們的食療佳品。在種仁生產(chǎn)過程中，產(chǎn)生大量的種仁殼廢棄物被丟棄，造成了資源的浪費。黃酮是具有酚羥基的一類還原性化合物，研究表明，黃酮具有抗氧化、保護心血管系統(tǒng)、抗腫瘤等多種生物活性。目前，關(guān)于胡桃楸種仁殼黃酮的體外抗氧化作用研究鮮見報道。

本研究是在前期胡桃楸種仁殼黃酮的提取工藝優(yōu)化、大孔樹脂純化條件選擇的基礎(chǔ)上。進行二次純化。并通過建立ABTS、DPPH、羥自由基和脂質(zhì)過氧化等不同的氧化反應(yīng)體系，分析二次純化胡桃楸種仁殼黃酮的體外抗氧化作用，為胡桃楸種仁殼黃酮后續(xù)生物活性的深入研究奠定基礎(chǔ)，為實現(xiàn)廢棄胡桃楸種仁殼的綜合利用和提高胡桃楸種子的附加值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

胡桃楸種仁殼一次純化黃酮：采用超聲波輔助提取。HPD-600大孔樹脂純化。45℃減壓濃縮，4℃保存。DPPH、ABTS、大豆卵磷脂（Phosphatidvl-choline）、二甲基亞砜（DMSO），購于Sigma公司；Trolox，購于Merck公司：維生素C，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。其他試劑均為分析純。

1.2儀器

G560E型旋渦混合器，美國Scientificindustries公司：5804R型離心機，德國Eppendorf公司：UV-2450型紫外分光光度計，日本島津公司：InfinireM200PRO型全波長酶標(biāo)儀，瑞士TECAN公司。

1.3 方法

1.3.1 胡桃楸種仁殼黃酮二次純化 將胡桃楸種仁殼黃酮一次純化液調(diào)成質(zhì)量濃度為1.2mg/mL的溶液，動態(tài)上樣，控制流速1mL/min。先用4BV的蒸餾水洗樹脂柱，然后用40%乙醇溶液洗脫，控制洗脫流速2mL/min，洗脫液分段收集：再用60%的乙醇溶液洗脫，洗脫液分段收集，測定每份洗脫液中黃酮的濃度，計算黃酮回收率。

1.3.2 黃酮純度測定 稱取純化后各段產(chǎn)品凍干粉溶于60%乙醇溶液中，采用NaNO₂-A1（NO₃）₃比色法測定溶液的黃酮濃度，按公式（1）計算純度，并進行比較。

（1）

式中，C為黃酮質(zhì)量濃度（mg/mL），N為稀釋倍數(shù)，y為樣品液體積（mL），m為樣品質(zhì)量（mg）。

1.3.3 總還原力測定 測定大孔樹脂純化后各段產(chǎn)品的總還原力，并進行比較。采用鐵氰化鉀還原法，在試管中加入提取液2mL，再分別加入pH6.6的磷酸緩沖液2.5mL、1%鐵氰化鉀2.5mL，混勻后密封50℃水浴20min，然后冰浴急速冷卻，再加入10%的三氯乙酸2.5mL，混勻，4000r/min離心10min。取上清液2.5mL。加入2.5mL蒸餾水，再加入0.5mL三氯化鐵顯色，靜置10min，700nm波長處測定其吸光度A₁。以蒸餾水代替提取液的吸光度為A₀。Fe³⁺總還原力=A₁-A₀，A₁-A₀越大說明Fe³⁺總還原力越強。

1.3.4 二次純化胡桃楸種仁殼黃酮體外抗氧化作用

1）清除ABTS自由基

參照Kim等的方法并略有改進。2.6mmol/L過硫酸鉀溶液與7.4mmol/LABTS溶液等體積混合，室溫避光靜置24h后為ABTS儲備液，4℃避光儲存。用時稀釋成ABTS工作液，使其在734nm波長下吸光度為0.700±0.020。取ABTS工作液2.85mL，加入胡桃楸種仁殼黃酮樣品液0.15mL，室溫避光10min，734nm波長下測A₁，以蒸餾水代替ABTS工作液的吸光度為A₂，以甲醇代替樣品液的吸光度為A₀。按公式（2）計算清除率：

（2）

2）清除DPPH自由基

參照Gtilsen等的方法并略有修改。0.15mmol/LDPPH儲備液，4℃避光儲存。用時稀釋成DPPH工作液，使其在517nm波長下吸光度為0.700±0.020。取DPPH工作液100μL，加入胡桃楸種仁殼黃酮樣品液100μL，室溫避光30min，517nm波長下測定A₁，以無水乙醇代替DPPH工作液的吸光度為A₂，以無水乙醇代替樣品液的吸光度為A₀。按公式（2）計算清除率。

3）清除羥自由基（·OH）

采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基（·OH）。羥基自由基氧化水楊酸產(chǎn)生的2，3-二羥基苯甲酸，其在510nm處有特征吸收。從而可以通過檢測反應(yīng)體系中2，3-二羥基苯甲酸的生成量，檢測殘留的羥自由基，進而測定胡桃楸種仁殼黃酮對羥基自由基的清除作用。

取6mmol/L的FeSO₄，7H₂O溶液1mL，加入6mmol/L的H₂O，溶液1mL，立即混勻，加入1mL胡桃楸種仁殼黃酮樣品液，混勻。靜置10min。再加入6mmol/L的水楊酸鈉溶液1mL，37℃水浴30min，4000r/min離心10min，取上清液510nm波長處測定吸光度A₁，蒸餾水代替水楊酸鈉溶液的吸光度為A₂，蒸餾水代替樣品液的吸光度為A₀。按公式（2）計算清除率。

4）對脂質(zhì)過氧化的抑制作用 胡桃楸種仁殼黃酮對脂質(zhì)過氧化的抑制作用通過對反應(yīng)體系中丙二醛的減少量進行衡量。參照Huang等的方法并略有修改，用0.1mol/L的PBS配制1%的大豆卵磷脂溶液。取0.5mL卵磷脂溶液加入6mmol/L的FeSO₄·7H₂O溶液0.2mL和100mmol/L的H₂O₂溶液0.1mL。再加入1mL不同濃度的黃酮樣品溶液，混合物于37℃水浴60min，加入15%的三氯乙酸溶液1mL，再加入0.8%的硫代巴比妥酸溶液1mL，于沸水浴中15min，然后迅速冷卻，5000r/min離心10min，取上清液532nm波長下測定吸光度A₁。蒸餾水代替卵磷脂溶液的吸光度為A₂，蒸餾水代替黃酮樣品液的吸光度為A₀，按公式（2）計算清除率。

1.4 曲線擬合

采用CurveExpert1.3軟件進行曲線擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 二次純化解吸曲線

將胡桃楸種仁殼黃酮一次純化液動態(tài)上樣，控制洗脫流速2mL/min，40%乙醇溶液洗脫，洗脫液共收集9份（圖1中1～9號），每份100mL：60%乙醇溶液洗脫，洗脫液每100mL收集1份，共收集9份（圖1中10～18號），測定每份洗脫液黃酮濃度，結(jié)果如圖1所示。40%乙醇洗脫初期，洗脫液中只有極少部分黃酮成分，之后隨洗脫劑體積的增加，洗脫液中黃酮含量迅速增加，在第二管時。黃酮含量達到最大值，之后洗脫液中黃酮含量迅速下降。更換洗脫劑為60%乙醇后，洗脫流份中黃酮含量雖有少量增加，但含量仍然很低，并且隨著洗脫劑用量的增加，洗脫流份中黃酮含量迅速下降。經(jīng)測定，40%乙醇洗脫流份的黃酮回收率已達到上樣黃酮量的85.9%。表明二次純化使用40%乙醇為洗脫劑，即可將大部分吸附在樹脂上的黃酮洗脫下來。而且動態(tài)解吸曲線的峰形窄而高，能達到充分富集黃酮的目的，這樣有利于集中收集洗脫下來的黃酮成分。并能節(jié)約洗脫劑。因此，確定二次純化的洗脫劑為40%乙醇溶液。

2.2 二次純化效果分析

將各段餾份減壓濃縮，真空冷凍干燥。各段產(chǎn)品于60%乙醇溶液復(fù)溶后，測定各段產(chǎn)品的純度和Fe³⁺總還原力，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)大孔樹脂二次純化后。胡桃楸種仁殼黃酮的純度進一步提高，其中二、三段產(chǎn)品的純度分別由一次純化產(chǎn)物的37.7%提高到54.39%和48.45%，因此。選擇二次純化后的二段產(chǎn)品進行后續(xù)功能作用研究。

2.3 二次純化黃酮體外抗氧化作用研究

2.3.1 清除ABTS自由基 胡桃楸種仁殼黃酮對ABTS自由基的清除作用，如圖3所示。胡桃楸種仁殼黃酮對ABTS自由基的清除能力隨濃度的增加而增強，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)表1中擬合方程，求得50%抑制濃度，IC₅₀值為9.52μg/mL，陽性對照的IC₅₀值為4.14μg/mL，表明胡桃楸種仁殼黃酮對ABTS自由基具有良好的清除作用。

2.3.2 清除DPPH自由基 胡桃楸種仁殼黃酮對DPPH自由基的清除作用，如圖4所示。胡桃楸種仁殼黃酮對DPPH自由基的清除作用隨濃度的增加而增強，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)表2中擬合方程。求得50%抑制濃度IC₅₀值為1.273mg/mL，陽性對照的，IC₅₀值分別為0.998mg/mL，表明胡桃楸種仁殼黃酮對DPPH自由基具有良好的清除作用。

2.3.3 清除羥自由基 胡桃楸種仁殼黃酮對·OH的清除作用，如圖5所示。胡桃楸種仁殼黃酮對·OH的清除作用隨濃度的增加而增強，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)表3中擬合方程，求得50%抑制濃度IC₅₀值為1.479mg/mL，陽性對照和維生素C的IC₅₀值分別為0.218、0.208mg/mL，盡管胡桃楸種仁殼黃酮對·OH清除作用弱于對照和維生素C。但當(dāng)濃度為2.25mg/mL時，清除率達57.86%。表明胡桃楸種仁殼黃酮對，OH具有較好的清除作用。

2.3.4 對脂質(zhì)過氧化的抑制作用 胡桃楸種仁殼黃酮對脂質(zhì)過氧化的抑制作用，如圖6所示。由圖6可知，胡桃楸種仁殼黃酮對脂質(zhì)過氧化的抑制作用隨濃度的增加而增強，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系。根據(jù)表4中擬合方程，求得50%抑制濃度，IC₅₀值為1.678mg/mL，陽性對照和維生素C的，IC₅₀值分別為0.696、2.753mg/mL?？梢姾议狈N仁殼黃酮對脂質(zhì)過氧化的抑制作用小于對照，但明顯強于維生素C。表明胡桃楸種仁殼黃酮對脂質(zhì)過氧化具有顯著的抑制作用。

3 小結(jié)與討論

生物活性物質(zhì)的生理活性功能往往與其抗氧化活性相關(guān)，于是抗氧化活性成為天然產(chǎn)物功能研究的首選項目。研究顯示，自由基會在機體代謝過程中產(chǎn)生過量的自由基會引發(fā)疾病，羥自由基被認為是引發(fā)機體衰老和導(dǎo)致疾病最直接的自由基，并認為可以與DNA的嘌呤堿基和嘧啶堿基相互作用，導(dǎo)致硫磺基與氧結(jié)合而生成對生物分子具有極大危害的氧硫磺基。過氧化脂質(zhì)是脂質(zhì)類氧化的極端反應(yīng)產(chǎn)物，脂質(zhì)過氧化被認為是所有生物體系中普遍存在的反應(yīng)過程，并能對細胞膜和DNA造成損傷。MDA是多不飽和脂肪酸過氧化產(chǎn)生的主要產(chǎn)物，大量研究已將脂質(zhì)氧化體系中MDA的減少用于衡量天然產(chǎn)物的抗脂質(zhì)過氧化能力。ABTS自由基常被用于衡量天然產(chǎn)物的總抗氧化能力。DPPH自由基清除能力被廣泛用于天然產(chǎn)物抗氧化活性評價中。研究顯示，黃酮化合物具有顯著的抗氧化作用，可清除自由基并抑制脂質(zhì)過氧化的發(fā)生。本研究中，通過ABTS、DPPH、羥自由基和脂質(zhì)過氧化等多個氧化反應(yīng)體系，測定二次純化胡桃楸種仁殼黃酮的體外抗氧化作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二次純化黃酮能夠有效清除ABTS、DPPH和羥自由基。對脂質(zhì)過氧化抑制作用優(yōu)于維生素C，顯示出較強的抗氧化作用，良好的抗氧化特性表明胡桃楸種仁殼黃酮可能具有其他生物活性功能，為進一步的深入研究奠定了基礎(chǔ)。但胡桃楸種仁殼黃酮體內(nèi)抗氧化效果有待進一步研究。本研究表明，二次純化胡桃楸種仁殼黃酮具有良好的清除ABTS、DPPH、羥自由基的能力和顯著的脂質(zhì)過氧化抑制作用，呈現(xiàn)劑量一效應(yīng)關(guān)系，其中脂質(zhì)過氧化抑制作用優(yōu)于維生素C。