細(xì)菌生物被膜定性和定量研究方法

陳朝喜

摘要：細(xì)菌生物被膜是浮游細(xì)菌和生物被膜細(xì)菌共同分布于同一生存空間內(nèi)的特殊生長方式，能夠逃避抗生素和機體免疫系統(tǒng)的清除而得以繼續(xù)生存。對細(xì)菌生物被膜定性和定量方法進(jìn)行了綜述，比較和分析了其優(yōu)缺點，旨在評價各種方法在生物被膜研究中的適用性。

關(guān)鍵詞：細(xì)菌生物被膜；浮游細(xì)菌；定性方法；定量方法

中圖分類號：Q939.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2016）09-2177-04

細(xì)菌生物被膜是細(xì)菌將其自身包裹在其分泌物內(nèi)形成的一種特殊復(fù)合體，具有不同于浮游細(xì)菌的一些特殊性質(zhì)，如生物被膜形成后造成細(xì)菌對外界環(huán)境的抵抗能力增強，在臨床上形成對常用抗菌藥物的耐受性，使得細(xì)菌性感染疾病遷延不愈和持續(xù)反復(fù)發(fā)作，給疾病治療帶來一定的難度。隨著研究方法的發(fā)展和多學(xué)科研究領(lǐng)域的交叉和拓寬，近年來細(xì)菌生物被膜的定量和定性研究方法越來越完善，這些方法根據(jù)原理大致可分為三類：①基于生物被膜胞外基質(zhì)和生物被膜內(nèi)的總細(xì)胞數(shù)量（包括活細(xì)胞和死亡細(xì)胞）的定量試驗：⑦基于活細(xì)胞的活菌計數(shù)試驗：③基于生物被膜胞外基質(zhì)成分的定量試驗。在相關(guān)研究中，研究者對生物被膜的結(jié)構(gòu)、活性和細(xì)菌組成動態(tài)變化規(guī)律等方面研究取得了很大的進(jìn)展，尤其是無損傷的、原位的和在線的技術(shù)能夠提供自動的、快速的和實時的信息，為生物被膜的研究提供了新的思路和方法。本文分析和比較了幾種常用生物被膜定性和定量方法在生物被膜生物量研究中的優(yōu)缺點，以期評價各方法在生物被膜研究中的適用性。

1 常用生物被膜定性研究方法

生物被膜定性研究方法主要借助各種染色方法（如銀染法）、光學(xué)和光譜學(xué)方法（如光學(xué)和電子顯微鏡技術(shù)等）進(jìn)行生物被膜檢查和監(jiān)測，尤其是顯微檢查技術(shù)在觀察選取生物被膜細(xì)菌群體的結(jié)構(gòu)參數(shù)和構(gòu)效關(guān)系方面具有明顯的優(yōu)勢。在生物被膜定性研究中，最常用的方法有以下幾種。

1.1 快速銀染法

快速銀染法主要用于細(xì)菌生物被膜的初步研究。其基本原理是通過快速銀染法能夠?qū)⒓?xì)菌生物被膜中的多糖蛋白復(fù)合物染成灰褐色或灰黑色，通過銀染能夠初步判斷不同培養(yǎng)階段生物被膜中多糖蛋白復(fù)合物的動態(tài)變化規(guī)律，其操作步驟具體包括10個操作步驟：①基質(zhì)材料表面浮游菌去除：②戊二醛固定；③蒸餾水漂洗；④氯化鈣結(jié)合；⑤蒸餾水漂洗；⑥硝酸銀染色；⑦對苯二酚顯色；⑧蒸餾水漂洗：⑨硫代硫酸鈉固定：⑩蒸餾水漂洗。

1.2 玻璃試管法

其原理是根據(jù)氣-液界面形成染色環(huán)狀物的顏色深淺來判定細(xì)菌生物被膜的形成能力。常用的染料有結(jié)晶紫和剛果紅等，由于該方法存在一定的主觀誤差，因此主要用于生物被膜形成能力的初步篩選。

1.3 基于電子顯微鏡的定性方法

借助原子力顯微鏡、透射掃描電鏡和激光聚焦顯微鏡等對細(xì)菌生物被膜進(jìn)行觀察，能夠?qū)ι锉荒さ牧Ⅲw結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性分析。尤其是相關(guān)染料與激光共聚焦顯微鏡相結(jié)合，能夠?qū)崿F(xiàn)對生物被膜中細(xì)菌生理狀態(tài)的定性和定量分析。相關(guān)電子顯微鏡定性研究方法的缺點是實驗條件要求較高，實驗設(shè)備較貴重，因此不常用于常規(guī)檢測和研究。隨著電子顯微鏡技術(shù)的發(fā)展，近年來，在實際的科研中。電子顯微鏡相關(guān)技術(shù)常與染色技術(shù)和分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌生物被膜的定性和定量研究。

2 生物被膜定量研究方法

2.1 瓊脂平板菌落計數(shù)法

瓊脂平板計數(shù)法是一種最基本的菌落計數(shù)法，在實際的實驗操作過程中不僅勞動強度大，而且費時，同時誤差較大，不適宜大樣本觀察。雖然可以通過多次計數(shù)求平均值的方法來減小實驗誤差，然而這樣無疑會增大工作量和強度，因此在實際實驗中很少單獨采用，常常結(jié)合其他方法對細(xì)菌生物量進(jìn)行定量研究。在生物被膜細(xì)菌計數(shù)過程中，需要輔助手段將生物被膜中的細(xì)菌游離，輔助手段對被膜細(xì)菌的影響也制約著瓊脂平板菌落計數(shù)法的重復(fù)性。

2.2 結(jié)晶紫（CV）染色法

結(jié)晶紫是一種堿性染料，能夠結(jié)合生物被膜表面帶負(fù)電荷的表面分子和胞外基質(zhì)中的多糖成分，通過測定吸光度來對細(xì)菌生物被膜形成能力進(jìn)行鑒定和分型。由于生物被膜中的胞外基質(zhì)成分和細(xì)菌本身（包括活細(xì)胞和死亡細(xì)胞）均能被結(jié)晶紫染色，因此改良結(jié)晶紫方法尤其不適合用于對抗菌藥物或者其他化學(xué)物質(zhì)對生物被膜內(nèi)細(xì)菌殺傷效果的評價。在研究中常用來對細(xì)菌生物被膜下次形成能力進(jìn)行初步篩選和鑒定。

1985年Christensen等首次采用結(jié)晶紫染色方法對非黏液性鏈球菌生物被膜進(jìn)行了定量分析，2000年，Stepanovic等對結(jié)晶紫方法進(jìn)行改進(jìn)，增加了結(jié)晶紫染色方法對細(xì)菌生物被膜定量的準(zhǔn)確性，其能夠?qū)ξ⒖装迳锉荒ど锪窟M(jìn)行較為全面的量化。然而，結(jié)晶紫染色方法在銅綠假單胞桿菌生物被膜定量中具有較大的批內(nèi)和批間誤差，其原因可能與銅綠假單胞桿菌含有較多的水通道導(dǎo)致其生物被膜固定不充分有關(guān)。

2.3 Syt09/PI染色法

Syto9是一種能夠?qū)怂徇M(jìn)行染色的熒光染料.能夠通過被動擴散的方式實行細(xì)胞膜與細(xì)菌菌體（包括活細(xì)胞和死亡細(xì)胞）的DNA結(jié)合。由于死亡細(xì)胞的細(xì)胞膜通透性改變和碘化丙啶（PI）只能穿過不完整的細(xì)胞壁的特點，PI可以進(jìn)入死細(xì)胞實現(xiàn)對死亡細(xì)胞的染色。由于DNA也是胞外基質(zhì)的一部分，因此可以通過對DNA的結(jié)合間接反映生物被膜總生物量的變化規(guī)律。

隨著科研儀器的發(fā)展，尤其是激光共聚焦顯微鏡（CLSM）的應(yīng)用之后。除了對生物被膜組成成分和形態(tài)學(xué)的研究外，Syto9/PI還常常用于細(xì)菌和酵母菌生物被膜生物量的研究。需要指出的是，在進(jìn)行Syto9/PI染色時，為獲取穩(wěn)定的熒光信號。在測定之前需對菌株進(jìn)行一段時間的孵育，而且孵育時間對不同的菌株影響較大。

2.4 MTT/XTT試驗

許多四唑鹽類染料如5-氰基-2，3-二-（p-芐基-四唑氯化物）（CTC）、3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽（MTF）、2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2，4-二磺酸苯）-2H-四唑單鈉鹽（CCK-8）和3，3-[1-（苯氨酰基）-3，4-四氮唑]-二（4-甲氧基-6-硝基）苯磺酸鈉（XTT）均能夠?qū)崿F(xiàn)對生物被膜中活細(xì)胞進(jìn)行相對的定量，而且能夠區(qū)別生物被膜中活細(xì)胞和死亡細(xì)胞。其中MTF/XTT試驗是以活細(xì)胞的代謝能力為基礎(chǔ)的定量化技術(shù)，是行之有效的方法之一。

活細(xì)胞線粒體中含有的琥珀酸脫氫酶能將加入的MTF/XTT代謝成為化合物甲月贊，利用酶標(biāo)儀在570nm處測定細(xì)胞上清液的吸光度來反映活細(xì)胞的代謝能力，因此可根據(jù)光密度OD值推測出活細(xì)胞的數(shù)目，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在懸浮細(xì)胞的定量化以及細(xì)菌和酵母生物被膜的定量研究中。然而由于其自身不可避免的種內(nèi)和種間變異較大的缺點限制了其在實際中的應(yīng)用，只能用來檢測細(xì)胞相對數(shù)和相對活力，不能測定細(xì)胞絕對數(shù)，因此在利用酶標(biāo)儀檢測結(jié)果的時候必須保證試驗結(jié)果在線性范圍內(nèi)。此外，由于XTT水溶液不穩(wěn)定，因此最好低溫保存或現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.5 試鹵靈試驗

刃天青又稱阿爾瑪藍(lán)。是一種藍(lán)色的化合物，可以被活細(xì)胞代謝成具有熒光活性的粉紅色的試鹵靈（Resorufin）。這種方法主要用于哺乳動物細(xì)胞的活性分析，也被廣泛應(yīng)用于真菌、結(jié)核桿菌、表皮葡萄球菌和變形鏈球菌的藥敏試驗。

2.6 熒光二乙酸（FDA）試驗

活的微生物細(xì)胞能夠利用其自身非特定內(nèi)源性和外源性酯酶將無色的、非熒光特性的熒光二乙酸（FDA）轉(zhuǎn)化成黃色的、高熒光特性的熒光物質(zhì)。FDA已廣泛用于土壤和垃圾中總微生物的活性監(jiān)測，也廣泛應(yīng)用于生物被膜生物量的定量研究。

需要指出的是，在熒光二乙酸鈉（FDA）試驗中，為了增加生物被膜中活細(xì)胞的熒光強度，必須通過降低對照孔的熒光信號干擾來實現(xiàn)測定結(jié)果的最優(yōu)化。此外，在利用該方法對不同種屬細(xì)菌生物被膜生物量進(jìn)行定量分析時，營養(yǎng)條件和菌株的生理特征等因素都會影響其靈敏度和重復(fù)性，因此需要建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來校正。

2.7 1，9-二亞甲基藍(lán)（DMMB）試驗

生物膜的一個重要組成部分——胞外基質(zhì)的定量也越來越引起大家的關(guān)注。研究表明，染料1，9-二亞甲基藍(lán)（DMMB）能夠和生物被膜胞外基質(zhì)的硫酸聚糖絡(luò)合形成一種不溶性的復(fù)合物，通過添加一種解聚試劑來間接測定和衡量生物被膜中硫酸多糖的含量。DMMB最初用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)液中硫酸多糖的定量研究和金黃色葡萄球菌生物被膜胞外基質(zhì)的定量研究。

2.8 多糖蛋白復(fù)合物（GLX）的測定——色氨酸定量試驗

國內(nèi)外學(xué)者采用色氨酸定量試驗對生物被膜中的多糖蛋白復(fù)合物進(jìn)行測定，利用酶標(biāo)儀讀取光密度值后求得多糖蛋白復(fù)合物的相對含量。生物被膜的形成不僅僅與自身的遺傳因素有關(guān)，各種培養(yǎng)條件對細(xì)菌生物被膜胞外多糖分泌量的影響也表現(xiàn)出不同的結(jié)果，這也充分證實了環(huán)境條件對其也起著重要的作用。

3 小結(jié)

綜上所述，上述方法尤其是FDA試驗和Re-sazurin試驗?zāi)軌蛱娲鷤鹘y(tǒng)的瓊脂平板計數(shù)法，而且大多數(shù)的方法簡便，易行，能夠?qū)ξ⒖装迳锉荒みM(jìn)行定量研究，是高通量的研究方法，具有較好的重復(fù)性和適用性，能夠?qū)崿F(xiàn)試驗樣品的高通量操作對生物被膜生物量的測定。

大多數(shù)細(xì)菌均能夠形成生物被膜來抵抗外界環(huán)境條件的改變，同時逃避機體的免疫系統(tǒng)清除作用。從而造成致病力的增強、持續(xù)性感染的遷延不愈和耐藥性的廣泛傳播。在獸醫(yī)領(lǐng)域，大腸桿菌的耐藥性已成為畜牧業(yè)生產(chǎn)中的一個重要難題，相關(guān)報道顯示不同來源的大腸桿菌均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性，其耐藥性的發(fā)展與生物被膜的形成也有一定相關(guān)性。更為嚴(yán)重的是，生物被膜的形成還會帶來一系列問題，包括在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（例如持久性和經(jīng)常性的感染）和非醫(yī)學(xué)領(lǐng)域（例如飲用水和食品加工領(lǐng)域的防腐處理等）。因此，無論是在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域還是獸醫(yī)領(lǐng)域，為了防止和治療細(xì)菌生物被膜引起的感染和耐藥性，必須對細(xì)菌生物被膜的病原和形成條件進(jìn)行深入分析和了解，以便正確合理地選擇敏感抗菌藥物和生物被膜清除劑，防止細(xì)菌生物被膜造成的持續(xù)性感染和遷延不愈造成不必要的經(jīng)濟損失。