熒光定量PCR技術在骨關節(jié)結核石蠟包埋標本檢測中的應用價值

穆晶 趙丹 劉子臣 車南穎 張海青

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·論著·

熒光定量PCR技術在骨關節(jié)結核石蠟包埋標本檢測中的應用價值

穆晶 趙丹 劉子臣 車南穎 張海青

目的 探討熒光定量聚合酶鏈式反應(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)在骨關節(jié)結核石蠟包埋標本病理診斷及鑒別診斷中的應用價值。方法 搜集2014年10月至2015年4月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院病理科診斷形態(tài)學符合結核的93例患者的石蠟包埋標本， 12例骨腫瘤患者的石蠟包埋標本。所有標本以FQ-PCR技術檢測結核分枝桿菌DNA，以抗酸染色法查找抗酸桿菌。以卡方檢驗分析實驗數據，比較FQ-PCR技術與傳統(tǒng)抗酸染色法在骨關節(jié)結核診斷中的敏感度和特異度；觀察不同發(fā)病部位與兩種技術檢測陽性率之間的相關性；以PCR-反向點雜交法對7例結核分枝桿菌DNA陰性而抗酸染色陽性患者進行非結核分枝桿菌檢測。結果 所有93例骨關節(jié)結核標本中FQ-PCR技術檢測陽性77例，敏感度82.8%；抗酸染色查到抗酸桿菌64例，敏感度68.8%。FQ-PCR技術檢測敏感度明顯高于抗酸染色法(χ2=5.659，P=0.021)。在不同發(fā)病部位FQ-PCR技術敏感度均高于抗酸染色法：在脊柱病變FQ-PCR技術和抗酸染色法陽性率分別為84.0%(42/50)和64.0%(32/50)(χ2=0.009，P=0.609)；在外周骨關節(jié)病變FQ-PCR技術和抗酸染色法陽性率分別為81.4%(35/43)和74.4%(32/43)(χ2=12.609，P=0.002)。PCR-反向點雜交法檢測確定戈登分枝桿菌1例。結論 FQ-PCR技術較抗酸染色法顯著提高了結核分枝桿菌陽性檢出率，并為進一步檢測非結核分枝桿菌做出重要提示，FQ-PCR技術在骨關節(jié)結核石蠟包埋標本檢測中具有良好的應用價值。

結核，分枝桿菌； 結核，骨關節(jié)； 聚合酶鏈式反應； 抗酸染色

骨關節(jié)結核是除淋巴結核和結核性胸膜炎外最常見的肺外結核，約占結核病患者的1%～3%[1]，是危害人們健康的嚴重感染性疾病。骨關節(jié)結核致殘率非常高，嚴重影響人們的健康、工作和生活。在常規(guī)病理診斷中，要確診結核病，除了要觀察到以肉芽腫伴干酪樣壞死為特征的病理組織學改變外，還需找到結核分枝桿菌作為病原學支持?？顾崛旧?acid-fast staining)尋找結核分枝桿菌是病理科最普遍、最常用的方法[2]，但該方法存在敏感度低、特異度差、費時費力等不足[3-4]。近年來，從石蠟組織中提取總DNA，應用FQ-PCR技術檢測石蠟組織中結核分枝桿菌的特異基因，越來越受到重視。多項研究表明，該技術在肺結核組織及淋巴結結核石蠟包埋標本中的檢測敏感度較常規(guī)抗酸染色有很大提高[5-6]，但在骨關節(jié)結核石蠟包埋標本中的檢測效率的研究比較少。因此，本研究納入了病理組織學形態(tài)符合結核的93例骨關節(jié)病變患者，應用熒光定量聚合酶鏈式反應(fluorescent quantitative polymerase chain reaction，FQ-PCR)技術檢測結核分枝桿菌DNA，探討其在骨關節(jié)結核病理診斷及鑒別診斷中的意義。

資料和方法

一、 研究對象

搜集2014年10月至2015年4月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院病理科連續(xù)送檢的骨關節(jié)結核病灶清除組織，將病理組織形態(tài)為慢性肉芽腫性炎伴壞死(圖1)，診斷為“結核”或“符合結核”的骨關節(jié)結核患者93例列為研究對象。其中男58例，女35例，年齡范圍1～83歲，平均年齡(40.14±19.65)歲，其中1～歲8例(8.6%)，15～歲75例(80.6%)，≥65歲10例(10.8%)。根據病變發(fā)生部位不同，分為脊柱病變和外周骨關節(jié)病變，其中脊柱病變50例(53.8%)：腰椎24例(25.8%)、胸椎13例(14.0%)、胸腰椎6例(6.5%)、腰骶椎5例(5.4%)、頸胸椎2例(2.2%)；外周骨關節(jié)病變43例(46.2%)：膝關節(jié)8例(8.6%)、髖關節(jié)7例(7.5%)、足部(踝關節(jié)，跟骨)7例(7.5%)、肘關節(jié)5例(5.4%)、腕關節(jié)4例(4.3%)、肩關節(jié)3例(3.2%)、骶髂關節(jié)3例(3.2%)、指骨3例(3.2%)、胸壁2例(2.2%)、恥骨1例1.1%。選取同期骨腫瘤患者12例，其中漿細胞性骨髓瘤6例，骨巨細胞瘤3例，骨淋巴瘤3例。對93例患者石蠟包埋標本和12例骨腫瘤患者的標本進行FQ-PCR檢測。

圖1 脊柱病灶組織呈肉芽腫性炎伴壞死、死骨、出血 (HE ×200)

二、 實驗方法

1. 標本處理：所有標本均經4%中性甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋。

2. 抗酸染色：抗酸染色試劑盒(BA-4090B)購自珠海貝索生物技術有限公司。抗酸染色：石蠟切片厚4 μm，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇(高濃度到低濃度)后入水；石碳酸復紅染色1 h，水洗后鹽酸乙醇分化數秒至無紅色，再水洗；亞甲藍染色20 s，水洗；梯度乙醇脫水，二甲苯透明后，中性膠封片，油鏡下觀察。結果判定：觀察見到紅色桿狀、略彎曲、串珠狀抗酸桿菌為抗酸染色陽性(圖2)。

圖2 抗酸染色見紅色桿狀、略彎曲抗酸桿菌(油鏡 ×1000)

3. FQ-PCR檢測結核分枝桿菌：石蠟包埋組織標本的DNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司(北京)，DNA提取按照試劑盒操作手冊進行。結核分枝桿菌核酸測定試劑盒(熒光PCR法，Z-RD-0060-02)購自上海之江生物科技股份有限公司。實時熒光定量PCR儀為美國羅氏公司的Cobas Z 480。PCR擴增體系總體積40 μl：TB PCR反應液36 μl，Taq酶0.4 μl，模板4 μl。將處理過的標本、陽性和陰性質控品分別吸取4 μl加入配制好的PCR體系中。PCR反應參數：37 ℃ 2 min，94 ℃ 2 min；再按93 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，循環(huán)40次，然后使用熒光定量PCR儀檢測；熒光信號收集時設定為羧基熒光素(FAM)，熒光信號收集設置在60 ℃。按照試劑盒說明書分析結果，出現典型S形擴增曲線為陽性。

4. PCR-反向點雜交法檢測非結核分枝桿菌：分枝桿菌菌種鑒定基因檢測試劑盒(PCR-反向點雜交法，M20141001)購自亞能生物技術(深圳)有限公司。PCR擴增體系總體積25 μl：PCR反應管內(含反應液)加入待測樣品4 μl，同時取2個PCR反應管，分別加入陽性質控品和陰性質控DNA。PCR反應參數：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；再按95 ℃ 45 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)30次；95 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)30次；68 ℃10 min。依次雜交，洗膜，顯色。根據膜條上探針位點進行結果判讀。

三、 統(tǒng)計學分析

利用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進行χ2檢驗分析，P<0.05差異具有統(tǒng)計學意義。

結 果

1. FQ-PCR法與抗酸染色法與臨床特征的關系：本組患者中男58例，占62.4%，女35例，占37.6%； 15～歲患者占80.6%(75/93)；脊柱是骨關節(jié)結核的最高發(fā)部位，占53.8%(50/93)，其次為膝關節(jié)8.6%(8/93)?？顾崛旧癋Q-PCR檢測結核分枝桿菌的敏感度在不同性別、年齡及不同病變部位組患者的差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

2. FQ-PCR法與抗酸染色法的比較分析：93例骨關節(jié)結核患者中，77例FQ-PCR法檢測結核分枝桿菌特異基因序列呈陽性，敏感度82.8%；64例抗酸染色查到抗酸桿菌，敏感度68.8%，FQ-PCR法敏感度明顯高于抗酸染色法(χ2=5.659，P=0.021)。12例骨腫瘤標本的FQ-PCR檢測和抗酸染色均為陰性，FQ-PCR技術特異度和抗酸染色法的特異度均為12/12。

3. FQ-PCR法與抗酸染色法在不同病變部位敏感度比較：50例脊柱病變中32例抗酸染色陽性，陽性率64.0%；42例FQ-PCR檢測呈陽性，陽性率84.0%。43例外周骨關節(jié)患者中32例查到抗酸桿菌，陽性率74.4%；35例FQ-PCR檢測陽性，陽性率81.4%。FQ-PCR在脊柱標本和外周骨關節(jié)標本的陽性檢出率均高于抗酸染色法，并且在外周骨關節(jié)標本中FQ-PCR技術陽性率與抗酸染色法比較差異有統(tǒng)計學意義(χ2=12.609，P=0.002)(表1)。

表1 不同性別、年齡和病變部位骨關節(jié)結核患者標本的抗酸染色法和FQ-PCR檢測敏感度比較

注a,b,c：抗酸染色法在不同性別、年齡和不同病變部位的敏感度比較；d,e,f：FQ-PCR技術在不同性別、年齡和不同病變部位的敏感度比較；g：抗酸染色法與FQ-PCR技術在脊柱結核中敏感度比較；h：抗酸染色法與FQ-PCR技術在外周骨關節(jié)結核中敏感度比較；i：抗酸染色法與FQ-PCR技術在所有骨關節(jié)結核中敏感度的比較

4. PCR-反向點雜交法檢測非結核分枝桿菌：對7例結核分枝桿菌DNA陰性而抗酸染色查到抗酸桿菌的患者進行非結核分枝桿菌菌種鑒定，檢測出戈登分枝桿菌感染1例。

討 論

傳統(tǒng)病理學診斷是通過大體和鏡下觀察病灶組織的病理形態(tài)學改變來獲得診斷結果。結核病具有特殊的病理學形態(tài)特點，如肉芽腫結構，包括類上皮細胞、朗格漢斯巨細胞(Langhans giant cell)，以及干酪樣壞死等，可與大多數其他感染性疾病及慢性炎癥進行鑒別診斷[7]。此外，在標本中找到抗酸桿菌也是結核病病理學診斷的重要依據。骨關節(jié)結核的診斷也是如此。隨著基因檢測技術的發(fā)展，分子生物學檢測技術也逐漸應用于病理學診斷中。聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)是通過特異擴增目標基因片段而獲得結果，具有敏感度高、可鑒別診斷結核病與非結核分枝桿菌病(non tuberculous mycobacteria，NTM)等優(yōu)勢，臨床多用于檢測痰液、血液、尿液、腦脊液和胸腔積液等液態(tài)標本中的結核分枝桿菌DNA[8]。近年來，FQ-PCR技術也逐漸應用于組織標本中結核分枝桿菌DNA的檢測。羅春英等[9]對174例肺、淋巴結、胸腹膜、肝、腎等部位具有肉芽腫性病變的石蠟包埋標本進行抗酸染色和結核分枝桿菌核酸熒光PCR檢測，發(fā)現結核分枝桿菌核酸熒光PCR法陽性率明顯高于抗酸染色法(30.5%，14.0%，P<0.05)。王旭洲等[10]比較了肺、淋巴結、皮膚等200例肉芽腫病變的FQ-PCR技術與傳統(tǒng)抗酸染色及金胺O染色方法在組織標本中的結核病陽性檢出率，發(fā)現PCR方法的陽性率明顯高于抗酸染色和金胺O染色的陽性率(51.5%、31.0%、40.5%，P<0.05)。而PCR技術在骨關節(jié)結核石蠟組織標本中的應用情況，國內外罕有報道。

本研究納入了我院骨科連續(xù)送檢、臨床診斷骨及關節(jié)結核、病理組織形態(tài)學具備肉芽腫性炎和壞死的骨關節(jié)病變93例，對其臨床特征觀察發(fā)現：93例骨關節(jié)結核患者80.6%在15～歲組，發(fā)病年齡仍以中青年人群為主[11-12]；男性感染者多于女性；脊柱為骨關節(jié)結核的最多發(fā)部位，占所有骨關節(jié)結核的1/2以上(53.8%)，其中又以腰椎最為多見，與文獻報道一致[12-13]。

本研究結果顯示，骨關節(jié)結核石蠟標本進行結核分枝桿菌FQ-PCR檢測較抗酸染色法有明顯優(yōu)勢。FQ-PCR技術的敏感度明顯高于抗酸染色法(82.8%、68.8%；χ2=5.659，P=0.021)，FQ-PCR法與抗酸染色法相比提高了陽性檢出率，在脊柱結核中提高20個百分點，在外周骨關節(jié)結核中提高了7個百分點。在所有93例患者中，兩種方法均為陽性者57例，占61.3%；其中有3例抗酸染色僅查到1株抗酸桿菌，表明兩種方法有較高的一致性；且當結核分枝桿菌菌量少，傳統(tǒng)顯微鏡下查找較困難時，FQ-PCR技術由于具有較高的敏感度，仍可檢測出結核分枝桿菌。此外，本研究中有20例FQ-PCR陽性患者，其抗酸染色為陰性，對照患者手術同時送檢至我院結核病參比實驗室的病灶膿液標本利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測技術(Xpert Mtb/RIF)檢測結果：12例為陽性，證實為結核分枝桿菌感染；2例未送檢；8例陰性。進一步核查8例Xpert檢測陰性患者的臨床治療情況，均對抗結核藥物治療反應良好。表明FQ-PCR檢測技術在骨關節(jié)結核的診斷中具有較高的敏感度。

NTM是分枝桿菌屬內除結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌。NTM除侵犯人體肺臟、淋巴結、皮膚和軟組織外，對骨骼、關節(jié)等組織器官也可致病[14]。NTM與結核分枝桿菌的菌體成分和抗原有其共同性，依靠病理組織形態(tài)和抗酸染色與結核病很難鑒別。本研究中有7例抗酸染色陽性患者，FQ-PCR檢測結果為陰性。筆者以PCR-反向點雜交法對7例標本進行分枝桿菌菌種鑒定，檢測出1例戈登分枝桿菌感染。對照患者手術同時膿液標本的Xpert檢測結果，發(fā)現除戈登分枝桿菌感染患者的Xpert結果為陰性外，其余6例Xpert結果為陽性，證實為結核分枝桿菌感染。此例NTM的發(fā)現，不僅為臨床治療提供了重要依據，也是對傳統(tǒng)結核病病理診斷新的挑戰(zhàn)。

病理組織形態(tài)仍是結核病診斷的金標準，在組織形態(tài)學符合結核病診斷的基礎上進行抗酸染色，為結核病的診斷提供病原學依據。而進一步以FQ-PCR技術檢測結核分枝桿菌特異基因序列是非常有必要的：一方面彌補了抗酸染色由于人為主觀因素造成的假陰性判斷，提高了結核分枝桿菌的檢出率；另一方面為是否進行非結核分枝桿菌檢測提供了重要提示，有助于區(qū)別非結核分枝桿菌感染造成的假陽性診斷。

綜上所述， FQ-PCR技術在骨關節(jié)結核石蠟包埋標本的病理學診斷和鑒別診斷中具有很好的應用價值。

志謝 感謝北京市結核病胸部腫瘤研究所流行病學研究室康萬里同志在本研究實驗數據分析及統(tǒng)計工作中給予的指導和幫助！

[1] Caws M，Thwaites G，Dunstan S，et al.The influence of host and bacterial genotype on the development of disseminated disease withMycobacteriumtuberculosis. PLoS Pathog，2008，4(3)：e1000034.

[2] 張登才，劉斌，張麗華，等.抗酸染色在結核病病理診斷中的價值.中國防癆雜志，2014，36(4)：274-278.

[3] Chandrasekhar B， Prayaga AK. Utility of concentration method by modified bleach technique for the demonstration of acid-fast bacilli in the diagnosis of tuberculous lymphadenopathy. J Cytol， 2012，29(3)：165-168.

[4] Wu RI，Mark EJ， Hunt JL. Staining for acid-fast bacilli in surgical pathology：practice patterns and variations.Hum Pathol，2012，43(11)：1845-1851.

[5] 葉豐，陳昱，何度，等.應用熒光定量聚合酶鏈反應對疑似結核組織的DNA分析.中華病理學雜志，2013，42(8)： 534-537.

[6] 牛寧奎，王自立，施建黨，等.熒光定量PCR對結核分枝桿菌DNA的檢測分析．白求恩軍醫(yī)學院學報，2012，10(3)：235-236．

[7] 張海青，車南穎.我國結核病病理學診斷和研究的現狀與展望.中國防癆雜志，2014，36(9)：793-797.

[8] 唐神結，高文. 臨床結核病學. 北京：人民衛(wèi)生出版社，2011.

[9] 羅春英，王建東，王璇，等.熒光定量聚合酶鏈反應檢測石蠟包埋組織結核桿菌的應用價值.中華病理學雜志，2012，41(8)：562-563.

[10] 王旭洲，謝飛來，鄭智勇.熒光定量PCR檢測結核/非結核分枝桿菌在肉芽腫病理診斷中的應用.臨床與實驗病理學雜志，2013，29(8)：884-887，891.

[11] 秦世炳. 我國骨關節(jié)結核診治的回顧與展望.中國防癆雜志，2014，36(9)：788-792.

[12] Chen ST， Zhao LP， Dong WJ， et al. The Clinical Features and Bacteriological Characterizations of Bone and Joint Tuberculosis in China. Sci Rep，2015，5： 11084.

[13] 吳啟秋.脊椎結核病診斷與治療的幾個問題.中華結核和呼吸雜志，2008，31(2)：85-87.

[14] 中華醫(yī)學會結核病學分會，《中華結核和呼吸雜志》編輯委員會.非結核分枝桿菌病診斷與治療專家共識.中華結核和呼吸雜志，2012，35(8)：572-580.

(本文編輯：范永德)

Application value of fluorescence quantitative PCR technology in detection of paraffin-embedded specimens from bone and joint tuberculosis

MUJing,ZHAODan,LIUZi-chen,CHENan-ying,ZHANGHai-qing.

DepartmentofPathology,BeijingChestHospital，CapitalMedicalUniversity；BeijingTuberculosisandThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

ZHANGHai-qing,Email:zhqing56@sina.com

Objective To explore the value of fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) technique in the diagnosis and differential diagnosis of paraffin-embedded specimens from bone and joint tuberculosis (BJTB). Methods Ninety three BJTB specimens and 12 specimens of bone neoplasm were collected during October 2014 to April 2015 in Beijing Chest Hospital, Capital Medical University. Comparison of FQ-PCR technique and conventional acid-fast staining technique in the diagnosis of tuberculosis in sensitivity and specificity by chi square test. To observe the correlation between the different sits and two detection positive rate, and the non tuberculosis mycobacterium was check out by PCR reverse dot blot hybridization in 7 specimens which had negative mycobacterium DNA and acid-fast staining positive. Results BJTB tissues in FQ-PCR detection ofMycobacteriumtuberculosiswere positive in 77 patients, positive rate of 82.8%; 64 cases were acid fast staining positive, positive rate of 68.8%. The sensitivity of FQ-PCR method was significantly higher than that of acid-fast staining (χ2=5.659，P=0.021). In different on set location FQ-PCR sensitivity were higher than that of acid fast staining: in the spine, FQ-PCR technique and acid fast staining positive rate was 84.0% (42/50) and 64.0% (32/50) (χ2=0.009，P=0.609) respectively; in the peripheral BJTB, FQ-PCR and acid fast staining positive rate were 81.4% (35/43) and 74.4% (32/43) (χ2=12.609，P=0.002) respectively.A strain of mycobacterium Gordon was checked out by PCR-reverse dot blot hybridization. Conclusion FQ-PCR technique improved the positive detection rate ofMycobacteriumtuberculosissignificantly compared to acid-fast staining and provide important tips for testing non tuberculosis mycobacterium. The FQ-PCR technology has good application value in the detection of paraffin-embedded specimens from BJTB.

Mycobacteriatuberculosis; Tuberculosis, Bone and Joint; Polymerase chain reaction; Acid-fast staining

10.3969/j.issn.1000-6621.2016.04.009

首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項基金(2014-4-2161)

101149 首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院 北京市結核病胸部腫瘤研究所病理科

張海青，Email：zhqing56@sina.com

2016-01-12)