茵梔黃注射液抗膽汁淤積藥效成分的篩選及其作用機(jī)制研究お

譚楨 劉愛明 羅敏 郭賓

[摘要]篩選茵梔黃注射液中的主要藥效成分，評價其調(diào)節(jié)膽汁酸代謝相關(guān)基因，發(fā)揮護(hù)肝作用的機(jī)制。選用雄性健康ICR小鼠30只，分為6組：正常對照組、模型對照組、綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內(nèi)酯組。檢測肝功能、肝組織病理學(xué)變化以及膽汁酸代謝相關(guān)基因的表達(dá)。綠原酸組小鼠血清ALT，AST，ALP，TBA水平分別為（1589±253），（1832±256），（2638±987） U·L-1，（4063±767） μmol·L-1，梔子苷組小鼠分別為（2054±236），（2428±519），（3509±503）U·L-1，（4286±711） μmol·L-1，均低于模型對照組（5952±1094），（12837±1797），（16952±962） U·L-1，（13250±3300） μmol·L-1。肝組織病理學(xué)分析顯示，綠原酸組、梔子苷組小鼠肝細(xì)胞的壞死、炎性細(xì)胞浸潤程度與模型對照組比較均顯著減輕。熒光定量QPCR檢測顯示，給予綠原酸、梔子苷治療后，膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA的變化較模型對照組均發(fā)生了代償性的逆轉(zhuǎn)。茵梔黃注射液中的綠原酸和梔子苷能有效改善膽汁淤積、肝功能及肝臟病理性損傷，并逆轉(zhuǎn)ANIT引起的膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA變化，從而起到肝保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]茵梔黃注射液；綠原酸；梔子苷；膽汁酸代謝；肝內(nèi)膽汁淤積

茵梔黃注射液由茵陳、梔子、金銀花、黃芩等4 味中藥組成，具有清熱、解毒、利濕、退黃疸和降低轉(zhuǎn)氨酶的作用[14]，臨床廣泛用于治療膽汁淤積。茵梔黃注射液作為復(fù)方制劑，由于其配伍成分組成復(fù)雜，其具體藥效成分及藥理學(xué)機(jī)制尚不清楚。前期，本課題組采用LCMSITTOF分析技術(shù)，歸屬推導(dǎo)了24種成分，初步鑒定了茵梔黃注射液中的化學(xué)成分黃芩苷、綠原酸、梔子苷、黃芩素、漢黃芩苷、梔子酸、新綠原酸、咖啡酸、濱蒿內(nèi)酯等[56]。其中，黃芩苷、綠原酸、梔子苷是含量較多的組分， 本研究將對這幾種主要成分的藥效活性進(jìn)行篩選。

近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對膽汁淤積疾病的分子生物學(xué)相關(guān)機(jī)制的研究也進(jìn)一步深入?，F(xiàn)已研究證實，分布于肝細(xì)胞膜血管側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體 Na+?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)多肽（Ntcp）、有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽2（Oatp2）及膽管側(cè)膜轉(zhuǎn)運(yùn)體多藥耐藥相關(guān)蛋白2（Mrp2）、膽鹽輸出泵（Bsep）對膽酸鹽及膽紅素的轉(zhuǎn)運(yùn)具有重要作用[79]。因此，對膽汁酸代謝相關(guān)酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體的研究成為治療膽汁淤積的新方向。

綠原酸是茵陳的主要成分，有促進(jìn)膽汁分泌和清熱解毒等功效。研究發(fā)現(xiàn)，綠原酸對CCl4引起的肝毒性有明顯的保護(hù)作用[10]。梔子苷作為梔子的主要成分，對酒精引起的急性肝損傷有一定保護(hù)作用[11]。研究報道黃芩苷固體分散體對小鼠D氨基半乳糖急性肝損傷有一定保護(hù)作用[12]。濱蒿內(nèi)酯作為茵梔黃中的成分之一，能夠通過激動CAR受體提高膽紅素清除率[13]。本實驗通過ANIT誘導(dǎo)肝內(nèi)膽汁淤積小鼠動物模型，研究茵梔黃中的主要成分綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內(nèi)酯等對ANIT誘導(dǎo)膽汁淤積的治療作用以及對膽汁酸代謝相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)的影響，以期從分子水平探討茵梔黃中主要成分的作用機(jī)制及靶點(diǎn)，為基于傳統(tǒng)中藥天然活性成分的發(fā)展提供理論基礎(chǔ)。

1材料

α異硫氰酸萘酯（ANIT，Sigma公司）；綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內(nèi)酯（中國食品藥品檢定研究院）；定量PCR試劑（SYBR Green PCR Master Mix，Roche公司）；定量PCR儀（LightCycle 480，Roche公司）；肝功能有關(guān)試劑盒（長沙永和陽光科技有限公司）。

雄性健康小鼠30只，體重（20±5）g，寧波大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號SYXK20130191。所有動物飼養(yǎng)于寧波大學(xué)實驗動物房，室溫恒定，經(jīng)過適應(yīng)性喂養(yǎng)，飲食、飲水正常者，無不良反應(yīng)，即納入實驗。

2方法

21動物實驗

雄性小鼠30只，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內(nèi)酯組，每組各5只。綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內(nèi)酯組分別灌胃綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內(nèi)酯（50 mg·kg-1·d-1，其中，綠原酸、黃芩苷、濱蒿內(nèi)酯溶解于玉米油中，梔子苷溶解于生理鹽水中），共計5 d。第4天，模型對照組、綠原酸組、梔子苷組、黃芩苷組、濱蒿內(nèi)酯組分別采用ANIT灌胃1次（75 mg·kg-1），誘發(fā)小鼠急性肝內(nèi)膽汁淤積病變。同時各組繼續(xù)分別灌胃綠原酸、梔子苷、黃芩苷、濱蒿內(nèi)酯，共計5 d，ANIT灌胃48 h后所有小鼠處死。

22標(biāo)本采集及保存

小鼠于眼眶采血后，15 mL離心管收集血液，并脫頸處死。將其固定在手術(shù)臺上，剪去腹部鼠毛，將腹部皮膚及皮下組織一并剪開，充分暴露肝臟，取新鮮肝組織，其中肝左葉至于10%中性福爾馬林緩沖溶液中固定，后期進(jìn)行病理學(xué)檢查，其余部分標(biāo)記后迅速置于放入干冰中速凍保存，后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱長期保存。

23血清生化指標(biāo)檢測

小鼠血液于2 000 r·min-1 離心5 min后取血清，生化分析儀測定血清中 AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、ALP（堿性磷酸酶）、TBA（總膽汁酸）。

24肝臟病理切片

小鼠肝臟10%中性福爾馬林緩沖溶液固定24 h后，脫水，石蠟包埋。常規(guī)切片，HE染色，顯微鏡觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化。

25膽汁酸代謝相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平測定

251RNA提取肝臟組織中加入Triol，勻漿，分層，濃縮，沉淀，洗滌，溶解，提取總RNA，Nano Drop 2000測定吸光度A值，做總RNA的純度檢測。

252逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取1 μg總RNA，加入MMLV逆轉(zhuǎn)錄試劑，普通PCR儀中反應(yīng)合成模板DNA，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

253熒光定量RTPCR測定模板cDNA 1 μL，Master Mix 5 μL，上游引物02 μL，下游引物02 μL，DEPC水36 μL，組成10 μL的體系，熒光定量PCR儀中變性、退火、延伸。反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量PCR儀自動分析并計算結(jié)果。其中， 實驗中所設(shè)計的引物序列見表1， 所有的引物序列均來源于引物數(shù)據(jù)庫（http：//mouseprimerdepotncinihgov/）。

26數(shù)據(jù)統(tǒng)計

采用SPSS 120軟件、Microsoft Excel 2003和Sigma Plot 110對生化分析結(jié)果及QPCR測定膽汁酸代謝相關(guān)基因結(jié)果進(jìn)行分析，P<005表明各組數(shù)據(jù)存在差異，結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

31小鼠血清肝功能檢測

與正常對照組相比，陽性對照組ALT和AST明顯升高（P<0001），顯示其存在肝細(xì)胞損傷，同時，ALP和TBA也顯著增加（P<0001）。而與陽性對照組比較，綠原酸組與梔子苷組ALT，AST，ALP和TBA降低，黃芩苷組和濱蒿內(nèi)酯組的ALP，ALT，AST與陽性對照組之間無明顯差異，提示綠原酸和梔子苷能在一定程度上抑制ANIT誘導(dǎo)的肝毒性，對肝內(nèi)膽汁淤積有明顯的肝保護(hù)作用，而黃芩苷和濱蒿內(nèi)酯血生化分析結(jié)果顯示沒有明顯的保護(hù)作用，見圖1。

32肝臟組織病理學(xué)變化

正常組，肝臟外觀輪廓、顏色正常；肝組織病理觀察，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰、肝細(xì)胞核大而圓，核膜清晰，胞漿豐富、淡染，見圖2A。ANIT組（模型組），肝臟外觀明顯腫脹，有大片狀灰白色出現(xiàn)；肝組織病理觀察，有大面積病灶可見，肝小葉輪廓不清，大量炎細(xì)胞浸潤，壞死明顯，見圖2B。黃芩苷組和濱蒿內(nèi)酯組，仍有大面積病灶可見，病變癥狀未得到減輕，無明顯肝保護(hù)作用，見圖2C，2D。綠原酸及梔子苷組，中央靜脈及肝竇輕度充血，點(diǎn)、灶狀壞死散在分布，少許炎細(xì)胞浸潤，壞死病灶明顯減少，見圖2E，2F，2G，2H。

33膽汁酸合成相關(guān)基因表達(dá)的影響

本實驗中以熒光定量QPCR檢測正常對照組、模型對照組、綠原酸組和梔子苷組小鼠肝臟組織膽汁酸合成相關(guān)基因mRNA的表達(dá)差異。模型對照組小鼠肝臟膽汁酸合成相關(guān)酶Cyp7a1，Cyp8b1 mRNA表達(dá)與正常對照組相比均顯著降低，綠原酸和梔子苷組中膽汁酸合成酶的mRNA較模型對照組表達(dá)被逆轉(zhuǎn)至正常水平，見圖3。提示綠原酸和梔子苷可能通過改善ANIT誘導(dǎo)的膽汁酸合成酶mRNA的變化從而發(fā)揮肝保護(hù)作用。

34膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因表達(dá)的影響

肝膽細(xì)胞膜相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白有機(jī)陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（Oatp）和鈉離子牛磺膽酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)多肽（NTCP）的mRNA在模型對照組、綠原酸組和梔子苷組中相比于正常對照組均表達(dá)升高，模型對照組中，多藥耐藥

相關(guān)蛋白Mrp2，Mrp3，Mrp4和鈉依賴性膽鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體Ostb的mRNA表達(dá)較正常對照組升高，給予綠原酸、梔子苷治療后，均出現(xiàn)降低，見圖4。說明綠原酸和梔子苷對Mrp2，Mrp3，Mrp4以及Ostb mRNA表達(dá)水平的逆轉(zhuǎn)作用可能是繼發(fā)于ANIT的毒性反應(yīng)，從而發(fā)揮肝保護(hù)作用。綜上可知，膽汁酸體內(nèi)代謝是一個復(fù)雜的過程，包括膽汁酸的合成、重攝取及排泄過程，本實驗中膽汁酸代謝過程中相關(guān)轉(zhuǎn)運(yùn)體的變化情況見圖5，說明綠原酸與梔子苷在一定程度上抑制了ANIT對轉(zhuǎn)運(yùn)體的改變，從而抑制ANIT所誘導(dǎo)的肝毒性，起到肝臟保護(hù)作用。

4討論

ANIT是一種化學(xué)物質(zhì)，自1952年一位美國專家首次用它復(fù)制出肝內(nèi)膽汁淤積模型以來，被廣泛應(yīng)用于肝內(nèi)膽汁淤積模型的復(fù)制。ANIT作為一種間接肝毒劑，主要損害肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，引起肝

內(nèi)膽管增生及小葉間膽管周圍炎癥，從而造成膽管阻塞，形成明顯的膽汁淤積，并伴有以點(diǎn)狀壞死為主的肝實質(zhì)細(xì)胞損害，產(chǎn)生膽汁淤積性黃疸，出現(xiàn)高膽紅素血癥和膽汁分泌降低。同時還引起膜脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，致使肝細(xì)胞變性壞死，胞內(nèi)ALT大量溢入血流。該模型復(fù)制簡單易行，重復(fù)性好，是篩選和研究保肝藥物及利膽藥的理想實驗動物模型[14]。

膽汁酸的代謝包括膽汁酸合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和排泄。膽汁酸的原料為膽固醇，經(jīng)過一系列的酶促反應(yīng)，形成膽汁酸。膽汁酸有2種合成途徑[15]，經(jīng)典途徑

是膽汁酸合成的主要途徑，經(jīng)典途徑由膽固醇7α羥化酶（cholesterol 7αhydroxylase，CYP7A1）啟動，CYP7A1是此反應(yīng)的限速酶。膽汁酸合成的另一個途徑稱為替代途徑，由甾醇27α羥化酶（CYP27A1）和甾醇12α羥化酶（CYP7B1）啟動，最終生成鵝脫氧膽酸。研究報道稱ANIT干預(yù)后會誘導(dǎo)SHP mRNA表達(dá)的增加，SHP與LRH1形成的二聚體會抑制Cyp7α1，Cyp8b1的表達(dá)[1618]。本研究中，ANIT誘導(dǎo)肝內(nèi)膽汁淤積后，膽汁酸合成酶相關(guān)基因表達(dá)均降低，給予綠原酸和梔子苷治療后表達(dá)恢復(fù)到正常水平。同樣，ANIT誘導(dǎo)后，膽汁酸重攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatps和Ntcp mRNA表達(dá)降低，綠原酸和梔子苷治療后恢復(fù)正常。Chisholm的研究指出HNF1α在調(diào)節(jié)重攝取轉(zhuǎn)運(yùn)體中發(fā)揮了重要作用，ANIT降低HNF1α以及轉(zhuǎn)運(yùn)體Oatps和Ntcp的mRNA表達(dá)[19]。以上研究說明，綠原酸和梔子苷可以從一定程度上代償性逆轉(zhuǎn)ANIT所引起的膽汁酸合成酶的降低。

在ANIT所誘導(dǎo)的膽汁淤積模型中，有研究發(fā)現(xiàn)大黃素對ANIT所引起的膽汁淤積型肝炎有好的保護(hù)作用，其中，大黃素主要通過抑制促炎因子、氧化應(yīng)激損傷等發(fā)揮作用[20]。中藥制劑丹寧片也能通過改善氧化應(yīng)激以及抑制中性粒細(xì)胞浸潤等途徑起到肝保護(hù)作用[21]。在脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的C56/BL6小鼠急性肝損傷模型中，給藥50 mg·kg-1綠原酸后，肝臟顏色由黃色恢復(fù)為正常的淡紅色，ALT，AST水平顯著降低，且通過預(yù)先給藥綠原酸，TLR4，TNFα，NFκB等炎癥基因mRNA表達(dá)水平有所降低，提示綠原酸可能通過抗炎機(jī)制對LPS誘導(dǎo)的肝毒性起到保護(hù)作用[22]。在梔子苷保護(hù)酒精性肝損傷的研究中，抗氧化酶GSH，GST，GPx，CuZnSOD和CAT的活性上調(diào)，氧化應(yīng)激肝損傷明顯改善[11]。本研究中，病理學(xué)分析顯示模型對照組中小鼠肝臟有大面積病灶可見，肝小葉輪廓不清，大量炎細(xì)胞浸潤，綠原酸和梔子苷組中炎性細(xì)胞浸潤明顯減少。因此，綠原酸和梔子苷是否通過抑制炎癥通路從而實現(xiàn)對ANIT誘導(dǎo)的膽汁淤積和急性肝損傷起到肝臟保護(hù)作用，有必要對其機(jī)制進(jìn)行更加深入的了解，為天然藥物的臨床應(yīng)用提供科學(xué)合理的理論依據(jù)。

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[責(zé)任編輯曹陽陽]