瓊脂凝膠微球純化葛根素的工藝研究お

呂述權(quán) 石國宗 孫麗 許遠杰 王富

[摘要]葛根素是葛根中黃酮類物質(zhì)主要活性成分，該研究以葛根素粗品為原料，利用廉價易得的瓊脂制備瓊脂凝膠微球鍵合β環(huán)糊精分離介質(zhì)（AGβCD），結(jié)合AB8大孔樹脂進行前處理，以高回收率分離純化得到高純度的葛根素。以葛根素純度和回收率以及相關(guān)雜質(zhì)的色譜純度為考察指標，對4種不同性質(zhì)的大孔樹脂ADS7（強極性）、ADS17（中極性）、ADS21（極性）和AB8（弱極性）進行分離效果篩選以及工藝優(yōu)化，并對AGβCD純化工藝優(yōu)化和驗證。結(jié)果表明，優(yōu)選弱極性樹脂AB8作為葛根素粗品的前處理樹脂效果最佳，通過8%乙醇洗脫15 BV后，葛根素純度為8768%的回收率達到8966%；通過瓊脂凝膠微球鍵合β環(huán)糊精分離介質(zhì)進行純化，流動相15%乙醇，承載量（上樣量與柱體積之比）133 g·L-1，上樣濃度8 g·L-1，流速1 mL·min-1時，葛根素純度高于95%的回收率達到97%以上。

[關(guān)鍵詞]葛根素；AB8樹脂；瓊脂凝膠微球；β環(huán)糊精

葛根是一種傳統(tǒng)的中藥材，因具有較高的食用和藥用價值而被列入“藥食同源植物”。葛根中的黃酮類物質(zhì)為主要的藥用活性成分，其中葛根素含量最高，并具有多種藥用活性如改善心肌細胞膜及心律失常，抗心肌纖維化損傷、抗心血管疾病、抗糖尿病[1]、神經(jīng)保護[2]、抗阿爾茲海默癥[3]、抗帕金森病[4]、防治骨質(zhì)疏松癥[5]等作用，因此受到更為廣泛的關(guān)注與研究。

葛根中化學(xué)成分復(fù)雜多樣，除了葛根素外還有3′羥基葛根素，3′甲氧基葛根素等多種黃酮類化合物，由于結(jié)構(gòu)類似，理化性質(zhì)相近，以較高的回收率純化制備得到高純度的葛根素較為困難。目前分離純化葛根素較為傳統(tǒng)的工藝有溶劑萃取[6]，氧化鋁和硅膠柱色譜[7]和大孔樹脂分離[89]，但上述方法單獨應(yīng)用難以取得較高純度亦或是回收率較低。利用超臨界流體萃取[10]，快速離心分配色譜（FCPC）[11]，雙水相萃取和高速逆流色譜（HSCCC）[12]等分離技術(shù)純化葛根素，雖能取得較高純度和回收率，但體系復(fù)雜，設(shè)備要求高，有機溶劑消耗大，對環(huán)保和安全生產(chǎn)要求過高，導(dǎo)致成本過高等諸多缺陷。

β環(huán)糊精（βcyclodextrin）是由7個β吡喃葡萄糖單元通過α1，4糖苷鍵連接形成的“外親水，內(nèi)疏水”的環(huán)狀空腔結(jié)構(gòu)，通過疏水作用、氫鍵和偶極等多種作用力形成超分子復(fù)合物[13]，根據(jù)上述特性，多種β環(huán)糊精固定相合成用于天然活性物質(zhì)的分離純化。Lai等利用硅膠基質(zhì)鍵合β環(huán)糊精純化表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）[14]，譚天偉研究團隊先后制備了瓊脂糖凝膠微球[1517]，苯乙烯聚合物[18]，甲基丙烯酸甲酯聚合物[19]，丙烯酸酯聚合物[20]鍵合β環(huán)糊精固定相先后用來純化EGCG、葛根素、大豆苷等黃酮類物質(zhì)，取得較為理想的效果。

本文通過廉價易得的瓊脂為原料，通過乳化交聯(lián)制備瓊脂凝膠微球的基質(zhì)，其結(jié)構(gòu)上眾多的羥基易于鍵合β環(huán)糊精，鍵合后的微球結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，可反復(fù)使用而分離純化性能保持不下降。結(jié)合大孔樹脂初步分離，瓊脂微球鍵合β環(huán)糊精分離介質(zhì)純化葛根素，整個工藝過程簡易可行，純化體系簡單，無有毒溶劑，能夠穩(wěn)定得到高純度的葛根素的前提下取得較高的回收率。

1材料

Waters e2695高效液相色譜儀（美國waters公司），2998光電二極管陣列檢測器（PDA，美國waters公司），Waters C18柱（美國waters公司），色譜柱（上海華美實驗儀器廠），蠕動泵（常州科健蠕動泵廠），制備型高效液相色譜儀LC3000（包括二元泵，紫外檢測器，混合器，北京創(chuàng)新通恒科技有限公司），AUW120D半微量分析天平（日本島津公司），大孔吸附樹脂AB8，ADS7，ADS17，ADS21（天津南開和成科技有限公司）。

葛根素（PR）對照品（純度≥98%，西安沃森生物科技有限公司），3′羥基葛根素（3HP）和3′甲氧基葛根素（3MP）對照品為反相制備柱自制，色譜純度達到99%，葛根素粗品（批號20141221，西安沃森生物科技有限公司），甲醇（色譜純，Merck，德國），檸檬酸（AR，天津光復(fù)精細化工研究所），無水乙醇（AR，西隴化工股份有限公司），瓊脂粉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），β環(huán)糊精（國藥集團化學(xué)試劑有限公司），其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

21瓊脂凝膠微球制備

方法參考文獻[20]進行修改。①瓊脂凝膠裸球的制備：取100 g瓊脂粉，加入1 L純化水于100 ℃條件下攪拌溶解4 h，將瓊脂水溶液趁熱緩慢加入到1 L的乳化劑（環(huán)己烷山梨醇酐三油酸酯4∶1，75 ℃，200 r·min-1）中，加入后調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速為450 r·min-1，攪拌30 min，待冷卻至室溫后抽濾，用無水乙醇和純化水交替洗滌去除殘余乳化劑后得到瓊脂凝膠裸球；②裸球交聯(lián)：取瓊脂凝膠裸球100 g，加100 mL純化水，35 ℃水浴，200 r·min-1攪拌，待裸球分散均勻后加入15 g Na2SO4，溶解30 min，繼續(xù)加入50% NaOH 4 mL和NaBH412 g，以01 mL·min-1的流量加入25 mL環(huán)氧氯丙烷，并同時以0.2 mL·min-1的流量加入50 mL質(zhì)量分數(shù)為50% NaOH，之后增加反應(yīng)溫度至50 ℃繼續(xù)攪拌18 h，冷卻至室溫后用乙酸調(diào)節(jié)pH 50～60后抽濾，用乙醇和純化水洗滌后得到交聯(lián)的瓊脂凝膠微球；③鍵合β環(huán)糊精：稱取5 g β環(huán)糊精加入100 mL純化水中于35 ℃水浴中以200 r·min-1的轉(zhuǎn)速攪拌1 h后，加入100 g交聯(lián)的瓊脂凝膠微球攪拌分散均勻，后續(xù)同步驟②，得到鍵合β環(huán)糊精的瓊脂凝膠微球（簡稱AGβCD）。

22葛根素含量測定

221色譜條件參考2010年版《中國藥典》標準[22]，Waters C18色譜柱（46 mm×250 mm，5 μm），流動相A（01%檸檬酸水溶液）B（甲醇），梯度洗脫（0～15 min，25% B；15～30 min，45% B；30～35 min，45% B；35～37 min，75% B；37～45 min，25% B），進樣量10 μL，流速1 mL·min-1，柱溫25 ℃，檢測波長254 nm。對照品和葛根素粗品色譜圖見圖1。

222對照品配制精確稱取100 mg葛根素對照品至50 mL量瓶，分別加甲醇溶解完全后并定容至刻度，為葛根素對照品溶液。

223供試品配制精確稱取葛根素粗品50 mg至25 mL量瓶，分別加甲醇溶解完全后并定容至刻度后搖勻，過022 μm的微孔濾膜，濾液為葛根素供試品溶液。

224線性范圍考察精密量取葛根素對照品溶液各8，6，4，2，1，05 mL于10 mL量瓶， 加甲醇定容到刻度線后搖勻，按照221中的色譜條件進樣，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=463×107X+658×104，r=0999 8，線性范圍01～16 g·L-1。

225精密度試驗取對照品溶液，按照色譜條件221色譜條件重復(fù)進樣6次，記錄色譜峰面積，其RSD為026%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

226穩(wěn)定性試驗取同一供試品溶液，分別放置0，2，4，8，12，24 h后，按照221色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，計算其RSD為13%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h是穩(wěn)定的。

227重復(fù)性試驗精密稱取葛根素粗品5份，平行制備同樣供試樣品溶液5份，按照221色譜條件測定，記錄葛根素峰面積，計算其RSD為081%，表明重復(fù)性良好。

228加樣回收率試驗精密稱取50 mg葛根素粗品5份，分別加入葛根素對照品溶液3 mL后25 mL量瓶定容至刻度線，按照221色譜條件測定計算，其平均加樣回收率為1015%，RSD為12%。

23大孔樹脂對葛根素分離效果的篩選

稱取50 g葛根素粗品（約含50%葛根素），加入500 mL純化水溶解過濾后上柱，通過4種不同性質(zhì)的大孔樹脂ADS7（強極性），ADS17（中極性），ADS21（極性），AB8（弱極性）對葛根素粗品進行分離，色譜柱規(guī)格為26 cm×40 cm，柱體積（BV）為（150±5） mL，乙醇梯度洗脫，洗脫順序為：純化水1 BV，10%乙醇2 BV，20%乙醇2 BV，30%乙醇2 BV，40%乙醇2 BV，上柱和洗脫流速為2 BV·h-1，洗脫液按照每BV收集1瓶，通過HPLC測定，檢測其含量和純度。通過葛根素的純度和回收率以及2種主要雜質(zhì)3′羥基葛根素和3′甲氧基葛根素的色譜純度來衡量4種大孔樹脂的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葛根素純度≥80%以上的回收率分別為9129%（AB8），8181%（ADS7），6819%（ADS17），7313%（ADS21），表明AB8分離葛根素效果最佳，并且葛根素與其他2種主要雜質(zhì) 3′羥基葛根素和3′甲氧基葛根素分離趨勢較為明顯，容易富集于低濃度乙醇洗脫劑，解析率高，利于后續(xù)純化，見圖2。

24AB8大孔樹脂分離葛根素工藝優(yōu)化

根據(jù)樹脂篩選實驗結(jié)果表明，AB8分離葛根素的趨勢是3′羥基葛根素較為容易富集于10%乙醇，而 3′甲氧基葛根素富集于20%，30%乙醇。因此優(yōu)化的工藝方向是增加低濃度乙醇洗脫體積，縮短3′羥基葛根素的保留時間，而增加3′甲氧基葛根素的保留時間，從而增加三者之間的分離度，利于后續(xù)葛根素純度和回收率的提高。

在其他因素相同的條件下，按照優(yōu)化方案1通過增加2 BV的8%乙醇洗脫梯度，即按照預(yù)洗1 BV純化水，8%，10%，20%，30%，40%，50% 乙醇各依次洗脫2 BV，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3′羥基葛根素與3′甲氧基葛根素分離的趨勢更明顯，但由于葛根素主要富集于2種雜質(zhì)的交叉區(qū)間，造成回收率偏低，純度80%以上的收率僅為6563%，見圖3。

繼續(xù)優(yōu)化工藝，按優(yōu)化方案2通過預(yù)洗1 BV純化水后，8%乙醇連續(xù)洗脫15 BV后，能將葛根素洗脫下來，并且3′羥基葛根素與3′甲氧基葛根素分離趨勢更加顯著，由于3′羥基葛根素所占比例少，

aAB8；bADS7；cADS17；dADS21（0 BV為水洗液，后續(xù)依次為乙醇梯度洗脫液，圖3同）。

合并3～13 BV洗脫液，見圖4，合并后濃縮凍干，待AGβCD微球進一步純化，該部分的純度為8812%，回收率為9048%，見圖3。

25AGβCD純化葛根素研究

葛根素粗品主要的2種雜質(zhì)為3′羥基葛根素和3′甲氧基葛根素，由于目標產(chǎn)物葛根素與2種雜質(zhì)的理化性質(zhì)相似，純化過程中葛根素易與其他2種雜質(zhì)交叉洗脫下來。

根據(jù)研究結(jié)果可知，AGβCD微球純化葛根素的分離趨勢與AB8大孔樹脂相反，3′甲氧基葛根

素最先洗脫下來，其次是目標產(chǎn)物葛根素，保留時間較長的是3′羥基葛根素，見圖5。圖5是根據(jù)后續(xù)最佳優(yōu)化工藝參數(shù)采集的分離效果圖，柱體積（30±05） mL時，上樣量為40 mg葛根素粗品，進樣體積為5 mL，流動相為15%乙醇，流速1 mL·min-1，其純化結(jié)果表明葛根素純度92%以上的回收率為7554%。

26AGβCD分離純化葛根素工藝優(yōu)化

以AB8處理后濃縮凍干粉通過AGβCD進行純化，通過流動相，承載量，流速和上樣濃度4個要素依次進行純化工藝優(yōu)化，柱體積為（30±05） mL（色譜柱型號10 mm×40 cm），紫外檢測器監(jiān)測波長254 nm，按色譜峰順序收集，峰寬較大時，按照10 mL收集1次，通過HPLC分析檢測含量和色譜純度。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果，合并葛根素純度≥95%的流分，見圖6。

葛根素純度≥95%時各個優(yōu)化組合時的回收率見表1。結(jié)果表明，133 g·L-1承載量（葛根素上樣量與微球體積之比），流動相為15%乙醇，上柱和洗脫流速為1 mL·min-1，上柱樣品質(zhì)量濃度8 g·L-1時純化效果最佳，葛根素純度≥95%的回收率為9765%。

27驗證試驗

通過AB8樹脂8%乙醇連續(xù)洗脫15 BV后，連續(xù)3批進行驗證，3～13 BV合并液檢測其色譜純度和計算回收率；3批合并液濃縮凍干后樣品分別用AGβCD微球以最佳的工藝參數(shù)進行純化，計算其純度≥95%以上的回收率，結(jié)果見表2，圖7。

通過連續(xù)3批的驗證實驗結(jié)果表明，AB8大孔樹脂分離葛根素平均純度為8768%，RSD為067%時，回收率平均值為8966%，RSD為10%；AGβCD微球純化葛根素純度≥95%以上的回收率的平均值為9735%，RSD為0093%。RSD均小于5%，因此該分離純化工藝是可靠的。

3結(jié)果與討論

通過4種不同性質(zhì)的大孔樹脂篩選，優(yōu)選弱極性的AB8樹脂作為前處理樹脂對葛根素粗品進行

分離，利用葛根素粗品中3′羥基葛根素（疏水常數(shù)為-03）與3′甲氧基葛根素（疏水常數(shù)為0）和葛根素（疏水常數(shù)為0）在疏水性上的微小差別，而在

弱極性樹脂上的吸附保留能力上差別更加凸顯的作用，即3′羥基葛根素保留能力小于葛根素和3′甲氧基葛根素，通過洗脫劑優(yōu)化，從而達到初步分離的目的，并確定8%乙醇作為最佳洗脫劑，連續(xù)洗脫15 BV后，合并3～13 BV洗脫液，葛根素純度87%以上的回收率為88%以上。利用AB8前處理樣品后，AGβCD通過4個關(guān)鍵工藝參數(shù)進行優(yōu)化，確定承載量133 g·L-1，樣品質(zhì)量濃度為8 g·L-1，流動相為15%乙醇，流速為1 mL·min-1時純化效果最佳，3′甲氧基葛根素能夠與葛根素最大限度的分離，葛根素≥95%以上的回收率達到9735%。整個分離純化工藝體無復(fù)雜溶劑體系，所用溶劑毒性低，分離純化設(shè)備簡單，易于產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)化。

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[責任編輯孔晶晶]