樺褐孔菌發(fā)酵糙米混合物及產(chǎn)物活性成分分析

王艷梅，郭洪玲，王艷玲，王雅珍（黑龍江工業(yè)學(xué)院環(huán)境工程系，黑龍江雞西158100）

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樺褐孔菌發(fā)酵糙米混合物及產(chǎn)物活性成分分析

王艷梅，郭洪玲，王艷玲，王雅珍
（黑龍江工業(yè)學(xué)院環(huán)境工程系，黑龍江雞西158100）

摘要：以糙米、玉米和紅小豆組成混合物為基質(zhì)，用樺褐孔菌固體發(fā)酵并對(duì)產(chǎn)物中總?cè)?、多酚和多糖進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：玉米、紅小豆和糙米等混合物經(jīng)粉碎過(guò)10目篩后的基質(zhì)發(fā)酵效果最好，總?cè)坪投喾雍糠謩e達(dá)到最大值

6.27mg/g和22.48 mg/g，發(fā)酵效果好導(dǎo)致多糖消耗大，此時(shí)基質(zhì)中多糖含量最低為10.57 mg/g；玉米相比糙米更能促進(jìn)樺褐孔菌生長(zhǎng)。

關(guān)鍵詞：樺褐孔菌；固體發(fā)酵；發(fā)酵基質(zhì)；活性成分

樺褐孔菌（Inonotus obliquu）是真菌門擔(dān)子菌亞門多孔菌科一種藥用真菌，主要分布北緯45°～50°的北歐、俄羅斯、日本及中國(guó)黑龍江省和吉林省[1]。自16世紀(jì)以來(lái)，東歐、俄羅斯等民間就廣泛利用Chaga（白樺茸：樺褐孔菌中文學(xué)名）防治各種疑難雜癥，如各種癌癥（胃癌、肝癌、腸癌、各種消化器官的癌?。?、心臟病、糖尿病[2]；現(xiàn)代藥理學(xué)試驗(yàn)表明，樺褐孔菌具有抗腫瘤、抗炎、抗病毒等廣泛的藥理作用[3]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，隨著對(duì)藥用真菌多糖等活性物質(zhì)研究的深入，真菌的營(yíng)養(yǎng)學(xué)價(jià)值和藥用價(jià)值越來(lái)越引起人們重視，正在成為醫(yī)藥工業(yè)和保健品工業(yè)的熱門開發(fā)領(lǐng)域之一[4]。

三萜是樺褐孔菌主要化學(xué)組分，構(gòu)成樺褐孔菌藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，樺褐孔菌總?cè)坪辛靠芍苯佑绊懫渌幮Оl(fā)揮；多酚類化合物是樺褐孔菌提取物抗氧化活性的主要成分；多糖是樺褐孔菌重要的活性成分之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗腫瘤及降血糖等多種生物活性[5]，本文研究以玉米、紅小豆和糙米按不同配比組成混合物為基質(zhì)固體發(fā)酵樺褐孔菌，測(cè)定發(fā)酵后基質(zhì)中樺褐孔菌總?cè)啤⒖偠喾?、總多糖含量，為開發(fā)以樺褐孔菌為主要成分功能食品、藥用飲料、食品添加劑等提供理論參考。

1　材料

玉米、紅小豆、糙米：市售；瓊脂：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

樺褐孔菌醇標(biāo)準(zhǔn)品：河南大學(xué)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室提供；沒(méi)食子酸、葡萄糖、鎢酸鈉、鉬酸鈉、硫酸鋰、液溴等化學(xué)試劑均為分析純。

YX280A滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司；YT-CJ-1D超凈工作臺(tái)：北京亞泰科隆儀器有限公司；SPX-100B-Z恒溫培養(yǎng)箱：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；YN3A3-9G電熱鼓風(fēng)干燥箱：吳江市億能烘箱制造有限公司；722S分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司分析儀器總廠。

2　方法

2.1發(fā)酵菌種及固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備

2.1.1發(fā)酵菌種制備

樺褐孔菌采自黑龍江大興安嶺林區(qū)白樺樹干，經(jīng)黑龍江工業(yè)學(xué)院老師鑒定。野生子實(shí)體用無(wú)菌水沖洗數(shù)次后用無(wú)菌紗布擦干，75 %酒精表面消毒后，用無(wú)菌解剖刀切開菌核，靠近菌核外殼附近取黃豆粒大小組織塊于PDA斜面培養(yǎng)基（添加少量樺木屑），置30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；待菌絲長(zhǎng)滿斜面時(shí)用接菌環(huán)從菌絲生長(zhǎng)濃密的斜面培養(yǎng)基上取一環(huán)，劃線接入瓊脂平板中，28℃恒溫培養(yǎng)箱活化培養(yǎng)14 d；取1 cm2溶于100 mL無(wú)菌水中，渦旋混勻，制得活化菌絲體勻漿液。

2.1.2固體發(fā)酵培養(yǎng)基制備

玉米、紅小豆、糙米分別以質(zhì)量比1∶1∶0（配方1）、1∶0∶1（配方2）、0∶1∶1（配方3）、1∶1∶1（配方4）混合成總質(zhì)量100 g 4種不同基質(zhì)，整粒或粉碎過(guò)10目或50目篩后裝入滅菌袋100℃滅菌50min；冷卻后每袋加入20 mL步驟2.1.1制得的菌絲體勻漿液，放入培養(yǎng)箱中28℃培養(yǎng)30 d；每種基質(zhì)平行裝2袋；發(fā)酵結(jié)束后，將基質(zhì)置60℃干燥箱中烘干，粉碎，過(guò)60目篩備用。

2.2發(fā)酵后基質(zhì)中活性成分提取及含量測(cè)定

2.2.1發(fā)酵后基質(zhì)中總?cè)铺崛〖昂繙y(cè)定

樺褐孔菌醇是樺褐孔菌標(biāo)志性成分，代表了其三萜類化合物共同結(jié)構(gòu)母核及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，因此以樺褐孔菌醇為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定樺褐孔菌中總?cè)坪縖3]。

繪制樺褐孔菌醇標(biāo)準(zhǔn)曲線[3]：取適量真空干燥至恒重樺褐孔菌醇對(duì)照品，無(wú)水乙醇超聲助溶配成0.3 mg/mL對(duì)照品溶液；準(zhǔn)確量取0.3 mg/mL溶液用無(wú)水乙醇配成0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液；準(zhǔn)確量取不同質(zhì)量濃度溶液1.0mL加入8%香草醛-冰醋酸溶液0.4 mL再加入60 %硫酸10 mL；50℃水浴加熱20min，冷卻后533 nm處測(cè)吸光度，結(jié)果在0.03 mg/mL～0.21 mg/mL（吸光度0.11～0.83）范圍內(nèi)，濃度與吸光度間線性關(guān)系良好，以吸光度值為縱坐標(biāo)回歸方程為y=3.392 9x+0.011 14，R2=0.999 3。

基質(zhì)中總?cè)铺崛。簻?zhǔn)確稱取發(fā)酵后干燥粉碎的基質(zhì)，加95 %乙醇25 mL回流提取3次，每次3 h，合并濾液至100 mL容量瓶中，用95 %乙醇定容，即得樣品溶液，再參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)每個(gè)樣品測(cè)吸光度3次取平均，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其含量。

2.2.2發(fā)酵基質(zhì)后中總酚提取及含量測(cè)定

用Folin-Ciocaileu[6]法測(cè)發(fā)酵后基質(zhì)中多酚含量，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱取真空干燥至恒重沒(méi)食子酸10.0 mg，適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)入500 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻即得0.02 g/L沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別量取上述沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，用蒸餾水稀釋至10.0 mL后，得濃度為0.002、0.004、0.006、0.008、0.010、0.012 mg/mL，加2 mL 1 mol/L Folin-Ciocalteu顯色劑，混勻后避光放置8min，再加7.5 mL 10 % Na2CO，混勻后室溫避光反應(yīng)60min，加蒸餾水稀釋至30.0 mL，混勻后765 nm下測(cè)定其吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)得回歸方程為。

基質(zhì)中多酚提取[7]：準(zhǔn)確取發(fā)酵后干燥粉碎的基質(zhì)，加20 mL 50 %乙醇按在50℃熱水浴中回流提取3次，每次回流45min；合并3次濾液于500 mL容量瓶中，蒸餾水定容即得樣品溶液，再參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測(cè)每個(gè)樣品測(cè)吸光度3次取平均，再通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其含量.

2.2.3發(fā)酵后基質(zhì)中多糖提取及含量測(cè)定

用苯酚-硫酸法[8]測(cè)發(fā)酵后基質(zhì)中多糖含量，首先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：準(zhǔn)確稱量葡萄糖20 mg溶于500 mL容量瓶定容得濃度為0.04 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.8、1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL置干燥試管中，分別以水補(bǔ)至4.0 mL，再分別加入6 %苯酚溶液1 mL搖勻，然后加10 mL濃硫酸充分搖勻室溫放置20min，于490nm處測(cè)其吸光度，結(jié)果在0.008mg/mL～0.048mg/mL（吸光度0.16～0.89）范圍內(nèi)，濃度與吸光度間線性關(guān)系良好，回歸方程為。

多糖提取參照文獻(xiàn)[1]許泓瑜方法略作修改：準(zhǔn)確取發(fā)酵后干燥粉碎的基質(zhì)，加15 mL水、80℃熱水浴浸提2.5 h，冷卻后離心（4 000r/min）20min，取清液濃縮后加4倍體積95 %乙醇靜置過(guò)夜，離心過(guò)濾得粗多糖；多糖粗提物加熱蒸餾水復(fù)溶，加1/4體積Sevag溶液（氯仿∶正丁醇=4∶1）高速攪拌脫蛋白，糖液中再加入約4倍體積95 %乙醇，靜置離心過(guò)濾，沉淀反復(fù)用丙酮洗，最后將沉淀物溶于水，定容于500 mL容量瓶中，再參照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)每個(gè)樣品測(cè)吸光度3次取平均值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線確定其含量。

3　結(jié)果與分析

不同配方基質(zhì)發(fā)酵后總?cè)?、總多酚、總多糖含量見?。

表1　不同配方基質(zhì)發(fā)酵后總?cè)?、多酚、多糖含量Table 1 The content of total triterpenoid，polyphenols and polysaccharides at different prescriptions

由表1可看出，玉米紅、小豆和糙米等質(zhì)量混合（配方4）粉碎過(guò)10目篩的基質(zhì)發(fā)酵后總?cè)坪投喾雍慷歼_(dá)到大值，分別為6.27、22.48 mg/g；玉米和糙米等質(zhì)量混合（配方2）顆粒不經(jīng)粉碎的基質(zhì)發(fā)酵后多糖含量最高27.23 mg/g。

不同配方基質(zhì)發(fā)酵后總?cè)坪恳妶D1。

圖1　不同配方基質(zhì)發(fā)酵后總?cè)坪勘容^Fig.1 Comparison of content of total triterpenoid at different prescriptions

由圖1可看出，不同組分基質(zhì)對(duì)發(fā)酵影響很大；玉米、紅小豆和糙米等質(zhì)量混合（配方4），無(wú)論整粒還是粉碎，發(fā)酵后總?cè)坪慷几哂谄渌浞较鄳?yīng)組。原因可能糙米和玉米混合作為碳源與紅小豆作為氮源適合樺褐孔菌成長(zhǎng)所需C/N比；而配方2（玉米∶糙米=1∶1，不含紅小豆）基質(zhì)發(fā)酵后總?cè)坪孔畹停f(shuō)明發(fā)酵效果不好，可能是缺少紅小豆作為氮源導(dǎo)致；對(duì)比配方1（紅小豆與玉米等質(zhì)量）和3（紅小豆與糙米等質(zhì)量）可看出玉米比糙米更能促進(jìn)樺褐孔菌生長(zhǎng)。

圖2　不同配方基質(zhì)發(fā)酵后總多酚含量比較Fig.2 Comparison of content of polyphenols at different prescriptions

由圖2可以看出，配方4無(wú)論基質(zhì)顆粒大小發(fā)酵后所含總多酚含量都高于其他配方相應(yīng)組別，這一結(jié)果和原因與總?cè)葡嗨?；配?顆粒大小不同發(fā)酵后總多酚含量相差較大，說(shuō)明發(fā)酵效果相對(duì)較好，但發(fā)酵后總多酚含量較低，可能是基質(zhì)紅小豆和糙米中多酚含量較低，導(dǎo)致發(fā)酵新產(chǎn)生的加上基質(zhì)中原有的多酚總量仍然很低；配方2顆粒大小不同發(fā)酵后多酚含量相差不大，說(shuō)明發(fā)酵效果相對(duì)較差，發(fā)酵新產(chǎn)生的多酚較少，而多酚含量相對(duì)較高可能是基質(zhì)玉米和糙米中多酚含量較高。

圖3　不同配方基質(zhì)發(fā)酵后總多糖含量比較Fig.3 Comparison of content of polysaccharides at different prescriptions

對(duì)比圖1與3可知，發(fā)酵效果較好的配方4，發(fā)酵后基質(zhì)多糖含量很低，而發(fā)酵效果較差的配方2，發(fā)酵后基質(zhì)多糖含量較高；配方1（紅小豆與玉米等量混合）與3（紅小豆與糙米等量混合）相比，玉米更有益于樺褐孔菌生長(zhǎng)，所以發(fā)酵后基質(zhì)多糖含量較低；同一配方也同樣如此，基質(zhì)粉粹過(guò)10目篩發(fā)酵效果較好而發(fā)酵后多糖含量相比整粒和過(guò)50目篩都低；說(shuō)明發(fā)酵過(guò)程中消耗多糖大于菌體生長(zhǎng)新產(chǎn)生產(chǎn)。

綜上，對(duì)比圖1、圖2、圖3可以看出，無(wú)論哪種配方，粉碎過(guò)10目篩基質(zhì)發(fā)酵效果都優(yōu)于整粒和過(guò)50目；說(shuō)明基質(zhì)顆粒大小對(duì)發(fā)酵影響很大，這與戚以政的結(jié)論是相符的，他認(rèn)為固體發(fā)酵基質(zhì)顆粒大小直接影響到單位體積顆粒所能提供的反應(yīng)表面積的大小，也會(huì)影響到菌體是否容易進(jìn)入基質(zhì)顆粒的內(nèi)部及氧的供給速率和代謝產(chǎn)物的移出速率等[9]。本實(shí)驗(yàn)整?；|(zhì)顆粒大，菌體不容易進(jìn)入基質(zhì)顆粒的內(nèi)部，單位體積顆粒所提供的反應(yīng)表面積小，不利于菌絲生長(zhǎng)；另外孔隙過(guò)大，水分蒸發(fā)快，基質(zhì)含水率降低，也不利于菌體生長(zhǎng)。過(guò)20目篩的基質(zhì)可能是顆粒間孔隙小，透氣性差，O2供給速度及CO2排放速度都變慢，同時(shí)代謝產(chǎn)物的也不易移出，不利于菌絲體生長(zhǎng)；另外驅(qū)除固體發(fā)酵代謝熱主要依靠氣體蒸發(fā)冷卻，而基質(zhì)顆粒小透氣性差也導(dǎo)致基質(zhì)局部溫度高，而天然樺褐孔菌生長(zhǎng)于寒冷環(huán)境，溫度過(guò)高不利菌體生長(zhǎng)。

4　優(yōu)勢(shì)與前景

問(wèn)世于20世紀(jì)80年代末的“藥用真菌新型（雙向性）固體發(fā)酵”或稱“雙向發(fā)酵[10]”，其關(guān)鍵是采用有一定活性成分的中藥材或藥渣作為藥性基質(zhì)代替?zhèn)鹘y(tǒng)營(yíng)養(yǎng)性基質(zhì)與發(fā)酵菌種構(gòu)成發(fā)酵組合[11]，藥性基質(zhì)在提供真菌所需營(yíng)養(yǎng)同時(shí)，還受真菌生長(zhǎng)分泌的酶的生物催化作用，將藥性底物的活性成分進(jìn)行修飾轉(zhuǎn)化，并有可能產(chǎn)生新的藥效成分，既提高了中藥藥效，又有新的活性成分產(chǎn)生，最終使單一發(fā)酵作用向雙向性發(fā)展，“雙向發(fā)酵”將成為研究開發(fā)中藥新藥的一條新途徑[12]。將藥用真菌雙向固體發(fā)酵技術(shù)應(yīng)用到功能性保健食品的研究開發(fā)上，即將藥用或藥食同用真菌接種于可食用雜糧谷物組成的固體基質(zhì)上；由于發(fā)酵后菌絲體直接固定于基質(zhì)，所以基質(zhì)既含谷物雜糧豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，又含真菌代謝物等活性物質(zhì)，因此有較高營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，直接對(duì)其進(jìn)行加工制成適應(yīng)市場(chǎng)需求的功能性菌質(zhì)食品，一定具有良好的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和非常廣闊的應(yīng)用前景。但同時(shí)探索最適宜樺褐孔菌固體發(fā)酵的條件及發(fā)酵后基質(zhì)中有效成分種類和含量的變化都有待于進(jìn)一步的研究。

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Studies on Inonotus Obliquus Fermented Brown Rice Mixture and Analysis of Active Ingredients of Fermentation Product

WANG Yan-mei，GUO Hong-ling，WANG Yan-ling，WANG Ya-zhen
（Department of Environmental Engineering，Heilongjiang University of Technology，Jixi 158100，Heilongjiang，China）

Abstract：A mixture sample comprised of Corn，Red adzuki bean，brown rice served as substrate.After Inonotus obliquus solid fermentation，the content of total triterpenoid，Polyphenols and polysaccharides were measured respectively.Results show that，substrate fermentation achieved the best results under the right conditions that Corn，Red adzuki bean and brown rice were mixed together by crushing，screening through mesh size of 10.The content of polysaccharides，Polyphenols reached maximum 6.27 mg/g and 22.48 mg/g respectively，but good fermentation effect resulted in high polysaccharides consumption.At this point，the content of polysaccharides of the substrate was the lowest，10.57 mg/g.Corn can improve the growth of Inonotus obliquus much more than brown rice.

Key words：Inonotus obliquus；solid fermentation；fermentation substrate；Active Ingredients

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.05.032

基金項(xiàng)目：2015年黑龍江省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃指導(dǎo)項(xiàng)目（201511445007）

作者簡(jiǎn)介：王艷梅（1976—），教師，碩士研究生，研究方向：食品生物技術(shù)。

收稿日期：2015-10-09