原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA表達(dá)及意義

王建新

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院，河南南陽473058)

原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA表達(dá)及意義

王建新

(南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校第一附屬醫(yī)院，河南南陽473058)

目的 探討原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA表達(dá)及其與患者臨床病理參數(shù)、預(yù)后的關(guān)系。方法 選擇原發(fā)性膽囊癌患者20例(膽囊癌組)，其中有轉(zhuǎn)移者11例、無轉(zhuǎn)移者9例，慢性膽囊炎患者17例(對(duì)照組)。取兩組膽囊組織標(biāo)本，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)膽囊組織中nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量，并分析其表達(dá)與原發(fā)性膽囊癌患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 膽囊癌組及對(duì)照組nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為12.943±3.241、19.343±2.044；膽囊癌組有轉(zhuǎn)移及無轉(zhuǎn)移者分別為10.592±1.522、15.817±2.271；膽囊癌組nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且膽囊癌組有轉(zhuǎn)移者明顯低于無轉(zhuǎn)移者及對(duì)照組(P均<0.01)。原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA低表達(dá)與腫瘤肝臟浸潤、肝臟轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胰腺轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及Nevin分級(jí)有關(guān)(P均<0.05)。Kaplan Meier生存分析顯示，nm23-H1B mRNA低表達(dá)者術(shù)后3年生存率明顯低于nm23-H1B mRNA高表達(dá)者(P<0.01)。結(jié)論 原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA表達(dá)降低，其表達(dá)變化與腫瘤轉(zhuǎn)移程度及患者預(yù)后有關(guān)。

原發(fā)性膽囊癌；nm23-H1B；生存時(shí)間

原發(fā)性膽囊癌是臨床常見的膽道系統(tǒng)腫瘤，惡性程度較高，患者預(yù)后一般較差[1，2]。因其臨床早期診斷較困難，故尋找早期特異性的診斷指標(biāo)可能有助于該病的早期診斷。nm23基因是最早被發(fā)現(xiàn)的抑制腫瘤轉(zhuǎn)移基因之一，其家族包括8個(gè)成員，其中nm23-H1和nm23-H2被證實(shí)具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力,目前研究較多的是nm23-H1[3]。nm23-H1B是nm23-H1基因的不同剪切形式，其編碼蛋白在原發(fā)性膽囊癌中的作用鮮見報(bào)道。2005年3月～2010年6月，我們觀察了原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA的表達(dá)，并探討其表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)及預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇同期我院收治的原發(fā)性膽囊癌患者20例(膽囊癌組)，男12例、女8例，年齡41～62歲、平均52.1歲；Nevin分期：Ⅰ～Ⅲ期9例，Ⅳ、Ⅴ期11例；組織分化程度：低中分化12例，高分化8例；肝臟浸潤8例，膽管受侵6例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，胰腺轉(zhuǎn)移9例，腹膜轉(zhuǎn)移10例，并依據(jù)有無淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移分為有轉(zhuǎn)移者(Ⅳ、Ⅴ期)11例、無轉(zhuǎn)移者(Ⅰ～Ⅲ期)9例。同期另選慢性膽囊炎患者17例(對(duì)照組)，男10例、女7例，年齡40～59歲、平均49.2歲。兩組均經(jīng)組織病理檢查明確診斷。排除合并重要臟器嚴(yán)重器質(zhì)性病變者，臨床資料不完整者，無法進(jìn)行隨訪者，隨訪過程中因其他疾病死亡者。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2 nm23-H1B mRNA表達(dá)檢測(cè) 取兩組膽囊組織標(biāo)本立即置入液氮中，-80 ℃冰箱凍存?zhèn)溆?。TRIzol法提取組織中總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA的濃度和純度，應(yīng)用oligo(dT)引物和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。獲得的cDNA產(chǎn)物采用SYBR GreenⅡ染料染色后進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。引物序列：nm23-H1B上游引物：5′-CGGAGTTCAAACCTAAGCAG-3′，下游引物：5′-GATCGCAATGAAGGTACGCTCACAG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物：5′-ACACTGTGCCCATCTACTAGG-3′，下游引物：5′-AGGGGCCGGACGCGTCATACT-3′。所有引物熱循環(huán)條件相同，反應(yīng)體系均為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min?；趦?nèi)參β-actin mRNA表達(dá)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用經(jīng)典的ΔCt法對(duì)nm23-H1B mRNA的表達(dá)進(jìn)行定量，同時(shí)根據(jù)β-actin mRNA表達(dá)進(jìn)行歸一。歸一后平均值在2以上的數(shù)值作為nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 采用電話隨訪的方式，隨訪截至2013年8月，隨訪時(shí)間1～36個(gè)月、中位隨訪時(shí)間21個(gè)月，失訪2例。終止事件為患者死亡。采用Kaplan Meier生存分析法計(jì)算患者生存率，Long-rank檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 兩組nm23-H1B mRNA表達(dá)比較 膽囊癌組及對(duì)照組nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量分別為12.943±3.241、19.343±2.044；膽囊癌組有轉(zhuǎn)移者及無轉(zhuǎn)移者分別為10.592±1.522、15.817±2.271；膽囊癌組nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組，且膽囊癌組有轉(zhuǎn)移者明顯低于無轉(zhuǎn)移者及對(duì)照組(P均<0.01)。

2.2 nm23-H1B mRNA表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 以受試者工作特征曲線中約登指數(shù)最高值(12.64)作為nm23-H1B mRNA表達(dá)水平的分割點(diǎn)，>12.64為nm23-H1B mRNA高表達(dá)，≤12.64為nm23-HIB mRNA低表達(dá)，分析nm23-HIB mRNA低表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。結(jié)果見表1。

表1 原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA低表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 nm23-H1B mRNA表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 nm23-H1B mRNA低表達(dá)者與高表達(dá)者術(shù)后3年生存率分別為0、77.9%，二者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.853，P<0.01)。見圖1。

3 討論

nm23基因是目前公認(rèn)的具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移作用的基因[4]。nm23-H1編碼的nm23-H1蛋白具有二磷酸核苷酸激酶活性，能夠催化轉(zhuǎn)移磷酸基團(tuán)從NTP到NDP，以此維持核苷酸平衡，影響細(xì)胞骨架形態(tài)、參與細(xì)胞分裂時(shí)紡錘體的形成和GTP介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)途徑、微管組裝等，從而影響細(xì)胞的增殖、分化，達(dá)到抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的目的[4～7]。有研究發(fā)現(xiàn)，nm23-H1蛋白低表達(dá)與乳腺癌、卵巢癌、胃癌等多種惡性腫瘤的高轉(zhuǎn)移潛能顯著相關(guān)[8～12]。因此，nm23-H1基因被認(rèn)為是對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移起負(fù)調(diào)節(jié)作用的腫瘤抑制基因。有研究表明，nm23-H1表達(dá)與膽囊癌轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，是患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素[13,14]，說明nm23-H1在膽囊癌轉(zhuǎn)移中發(fā)揮獨(dú)立的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用。

圖1 原發(fā)性膽囊癌不同nm23-H1B mRNA表達(dá)者的生存曲線

nm23-H1定位于染色體17q21.33，cDNA克隆的序列全長(zhǎng)987 bp，編碼一個(gè)有177個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)，有nm23-H1B和nm23-H1A兩個(gè)亞基，是nm23-H1基因的不同剪切形式。nm23-H1B基因在結(jié)構(gòu)上比nm23-H1A多了1個(gè)220 bp的外顯子，編碼的蛋白質(zhì)延伸了25個(gè)氨基酸殘基，在這25個(gè)氨基酸殘基中有1個(gè)酪蛋白激酶(CK)磷酸化位點(diǎn)結(jié)構(gòu)域[7]。CK是一種嗜酸性蛋白底物(如酪蛋白)，存在于多種組織和細(xì)胞膜室的蛋白激酶。因此推測(cè)，nm23-H1B基因可能通過調(diào)節(jié)CK的功能，參與腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控、增殖、信號(hào)傳導(dǎo)，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[15]。

本研究結(jié)果顯示，膽囊癌組有轉(zhuǎn)移者nm23-H1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量明顯低于無轉(zhuǎn)移者及對(duì)照組，且無轉(zhuǎn)移者低于對(duì)照組；本研究還發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性膽囊癌組織nm23-H1B mRNA低表達(dá)與腫瘤肝臟浸潤、肝臟轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、胰腺轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移及Nevin分期有關(guān)；生存分析顯示，nm23-H1B mRNA低表達(dá)者術(shù)后3年生存率明顯低于高表達(dá)者，nm23-H1B mRNA低表達(dá)與患者預(yù)后存在顯著相關(guān)性，說明nm23-H1B是原發(fā)性膽囊癌患者預(yù)后不良的危險(xiǎn)因素。提示nm23-H1B基因高表達(dá)可能對(duì)原發(fā)性膽囊癌的發(fā)展有抑制作用。

綜上所述，原發(fā)性膽囊癌組織中nm23-H1B mRNA表達(dá)降低，其低表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移程度及患者預(yù)后有關(guān)。nm23-H1B mRNA低表達(dá)可作為預(yù)測(cè)原發(fā)性膽囊癌惡性程度及預(yù)后判斷的參考指標(biāo)之一。

但本研究只局限于臨床標(biāo)本檢測(cè)，對(duì)其抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不清楚，仍需進(jìn)一步深入研究。

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