高糖環(huán)境對(duì)胃癌組織、胃癌SGC7901細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)及5-Fu敏感性的影響

張全武，劉芮菡，婁欣

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州450007)

高糖環(huán)境對(duì)胃癌組織、胃癌SGC7901細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白表達(dá)及5-Fu敏感性的影響

張全武，劉芮菡，婁欣

(鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院，鄭州450007)

目的 探討高糖環(huán)境對(duì)胃癌組織、胃癌SGC7901細(xì)胞株P(guān)-糖蛋白(P-gp)表達(dá)及5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的影響。方法 選擇胃癌患者40例、2型糖尿病合并胃癌患者30例，取手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本，采用免疫組化法觀察胃癌組織中P-gp表達(dá)情況；取人胃癌SGC7901細(xì)胞株，體外培養(yǎng)，并給予1 000、4 500、9 000 mg/L葡萄糖干預(yù)(分別設(shè)為低、中、高濃度組)。收集各組細(xì)胞的總蛋白，Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中P-gp表達(dá)；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。結(jié)果 40例胃癌組織中P-gp的平均光密度值為0.014 6，30例2型糖尿病合并胃癌組織中P-gp的平均光密度值為0.021 5，二者比較P<0.01。高濃度組P-gp的相對(duì)表達(dá)量為2.92±0.09，中濃度組為2.53±0.09，低濃度組為1.56±0.09，組間兩兩比較P均<0.01。隨著葡萄糖濃度的升高，5-Fu對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率逐漸下降，尤其以高濃度組效果最明顯(P<0.01)。結(jié)論 高糖環(huán)境可提高胃癌組織及胃癌SGC7901細(xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)，從而降低胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性。

胃癌；高糖環(huán)境；P-糖蛋白；5-氟尿嘧啶

化療是晚期胃癌的主要治療手段，多藥耐藥(MDR)是導(dǎo)致化療失敗的主要原因。胃癌的化療耐藥以MDR為主，P-糖蛋白(P-gp)介導(dǎo)的耐藥途徑是其經(jīng)典的耐藥途徑[1，2]。P-gp是MDR的基因產(chǎn)物，可作為藥泵將化療藥物排出癌細(xì)胞，繼而產(chǎn)生化療耐藥[3，4]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，合并2型糖尿病的胃癌患者化療效果較差[5]。因此推測(cè)，高血糖可能影響化療藥物的敏感性。本研究觀察高糖環(huán)境對(duì)胃癌

組織、胃癌SGC7901細(xì)胞株P(guān)-gp表達(dá)及5-氟尿嘧啶(5-Fu)敏感性的影響，旨在探究2型糖尿病合并胃癌化療效果較差的原因。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇2004年1月～2008年12月在鄭州大學(xué)附屬鄭州中心醫(yī)院行手術(shù)治療的胃癌患者70例，均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷?；颊唠S訪至2010年10月，臨床及病理資料完整。其中單純胃癌患者40例，男27例、女13例，平均年齡59歲；2型糖尿病合并胃癌患者30例，男19例、女11例，平均年齡57歲。糖尿病診斷采用1999年WHO制定的糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)，即空腹血糖≥7.0 mmol/L和(或)餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L；2型糖尿病合并胃癌：確診2型糖尿病半年以上發(fā)現(xiàn)胃癌，糖尿病病程0.5～4年。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官惡性腫瘤者；②術(shù)前進(jìn)行放化療者；③合并垂體、甲狀腺、腎上腺等其他內(nèi)分泌器官功能失調(diào)者；④合并嚴(yán)重心、腦、腎等重要器官功能障礙者。

1.2 胃癌組織P-gp表達(dá)檢測(cè) 取40例單純胃癌患者、30例2型糖尿病合并胃癌患者手術(shù)切除的胃癌組織標(biāo)本，中性甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚切片；采用羅氏GX全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)自動(dòng)染色，P-gp鼠抗人單克隆抗體工作濃度為1∶100，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。P-gp陽(yáng)性染色主要定位于細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒。所有切片在光鏡(400倍)下隨機(jī)取5個(gè)視野，由IPP-6圖像分析系統(tǒng)分析每張圖片的P-gp陽(yáng)性細(xì)胞的光密度值。

1.3 葡萄糖對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞P-gp表達(dá)及5-Fu敏感性影響的觀察

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及葡萄糖干預(yù) 取胃癌SGC7901細(xì)胞株，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至整個(gè)培養(yǎng)皿的85%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基，無(wú)菌PBS洗滌2～3次，0.25%胰酶消化，倒置顯微鏡下觀察到細(xì)胞脫壁后，吹打成細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄去上清液。收集細(xì)胞，并置于3個(gè)培養(yǎng)皿中，分別給予1 000 g/L葡萄糖，使葡萄糖終濃度為1 000、4 500、9 000 mg/L(分別設(shè)為低、中、高濃度組)[2，3]，加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.3.2 胃癌細(xì)胞P-gp表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting法。收集各組對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，使用蛋白裂解液冰上裂解10 min，12 000 r/min離心15 min，取上清。BCA試劑盒檢測(cè)蛋白濃度后按照蛋白樣品∶5×SDS為4∶1煮沸變性。取30 μg樣品上樣于SDS-PAGE，電泳至溴酚藍(lán)跑到膠底部。轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂奶粉4 ℃過(guò)夜封閉，P-gp(1∶200)及β-actin(1∶1 000)一抗37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜3×10 min。二抗(1∶5 000)37 ℃搖床孵育2 h，TBST洗膜3×10 min，最后TBS洗膜10 min，ECL發(fā)光，UVP圖像采集，重復(fù)6次，IPP-6圖像分析系統(tǒng)分析P-gp陽(yáng)性細(xì)胞光密度值，計(jì)算其相對(duì)表達(dá)量。

1.3.3 胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性的影響觀察 采用MTT法。收集各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×105/孔接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)4 h更換為無(wú)血清培養(yǎng)基，饑餓處理20 h。按終濃度為5、10、15、20、25、30、35 μg/mL加入用培養(yǎng)基稀釋好的5-Fu。繼續(xù)培養(yǎng)72 h，加入MTT 20 μL，孵育4 h，棄去培養(yǎng)基，加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=1-(試驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照空A值-空白孔A值)。

2 結(jié)果

2.1 單純胃癌組織及糖尿病合并胃癌組織P-gp表達(dá)比較 單純胃癌組織P-gp的平均光密度值為0.014 6，糖尿病合并胃癌組織P-gp的平均光密度值為0.021 5，二者比較P<0.01。

2.2 不同濃度葡萄糖干預(yù)后胃癌細(xì)胞P-gp表達(dá)比較 高濃度組P-gp的相對(duì)表達(dá)量為2.92±0.09，中濃度組為2.53±0.09，低濃度組為1.56±0.09。組間兩兩比較P均<0.01。

2.3 不同濃度葡萄糖干預(yù)后胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu敏感性的影響 隨著葡萄糖濃度升高，5-Fu對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖抑制率逐漸降低(P均<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度5-Fu對(duì)葡萄糖干預(yù)后胃癌細(xì)胞增殖抑制率的影響

注：與同濃度5-Fu下低濃度組比較，*P<0.05。

3 討論

腫瘤的耐藥機(jī)制包括藥物泵出增多、藥物敏感性降低、藥物解毒能力增強(qiáng)等[5]。研究發(fā)現(xiàn)，P-gp高表達(dá)是MDR發(fā)生的原因之一，而超過(guò)50%的胃癌患者癌組織過(guò)表達(dá)P-gp[6～8]。P-gp是一種分子量為170 kD的跨膜蛋白，主要存在于細(xì)胞膜，是MDR-1基因編碼的一種蛋白產(chǎn)物，具有能量依賴性藥物排出泵的功能，既可與ATP結(jié)合，也可與抗癌藥分子結(jié)合。P-gp利用ATP水解釋放的能量將抗癌藥物從細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。因此，P-gp/MDR-1過(guò)度表達(dá)是腫瘤產(chǎn)生MDR的分子基礎(chǔ)[1]，其在正常組織中具有排除異物的作用，而在腫瘤細(xì)胞中主要以此排斥化療藥物[9～11]。

近年研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病是胃癌的危險(xiǎn)因素之一[3，12]。糖尿病合并胃癌患者存在明顯的代謝紊亂狀態(tài)，胃癌臨床分期、淋巴結(jié)及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度與糖代謝紊亂呈正相關(guān)，這類患者化療效果往往較單純胃癌患者更差[4]。因此推測(cè)，高血糖可能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，其機(jī)制可能與腫瘤細(xì)胞的能量代謝有關(guān)，高血糖可促進(jìn)NAD+依賴的沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Sirt1)蛋白的表達(dá)繼而促進(jìn)胃癌的進(jìn)展[13，14]。本研究結(jié)果顯示，合并糖尿病的胃癌組織P-gp表達(dá)明顯高于單純胃癌組織，經(jīng)過(guò)高糖干預(yù)的胃癌SGC7901細(xì)胞也觀察到同樣結(jié)果，說(shuō)明高糖環(huán)境可促進(jìn)胃癌組織P-gp的表達(dá)。有研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中Sirt1、尼克酰胺磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶(Nampt)、p53與P-gp表達(dá)有一定相關(guān)性[12，13]。Bi等[15]研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性Nampt能促進(jìn)胃癌的進(jìn)展，且與胃癌的化療耐藥密切相關(guān)。高糖環(huán)境可促進(jìn)癌細(xì)胞中Nampt和Sirt1的表達(dá)，繼而升高突變型p53的表達(dá)，使癌細(xì)胞中P-gp的表達(dá)升高[13]。Sirt1是能量代謝的中樞蛋白，參與NAD+、NADPH、ADP等能量代謝過(guò)程，其高表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞代謝增加和ATP含量增加，從而使ATP依賴蛋白P-gp的活性和表達(dá)量相應(yīng)升高[16]。P-gp與抗癌藥物結(jié)合后再與ATP結(jié)合，通過(guò)ATP供能，將細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)藥物濃度降低，從而導(dǎo)致化療耐藥；P-gp對(duì)天然疏水類抗腫瘤藥物有較強(qiáng)的外泵作用，是腫瘤細(xì)胞適應(yīng)、轉(zhuǎn)化、增殖與進(jìn)展的一種自身保護(hù)方式，而這種保護(hù)作用的負(fù)效應(yīng)則是腫瘤MDR的重要機(jī)制[17]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著葡萄糖濃度的升高，5-Fu對(duì)胃癌SGC7901細(xì)胞的增殖抑制率呈明顯下降趨勢(shì)，尤其以高濃度組下降最明顯；說(shuō)明高糖環(huán)境下胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性下降，產(chǎn)生了化療耐藥。

綜上所述，我們認(rèn)為高糖環(huán)境可提高胃癌組織及胃癌SGC7901細(xì)胞中P-gp的表達(dá)，從而使胃癌細(xì)胞對(duì)5-Fu的敏感性下降，產(chǎn)生化療耐藥；抑制胃癌組織中P-gp的表達(dá)有可能成為高血糖合并胃癌患者的治療靶點(diǎn)。

[1] Miura JT, Johnston FM, Thomas J, et al. Molecular profiling in gastric cancer: examining potential targets for chemotherapy[J]. J Surg Oncol, 2014,110(3):302-306.

[2] Zhao YY, Yu L, Liu BL, et al. Downregulation of P-gp, Ras and p-ERK1/2 contributes to the arsenic trioxide-induced reduction in drug resistance towards doxorubicin ingastric cancer cell lines[J]. Mol Med Rep, 2015,12(5):7335-7343.

[3] Sekikawa A, Fukui H, Maruo T, et al. Diabetes mellitus increases the risk of early gastric cancer development[J]. Eur J Cancer, 2014,50(12):2065-2071.

[4] 于海燕，張志勇，王凱，等.下調(diào)RPL23對(duì)胃癌耐藥細(xì)胞SGC7901/ADR藥物敏感性的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23(10)：1340-1343.

[5] Chowdhury TA. Diabetes and cancer[J]. QJM, 2010,103(12):905-915.

[6] 李世俊，龐華.針對(duì)多藥耐藥腫瘤的潛力性治療策略——CIK細(xì)胞[J].山東醫(yī)藥，2012，52(1)：104-106.

[7] Yin Y, Li W, Deng M, et al. Extracellular high mobility group box chromosomal protein 1 promotes drug resistance by increasing the expression of Pglycoprotein expression in gastric adenocarcinoma cells[J]. Mol Med Rep, 2014,9(4):1439-1443.

[8] Chen J, Mao L, Liu S, et al. Effects of a novel porphyrin-based photosensitizer on sensitive and multidrug-resistant human gastric cancer cell lines[J]. J Photochem Photobiol B, 2015(151):186-193.

[9] 孫曉春，朱偉金，吳樂(lè)樂(lè)，等.COX-2、EGFR和PgP在胃癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].江蘇醫(yī)藥，2013，39(1)：24-26.

[10] Xie X, Tang B, Zhou J, et al. Inhibition of the PI3K/Akt pathway increases the chemosensitivity of gastric cancer to vincristine[J]. Oncol Rep, 2013,30(2):773-782.

[11] Mangia A, Caldarola L, Dell'Endice S, et al. The potential predictive role of nuclear NHERF1 expression in advanced gastric cancer patients treated with epirubicin/oxaliplatin/capecitabine first line chemotherapy[J]. Cancer Biol Ther, 2015,16(8):1140-1147.

[12] Ikeda F, Kiyohara Y. Helicobacter pylori infection and hyperglycemia/diabetes are associated with an increased risk of gastric cance[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2015,42(5):529-533.

[13] Zhao W, Chen R, Zhao M, et al. High glucose promotes gastric cancer chemoresistance in vivoand in vitro[J]. Mol Med Rep, 2015,12(1):843-850.

[14] 耿苗，唐修文.Nrf2/ARE信號(hào)通路與胃癌耐藥關(guān)系的研究進(jìn)展[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2012，34(11)：1129-1133.

[15] Bi TQ, Che XM, Liao XH, et al. Overexpression of Nampt in gastric cancer and chemopotentiating effects of the Nampt inhibitor FK866 in combination with fluorouracil[J]. Oncol Rep, 2011,26(5):1251-1257.

[16] 樊林，陳銳，趙偉，等.Sirt1、p53及P-gp在胃癌中的表達(dá)及其臨床意義[J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2013，34(5)：642-646.

[17] 周麗榮，潘燕，付漢東.胃癌合并糖尿病患者的代謝情況與胃癌臨床特征的相關(guān)性[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2015，23(11)：1572-1574.

Effects of high glucose on expression of p-glycoprotein and 5-Fu sensitivity in gastric cancer tissues and gastric cancer cell line SGC7901

ZHANGQuanwu,LIURuihan,LOUXin

(ZhengzhouCentralHospitalAffiliatedtoZhengzhouUniversity,Zhengzhou450007,China)

Objective To investigate the effects of high glucose on the expression of P-glycoprotein (P-gp) and 5-Fu sensitivity in gastric cancer tissues and gastric cancer cell line SGC7901. Methods The expression of P-gp from the gastric cancer tissues in 40 cases of patients with gastric cancer and 30 case of patients with type 2 diabetes mellitus combined with gastric cancer was detected by immunohistochemistry. Human gastric cancer cell line SGC7901 was cultured and intervened by 1 000, 4 500 and 9 000 mg/L glucose (low-dose, medium-dose and high-dose glucose group). The cell total protein of each group was collected, the expression of P-gp protein in each group was detected by Western blotting, and the sensitivity of cells to 5-Fu was detected by MTT assay. Results The average optical density of P-gp in 40 cases of gastric cancer and 30 case of type 2 diabetes mellitus combined with gastric cancer was 0.0146 and 0.021 5 respectively (P<0.01). The expression of P-gp in high-dose, medium-dose and low-dose glucose groups was 2.92±0.09, 2.53±0.09 and 1.56±0.09, respectively. Meanwhile, significant difference was found between every two groups (allP<0.01). MTT results showed that the sensitivity of gastric cancer cells to 5-Fu was decreased as the increased concentrations of glucose, especially in high-dose glucose group (P<0.01). Conclusion High glucose may promote the expression of P-gp protein in gastric cancer and gastric cancer cell line SGC7901, thus reduce the sensitivity of gastric cancer cells to 5-Fu.

gastric carcinoma; high glucose; P-glycoprotein; 5-fluorouracil

河南省科技發(fā)展計(jì)劃(142102310461)。

張全武(1972-)，男，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟[瘤的病理診斷，曾獲鄭州市科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)兩項(xiàng)。E-mail： zxyyzqw@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.24.006

R735.2

A

1002-266X(2016)24-0020-03

2015-12-04)