腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制

尉娜，李靜，李娟，譚軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制

尉娜，李靜，李娟，譚軍

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院，河南新鄉(xiāng) 453003)

目的 探討腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的腦保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 將健康雄性成年SD大鼠224只隨機(jī)分為假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組、缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組，每組56只。各組均采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞模型，假手術(shù)組及腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組不插線栓；手術(shù)前3天，假手術(shù)組和缺血再灌注組腹腔注射生理鹽水，腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組和腺苷預(yù)處理組腹腔注射腺苷注射液。各組于缺血再灌注3、7、14、21天分別處死大鼠16只，并制備大腦組織切片。應(yīng)用HE染色觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)改變，采用免疫組化法觀察局灶性腦缺血再灌注后皮質(zhì)及海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果 HE染色：假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組腦組織各層神經(jīng)元排列整齊、規(guī)則，無壞死細(xì)胞。缺血再灌注組缺血再灌注3天，大鼠腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元排列稀疏，有崩解、丟失現(xiàn)象；缺血再灌注7、14、21天，上述病理變化減緩。腺苷預(yù)處理組在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)較缺血再灌注組腦組織病理改變有明顯改善，尤以7天后改善更明顯。免疫組織化學(xué)染色：假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組皮質(zhì)少見Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)，海馬區(qū)有少量Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)；缺血再灌注組、腺苷預(yù)處理組Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量于再灌注3天開始增加，缺血再灌注組于7天達(dá)高峰，腺苷預(yù)處理組于14天達(dá)高峰，隨后開始逐漸下降；腺苷預(yù)處理組各時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)、海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量均明顯高于缺血再灌注組(P均<0.05)。結(jié)論 腺苷預(yù)處理能顯著減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織神經(jīng)元的損傷程度，可能與其促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖有關(guān)。

腦缺血再灌注；腺苷；內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞；大鼠

缺血性腦血管病是一類常見病、多發(fā)病，腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞損傷的不可再生性導(dǎo)致其極高的致殘率與病死率。減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷、提高腦組織對缺血的耐受一直是臨床預(yù)防和治療缺血性腦血管病的重點(diǎn)和難點(diǎn)。本研究即探討腺苷預(yù)處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)增殖的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動物及分組：健康雄性SD大鼠224只，體質(zhì)量250～300 g，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H20030320、規(guī)格：6 mg/2 mL)，Nestin多克隆抗體、即用型SABC免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，Nikon MODEL YS100顯微鏡(Nikon)，照相顯微鏡HPIAS-2000顯微圖象定量分析系統(tǒng)(鄭州太陽電子科技有限公司)。

1.2 造模與分組處理 將224只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組、缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組，各56只。各組均采用改良尼龍線栓塞法制備大腦中動脈阻塞模型[1,2]；阻斷大腦中動脈2 h后，輕輕向外抽拉尼龍線至頸外動脈主干，大腦動脈Willis環(huán)和大腦中動脈已恢復(fù)血供，保持體溫至清醒。假手術(shù)組及腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組不插線栓，其余處理同缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組。假手術(shù)組和缺血再灌注組于手術(shù)前3天開始腹腔注射生理鹽水，2 mL/次、1次/d；腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組和腺苷預(yù)處理組于手術(shù)前3天開始腹腔注射腺苷注射液，劑量為1.5 mg/kg，生理鹽水稀釋到2 mL，1次/d。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 各組根據(jù)再灌注時(shí)間于缺血再灌注3、7、14、21天分別處死大鼠14只，取出大腦至培養(yǎng)皿中，切取視交叉前后各2 mm厚的腦組織，放入4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中固定24 h，脫水透明，石蠟包埋，20 μm切片，用于HE染色及免疫組化染色。

1.3.1 皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)改變 采用HE染色法。將制備好的切片脫蠟、水化，浸入蘇木素染液，淡氨水中返藍(lán)，伊紅染液染色3～4 min，脫水、透明、中性樹膠封片，光鏡下觀察。

1.3.2 皮質(zhì)及海馬區(qū)NSCs增殖情況 采用免疫組化染色法。按照Nestin免疫組化染色試劑盒說明書進(jìn)行，光鏡觀察并應(yīng)用HPIAS-2000顯微圖像處理系統(tǒng)采集圖片，每張切片隨機(jī)取8～10個視野，計(jì)數(shù)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)，求其平均值為該張切片Nestin陽性細(xì)胞數(shù)。Nestin陽性判斷標(biāo)準(zhǔn)：胞質(zhì)呈棕褐色，胞體呈圓形、橢圓形、椎體形和三角形等，排列不規(guī)則，有聚集現(xiàn)象，并可見有深染的1個或多個突起，胞核淡染。

2 結(jié)果

2.1 各組皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組皮質(zhì)各層神經(jīng)元排列緊密而整齊，結(jié)構(gòu)清晰，胞體飽滿，分布均勻，無數(shù)量減少及異常形態(tài)學(xué)改變，未見到死亡神經(jīng)元；海馬CAI區(qū)錐體細(xì)胞層排列規(guī)則、緊致，細(xì)胞輪廓清楚。缺血再灌注3天，大腦皮質(zhì)、海馬區(qū)神經(jīng)元排列稀松，神經(jīng)組織失去完整結(jié)構(gòu)，有細(xì)胞破裂、胞核溶解現(xiàn)象，細(xì)胞周圍高度水腫，梗死周圍有膠質(zhì)細(xì)胞增殖。再灌注7、14、21天上述病理改變趨勢減緩。腺苷預(yù)處理組在相應(yīng)再灌時(shí)間點(diǎn)較缺血再灌注組腦組織病理改變明顯改善，缺血再灌注7天改善尤為明顯。見插頁Ⅲ圖4。

2.2 各組皮質(zhì)及海馬區(qū)NSCs增殖情況比較 見表1、2。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)皮質(zhì)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量比較±s)

注：與缺血再灌注組比較，▲P<0.05。

表2 各組不同時(shí)間點(diǎn)海馬區(qū)Nestin陽性細(xì)胞數(shù)量比較±s)

注：與假手術(shù)組、腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組比較，▲P<0.01；與缺血再灌注組比較，★P<0.05。

3 討論

腦缺血預(yù)處理(CIP)是指對腦進(jìn)行二次或多次短暫的亞致死性缺血、缺氧或藥物預(yù)處理，調(diào)動機(jī)體組織的自身保護(hù)機(jī)制，達(dá)到減輕腦缺血再灌注損傷的目的，CIP是目前認(rèn)為較為有效地避免腦缺血再灌注損傷的治療方法，在實(shí)際臨床工作中多采用藥物預(yù)處理，目前常用藥物主要有中藥、麻醉藥、鈣離子通道拮抗劑等。研究發(fā)現(xiàn)，許多外源性藥物應(yīng)用于腦缺血再灌注時(shí)，通過不同途徑刺激內(nèi)源性腺苷的分泌來達(dá)到保護(hù)腦組織的目的[3]，因此我們考慮外源性腺苷也可以治療腦缺血再灌注損傷[4～6]。本研究腺苷預(yù)處理組在相應(yīng)再灌時(shí)間點(diǎn)較缺血再灌注組腦組織缺血有明顯改善，缺血再灌注7天改善更明顯，證實(shí)腺苷預(yù)處理可改善大鼠腦缺血再灌注損傷。

近年研究發(fā)現(xiàn)，腦組織受到缺血性損傷時(shí)可以刺激內(nèi)源性NSCs的增殖、分化，從而促進(jìn)神經(jīng)再生和功能的重建[7～9]。然而在這種狀態(tài)下的NSCs增殖能力十分有限，對受損腦組織的功能修復(fù)作用甚微。因此，深入研究腦缺血后NSCs增殖的發(fā)生機(jī)制及影響因素，通過不同途徑和方法促進(jìn)內(nèi)源性NSCs適時(shí)增殖和分化是治療缺血性腦血管病的關(guān)鍵。Nestin是能夠特異性表達(dá)在早期原始神經(jīng)細(xì)胞上的分子標(biāo)記物，在出生后表達(dá)停止，隨著干細(xì)胞分化、成熟，逐漸可以被膠質(zhì)纖維酸性蛋白、神經(jīng)絲蛋白等中間絲蛋白替代[10]。Nestin作為目前識別NSCs的重要標(biāo)志蛋白之一，已被廣泛用于標(biāo)記NSCs。Nestin陽性表達(dá)的細(xì)胞，可看作是NSCs[11～13]。本研究結(jié)果顯示，假手術(shù)組與腺苷預(yù)處理后假手術(shù)組皮質(zhì)未見到Nestin陽性細(xì)胞，海馬區(qū)有少量Nestin陽性細(xì)胞，提示內(nèi)源性NSCs在成年大鼠腦內(nèi)基本處于靜息狀態(tài)。缺血再灌注組腦缺血再灌注后Nestin陽性細(xì)胞表達(dá)有所增加，說明腦損傷后存在內(nèi)源性NSCs增殖。腺苷預(yù)處理組Nestin陽性細(xì)胞明顯多于缺血再灌注組，且隨處理時(shí)間延長表達(dá)增加，峰值出現(xiàn)在缺血再灌注后第14天；第21天Nestin陽性表達(dá)仍高于缺血再灌注組，說明腺苷可促進(jìn)在體NSCs的增殖，并能增強(qiáng)NSCs的增殖能力。其可能的作用機(jī)制：腺苷主要通過4種膜受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，分別為A1、A2a、A2b和A3，A1腺苷受體可在NSCs上表達(dá)，其活化也能促進(jìn)NSCs的增殖，活化的A1腺苷受體可能通過激活MEK/ERK和AKt信號通路，促進(jìn)NSCs的增殖[14,15]。

綜上所述，腺苷預(yù)處理能顯著減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后腦組織神經(jīng)元的損傷程度，其機(jī)制可能為促進(jìn)局灶性腦缺血損傷后內(nèi)源性NSCs增殖。

[1] 李東亮,王合軒.局部腦缺血與再灌注大鼠模型的建立[J].新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),1992,6(9):93-95

[2] Zea L, Weinstein PR, Carlson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke, 1989,20(1):84-91.

[3] 劉艷,羅組明,孫愛民,等.局灶性腦缺血再灌注后腦腺苷含量和烯醇化酶的動態(tài)變化[J].中國臨床康復(fù),2004,8(10):1863-1865.

[4] 譚軍,孫兆印.腺苷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)功能的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(9):25-27.

[5] 譚軍,胡少瑾,楊廷桐.環(huán)磷腺苷預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響[J].中國民康醫(yī)學(xué),2006,18(11):931-933.

[6] 譚軍,楊純生.腺苷預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后Glu的影響[J].中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志,2008,11(11):50-52.

[7] Shen CC, Yang YC, Chiao MT, et al. Characterization of endogenous neural progenitor cells after experimental ischemic stroke[J]. Curr Neurovasc Res, 2010,7(1):6-14.

[8] Ulrich H, Abbracchio MP, Burnstock G. Extrinsic purinergic regulation of neural stem/progenitor cells: implications for CNS development and repair[J]. Stem Cell Rev, 2012,8(3):755-767.

[9] Piao CS, Li B, Zhang LJ, et al. Stem cell factor and granulocyte colony-stimulating factor promote neuronal lineage commitment of neural stem cells[J]. Differentiation, 2012,83(1):17-25.

[10] Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD, et al. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein[J]. Cell, 1990,60(4):585-595.

[11] Von Bohlen und Halbach O. Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus[J]. Cell Tissue Res, 2011,345(1):1-19.

[12] Moon C, Ahn M, Kim S, et al. Temporal patterns of the embryonic intermediate filaments nestin and vimentin expression in the cerebral cortex of adult rats after cryoinjury[J]. Brain Res, 2004,1028(2):238-242.

[13] Douen AG, Dong L, Vanance S, et al. Regulation of nestin expression after cortical ablation in adult rat brain[J]. Brain Res, 2004,1008(2):139-146.

[14] Asghari AA, Azarnia M, Mirnajafi-Zadeh J, et al. Adenosine A1 receptor agonist, N6-cyclohexyladenosine, protects myelin and induces remyelination in an experimental model of rat optic chiasm demyelination; electrophysiological and histopathological studies[J]. J Neurol Sci, 2013,325(1-2):22-28.

[15] Migita H, Kominami K, Higashida M, et al. Activation of adenosine A1receptor-induced neural stem cell proliferation via MEK/ERK and Akt signaling pathways[J]. J Neurosci Res, 2008,86(13):2820-2828.

新鄉(xiāng)市重點(diǎn)科技攻關(guān)項(xiàng)目(ZD2011-27)。

譚軍(E-mail: tanjun1997@126.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.20.011

R734.3

A

1002-266X(2016)20-0033-03

2015-10-13)