纖維素降解菌的篩選及在狼尾草青貯中使用效果評(píng)價(jià)

黃勤樓，鐘珍梅，黃秀聲*，陳鐘佃，馮德慶，夏友國

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350013；

3.福建省丘陵地區(qū)循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

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纖維素降解菌的篩選及在狼尾草青貯中使用效果評(píng)價(jià)

黃勤樓1,3，鐘珍梅2,3，黃秀聲2,3*，陳鐘佃2,3，馮德慶2,3，夏友國2

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013；2.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福建 福州 350013；

3.福建省丘陵地區(qū)循環(huán)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013)

摘要：纖維素降解菌對(duì)改善牧草品質(zhì)和提高動(dòng)物對(duì)飼草的利用率具有重要作用。引進(jìn)多種纖維素降解菌并從中篩選出酶活力較高的11,21和36號(hào)菌株。利用篩選出的3株菌株的發(fā)酵液，開展在青貯雜交狼尾草中的使用效果評(píng)價(jià)[設(shè)4個(gè)處理，處理1為未添加菌液的對(duì)照組(CK)，處理2，3，4分別添加11，21，36號(hào)菌株菌液]。結(jié)果表明，添加纖維素降解菌能提高青貯牧草乳酸含量，處理2,3,4的乳酸含量比CK提高了19.42%(P<0.05)，38.35%(P<0.05)和4.85%(P>0.05)；添加纖維素菌液進(jìn)行青貯的3個(gè)處理的中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維(ADF)和半纖維素(HC)的含量均低于CK和青貯前，其中處理3的NDF、ADF和HC含量最低，表明篩選出的3種纖維素降解菌菌株均能改善青貯品質(zhì)，不同程度地降解了牧草纖維素的含量，其中處理3(21號(hào)菌株)降解纖維素的效果最為明顯，青貯料營養(yǎng)品質(zhì)最好。

關(guān)鍵詞：纖維素降解菌；酶活力；雜交狼尾草；青貯

青貯是保存和生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)多汁反芻動(dòng)物飼料的主要途徑之一。目前，微生物制劑和纖維素酶制劑作為生物性青貯添加劑已成為牧草營養(yǎng)學(xué)中的研究熱點(diǎn)[1-3]。在飼草青貯過程添加纖維素酶，可破壞植物細(xì)胞壁，釋放營養(yǎng)物質(zhì)，改善飼草的營養(yǎng)品質(zhì)，因而能夠提高動(dòng)物對(duì)飼草的利用率。自然界中能夠分泌纖維素酶的微生物有細(xì)菌、真菌、放線菌和一些原生動(dòng)物等。細(xì)菌類酶活力較強(qiáng)的菌種有纖維黏菌屬、纖維桿菌屬等；真菌類有木霉、曲霉、根霉和青霉等；放線菌有鏈霉屬、高溫放線菌屬等[4-5]。目前用于飼草青貯研究與應(yīng)用的纖維素酶主要來自真菌。然而所研發(fā)和應(yīng)用的菌株仍存在飼草纖維素降解能力低、活性不穩(wěn)定、產(chǎn)酶成本高、作用pH范圍狹窄等問題[6]。因此，獲取高效降解飼草纖維素的微生物菌株及組合制劑的應(yīng)用對(duì)提高飼草營養(yǎng)品質(zhì)及動(dòng)物利用效率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)為多年生禾本科牧草，具有產(chǎn)量高、耐刈割、適口性好等特點(diǎn)，是草食家畜的優(yōu)質(zhì)青飼料。由于其抗旱和耐濕性強(qiáng)，對(duì)土壤要求不嚴(yán)，近年來在南方紅壤山地得到了廣泛的推廣和應(yīng)用[7-11]。雜交狼尾草的盛產(chǎn)期集中在夏季，雖然家畜消納了多數(shù)飼草，但夏季雨量大且飼草含水量高給盈余飼草調(diào)制成干草帶來很大的難度。如何保存狼尾草使其在冬季、早春滿足家畜營養(yǎng)需要，是南方畜牧生產(chǎn)中急需解決的問題，其中狼尾草青貯技術(shù)的研究和應(yīng)用是解決該問題的關(guān)鍵技術(shù)。因此，本研究開展了降解纖維素菌的篩選及在雜交狼尾草青貯中的應(yīng)用效果研究，為降解纖維素菌(酶)在飼草青貯生產(chǎn)中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，以期進(jìn)一步促進(jìn)雜交狼尾草在畜牧上的綜合利用水平。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1菌種引進(jìn)從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所引進(jìn)11種真菌和3種細(xì)菌(均無毒性)進(jìn)行降解牧草纖維素效果篩選(表1)。

1.1.2青貯原料試驗(yàn)青貯原料為雜交狼尾草和麥麩，供試牧草由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所牧草品種資源圃提供。雜交狼尾草在生長期45 d，植株高度1.5～2.0 m時(shí)刈割。麥麩從市面上購買，飼草和麥麩營養(yǎng)成分見表2。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1菌株的分離與純化取菌液1 mL加入到9 mL的無菌水中，稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度濃度，然后通過常規(guī)的稀釋分離法，用涂布棒涂布于PDA和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上，特定溫度培養(yǎng)2 d，復(fù)壯菌種并觀察菌落是否為單一的菌種。然后以同樣的方法，取1 mL菌液接種于羧甲基纖維素鈉 (sodium carboxymethyl cellulose,CMCNa)平板培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2 d， 挑

表1　菌種名稱與分類

選長勢(shì)較好的單一菌落，重復(fù)多次劃線接種于羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基上，直至得到單一的純菌落。將篩選的菌株再轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上查看菌落形態(tài)是否為同一種菌株，若是則留作備用，若不純則繼續(xù)分離純化。

1.2.2具有降解纖維素菌種的篩選與酶活力測(cè)定把培養(yǎng)出來的菌株轉(zhuǎn)移到另外的CMCNa平板培養(yǎng)基上，保持對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)行培養(yǎng)，并將一定量且濃度為1 mg/mL的剛果紅溶液倒入培養(yǎng)好的對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中，蓋好后置振蕩器上染色1 h，倒出剛果紅溶液，再用1 mol/L的NaCl溶液洗脫，倒出NaCl溶液，若菌株產(chǎn)生纖維素酶，則會(huì)在菌株周圍出現(xiàn)清晰的透明圈，根據(jù)透明圈的大小選擇酶活較高的菌株[12-14]。用直尺測(cè)量透明圈直徑和菌落直徑，并以兩者比值的大小作為初步判斷菌株分解能力的指標(biāo)。

表2　青貯各原料營養(yǎng)成分含量

DM：干物質(zhì) Dry matter；CP：粗蛋白 Crude protein；NDF：中性洗滌纖維 Neutral detergent fiber；ADF：酸性洗滌纖維 Acid detergent fiber；HC：半纖維素 Hemicellulose. 下同 The same below.將初篩得到的菌株，分別接種到100 mL液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)3 d后，再以10%的接種量接入200 mL的培養(yǎng)基中，28℃培養(yǎng)7 d，即菌株的發(fā)酵液。將菌株發(fā)酵液置4000 r/min的離心機(jī)中，離心10 min，過濾，取上清液0.05 mL稀釋到2 mL，獲得稀釋倍數(shù)為40倍的菌株胞外酶液。測(cè)定菌株的胞外酶活力，并篩選出3種酶活力較高的菌株用于雜交狼尾草青貯效果比較。

1.2.3添加菌液青貯牧草效果評(píng)價(jià)利用篩選出的3株菌株的發(fā)酵液，開展在青貯雜交狼尾草中的使用效果評(píng)價(jià)。設(shè)4個(gè)處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，處理1為未添加菌液青貯的對(duì)照組(CK)，處理2，3和4中分別添加篩選出的酶活力較高的3種菌株(11,21,36號(hào))菌液，添加量為0.1 mL/kg青貯料。同時(shí)為取得較好的發(fā)酵效果，青貯原料添加15%的麥麩，將青貯混合原料水分含量調(diào)到65%～75%[15]，牧草與麥麩混合均勻后裝入1 L青貯瓶中塞緊密封，室溫放置45 d后，開封進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4牧草和青貯料營養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)測(cè)定雜交狼尾草青貯前后分別取樣，經(jīng)65℃烘干至恒重，粉碎后密封保存待測(cè)。采用常規(guī)法[16]測(cè)定樣品的干物質(zhì)(dry matter, DM)、粗蛋白(crude protein, CP)、中性洗滌纖維(neutral detergent fiber, NDF)、酸性洗滌纖維(acid detergent fiber, ADF)、半纖維素(hemicellulose, HC)含量。青貯料開封后，取青貯飼料樣品20 g，加入80 mL蒸餾水，在4℃下浸泡24 h，經(jīng)雙層濾紙過濾后靜置30 min，用雷磁PHS-3C精密pH計(jì)測(cè)定pH值。用高效液相色譜儀(島津LC-20A)測(cè)定乳酸、乙酸等含量[1]。色譜條件：色譜柱(RSpak KC-811昭和電氣)，島津流動(dòng)相：3 mmol/L高氯酸溶液，流速1 mL/min，柱溫：40℃，檢測(cè)波長：210 nm。另取1份上清液采用次氯酸鈉比色法測(cè)定氨態(tài)氮含量[2]。

1.2.5纖維素(carboxy methylated cellulose, CMC)酶活力的測(cè)定纖維素酶的酶活單位為1 mL酶液在50℃的條件下，每min由底物催化水解產(chǎn)生1 μg葡萄糖所需要的纖維素酶的量為一個(gè)活力單位，酶活力單位以U表示[17]。用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測(cè)定菌株酶液的還原糖含量，以還原糖的多少代表纖維素酶內(nèi)切酶活力的大小，反映菌株總酶活力的大小[18-19]。

1.3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

用Microsoft Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及多重比較(Duncan’S新復(fù)極差法)。

2結(jié)果與分析

2.1纖維素降解菌株初篩

分離純化后得到33株純菌株，其中篩選出透明圈直徑/菌落直徑≥2.0的6種真菌菌株，分別為7,11,17,21,25和36號(hào)菌株，其中21號(hào)菌株透明圈直徑/菌落直徑的比值最大，達(dá)到7.33(表3)。

2.2菌株CMC酶活力測(cè)定

將初篩得到的6種菌株進(jìn)行酶活力測(cè)定，篩選出3種羧甲基纖維素(CMC)酶活力較高的菌株，分別為11,21和36號(hào)菌株(表4)。

2.3添加菌液青貯牧草效果比較

2.3.1青貯料發(fā)酵品質(zhì)分析對(duì)篩選出來的3株酶活力較強(qiáng)的菌株，開展發(fā)酵菌液在雜交狼尾草青貯中的使

表3　降解纖維素菌在平板上的降解效果

用效果比較試驗(yàn)，經(jīng)45 d青貯，對(duì)青貯料的發(fā)酵品質(zhì)分析可以看出(表5)，各處理青貯料的pH差異不顯著(P>0.05)；處理2的氨態(tài)氮含量與CK差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于處理3(P<0.05)并顯著低于處理4(P<0.05)；從NH3-N/TN分析，處理3的NH3-N/TN最低，與CK差異不顯著(P>0.05)，且比值都小于5%，與處理2和4差異顯著(P<0.05)；處理3的乳酸含量最高，與處理2差異不顯著(P>0.05)，都顯著高于CK和處理4， 但3種菌株青貯的乳酸含量均高于CK； 3種菌株青貯的乙酸含量之間以及與CK之間差異都不顯著(P>0.05)。因此，綜合分析表明，在雜交狼尾草青貯過程中，添加纖維素降解菌能提高青貯料乳酸含量，可抑制有害菌的繁殖，改善雜交狼尾草青貯品質(zhì)；從3種菌株發(fā)酵菌液作為青貯添加劑青貯雜交狼尾草的發(fā)酵品質(zhì)分析，處理3,即21號(hào)菌株的青貯效果最好。

2.3.2營養(yǎng)成分分析從表6可以看出，各處理組DM含量差異均不顯著(P>0.05)。雜交狼尾草添加麥麩青貯后CP含量均顯著提高，處理1(CK)，2，3，4分別比青貯前提高20.02%(P<0.05)，7.37%(P<0.05)，21.19%(P<0.05)和21.19%(P<0.05), 而CK、處理3和4的CP含量又顯著高于處理2(P<0.05)。添加纖維素降解菌液進(jìn)行青貯的3個(gè)處理的NDF、ADF和HC含量均低于青貯前和CK，其中處理3含量最低，與青貯前和CK相比，處理2,3和4的NDF含量分別降低了20.6%(P<0.05)，35.01%(P<0.05)，25.07%(P<0.05)和15.34%(P<0.05)，30.69%(P<0.05)，20.08%(P<0.05)；ADF含量分別降低了21.24%(P<0.05)，38.56%(P<0.05)，35.78%(P<0.05)和6.61%(P>0.05)，27.15%(P<0.05)，23.85%(P<0.05)；HC含量分別降低了19.71%(P<0.05)，30.07%(P<0.05)，10.39%(P<0.05)和24.19%(P<0.05)，33.97%(P<0.05)，15.32%(P<0.05)；另外CK的NDF和ADF含量與青貯前相比，也分別降低了6.24%(P<0.05)和15.66%(P<0.05)。結(jié)果表明，篩選出的3種纖維素降解菌均能改善青貯料品質(zhì)，不同程度地降解了纖維素的含量，其中處理3的21號(hào)菌株的發(fā)酵液降解雜交狼尾草纖維素的效果最為明顯，添加該菌液進(jìn)行青貯的青貯料營養(yǎng)品質(zhì)最好。

表4　菌株CMC酶活力

注：同列不同字母表示差異顯著(P<0.05)，下同。

Note: Different letters in the same column mean significant differences at 0.05 level. The same below.

表5　雜交狼尾草青貯料發(fā)酵品質(zhì)分析

表6　雜交狼尾草青貯料營養(yǎng)成分分析

3結(jié)論與討論

纖維素酶作為一種高效、安全的生物催化劑，在改善飼料的營養(yǎng)價(jià)值、提高畜禽飼料的消化率和利用率等方面作用明顯。自然界中能夠產(chǎn)生降解纖維素酶及降解作物纖維素的微生物很多，因此，纖維素降解菌的篩選是纖維素酶制劑生產(chǎn)及應(yīng)用過程最基礎(chǔ)的工作。王洪媛和范丙全[6]利用多種篩選方法，獲得3株高效秸稈纖維素降解真菌，其中菌株W4(擴(kuò)張青霉，Penicilliumexpansum) 具有非常強(qiáng)的秸稈纖維素降解能力，10 d 內(nèi)對(duì)秸稈的降解率可達(dá)56.3%。對(duì)于纖維素降解酶作為添加劑在青貯上應(yīng)用，許多研究認(rèn)為纖維素降解酶可水解細(xì)胞壁的纖維素、半纖維素成為可被動(dòng)物或乳酸菌利用的糖，有利于發(fā)酵，降低青貯料中的粗纖維，同時(shí)釋放出細(xì)胞內(nèi)的各種營養(yǎng)物質(zhì)，提高有機(jī)物利用率[4,20-21]。Tengerdy等[22]在紫花苜蓿(Medicagosativa)和狗牙根(Cynodondactylon)中添加纖維素酶制劑進(jìn)行青貯，結(jié)果表明添加纖維素酶能夠顯著降低青貯料的pH 值，增加乳酸和還原性糖的含量。莊益芬等[23]在全穗期的貓尾草(Urariacrinita)中添加乳酸菌、纖維素酶、乳酸菌+纖維素酶、蟻酸進(jìn)行青貯，結(jié)果表明，添加乳酸菌提高了全穗期青貯料的干物質(zhì)，添加纖維素酶和乳酸菌+纖維素酶的處理組降低了青貯料的細(xì)胞壁成分含量。本試驗(yàn)篩選了3株酶活力高的纖維素降解菌上清液應(yīng)用于雜交狼尾草青貯，結(jié)果表明，通過添加纖維素降解菌液，均提高了青貯料的乳酸含量，有助于青貯的成功。同時(shí)也降低了NDF、ADF和HC的含量，不同程度地改善了青貯品質(zhì)，其中處理3中的21號(hào)菌株，在NH3-N/TN、乳酸、NDF、ADF和HC等諸多方面均優(yōu)于對(duì)照和其他處理，改善青貯效果最為明顯。

本試驗(yàn)利用篩選出的纖維素降解菌進(jìn)行雜交狼尾草青貯，纖維素降解菌作為生物性青貯添加劑，主要通過纖維素降解菌產(chǎn)生纖維素酶對(duì)青貯料發(fā)酵過程發(fā)揮了作用。由于纖維素酶易受溫度、pH值等多種因素的影響，很容易失活，今后將對(duì)其穩(wěn)定化處理、耐受性等理化特性以及在畜牧上的高效利用作進(jìn)一步研究。

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Screening of cellulose-degrading bacteria and evaluation of silage performance ofPennisetum

HUANG Qin-Lou1,3, ZHONG Zhen-Mei2,3, HUANG Xiu-Sheng2,3*, CHEN Zhong-Dian2,3, FENG De-Qing2,3, XIA You-Guo2

1.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350013,China; 2.AgriculturalEcologyInstitute,FujianAcademyofAgriculturalSciences,Fuzhou350013,China; 3.FujianEngineeringandTechnologyResearchCenterforRecyclingAgricultureinHillyAreas,Fuzhou350013,China

Abstract:Cellulose-degrading bacteria play important roles in improving forage quality and increasing forage utilization. In this study, a variety of cellulose-degrading bacteria were screened to identify strains with high enzyme activity. Three strains (designated as No.11, No.21, and No.36) were selected from the screening experiment and used to produce silage from hybrid Pennisetum. The four treatment groups consisted of treatment 1 (control, CK; hybrid Pennisetum without broth), and treatments 2, 3, and 4 (hybrid Pennisetum with broth of strain No.11, 21, and 36, respectively). The addition of cellulose-degrading bacteria into silage of hybrid Pennisetum increased the lactic acid content. The lactic acid contents of treatments 2, 3 and 4 were 19.42% (P<0.05), 38.35% (P<0.05), 4.85% (P>0.05) higher, respectively, than that in CK. The neutral detergent fiber (NDF), acid detergent fiber (ADF), and hemicellulose (HC) contents of silage were lower in treatments 2, 3, and 4 than in CK and in the Pennisetum mixtures before ensiling. The silage produced in treatment 3 had the lowest NDF, ADF, and HC contents. The three strains screened from many cellulose-degrading bacteria improved silage quality, and degraded cellulose to different degrees. Among the three strains, No.21 showed the best performance in degrading cellulose of hybrid Pennisetum and produced silage with the best nutritional quality.

Key words:cellulose degrading bacteria; enzyme activity; hybrid Pennisetum; silage

*通信作者

Corresponding author. E-mail：hxs706@163.com

作者簡介：黃勤樓(1964-)，男，福建閩清人，研究員，博士。E-mail: hql202@126.com

基金項(xiàng)目：“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2014BAD15B01，2012BAD14B15-03，2011BAD17B02-06)，農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201303094-04)和福建省自然基金(2013J01105)資助。

*收稿日期：2015-06-25；改回日期：2015-09-30

DOI：10.11686/cyxb2015290

http://cyxb.lzu.edu.cn

黃勤樓, 鐘珍梅, 黃秀聲, 陳鐘佃, 馮德慶, 夏友國. 纖維素降解菌的篩選及在狼尾草青貯中使用效果評(píng)價(jià).草業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 25(4): 197-203.

HUANG Qin-Lou, ZHONG Zhen-Mei, HUANG Xiu-Sheng, CHEN Zhong-Dian, FENG De-Qing, XIA You-Guo. Screening of cellulose-degrading bacteria and evaluation of silage performance ofPennisetum. Acta Prataculturae Sinica, 2016, 25(4): 197-203.