抗體減半及延長(zhǎng)標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27影響因素的探討

許文艷，楊 麟，歐陽(yáng)雁

(昆鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650302)

·經(jīng)驗(yàn)交流·

抗體減半及延長(zhǎng)標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27影響因素的探討

許文艷，楊 麟，歐陽(yáng)雁

(昆鋼醫(yī)院檢驗(yàn)科，云南昆明 650302)

目的 研究流式細(xì)胞儀(FCM)檢測(cè)外周血人類白細(xì)胞抗原B27(HLA-B27)時(shí)抗體用量及標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響。方法 應(yīng)用Beckman Coulter FC500流式細(xì)胞儀檢測(cè)患者外周血HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比，并應(yīng)用SPSS19.0軟件對(duì)抗體減量和保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的進(jìn)行分析。結(jié)果 抗體減半及樣本保存至7 d檢測(cè)外周血HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 FCM分析HLA-B27時(shí)抗體用量減半及適當(dāng)延長(zhǎng)標(biāo)本保存時(shí)間至7 d，對(duì)檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比無(wú)明顯影響。

流式細(xì)胞術(shù)； 人類白細(xì)胞抗原B27； 強(qiáng)直性脊柱炎；

流式細(xì)胞儀是一種在功能水平上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析的檢測(cè)手段，可以同時(shí)分析上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，并能從中測(cè)得多個(gè)參數(shù)。目前流式細(xì)胞分析已普遍應(yīng)用于免疫學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)、生物化學(xué)等臨床醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域[1]。應(yīng)用流式細(xì)胞儀來(lái)測(cè)定人類白細(xì)胞抗原27(HLA-B27)的表達(dá)，具有操作簡(jiǎn)單，靈敏度和特異性較高，結(jié)果穩(wěn)定等特點(diǎn)。但HLA-B27抗體價(jià)格比較昂貴，臨床標(biāo)本數(shù)量少,需集中保存后統(tǒng)一檢測(cè)。為高效合理使用抗體和集中統(tǒng)一檢測(cè)標(biāo)本，我們用抗體減半以及延長(zhǎng)保存時(shí)間至7 d分別檢測(cè)33例患者及12例患者的HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比，探討抗體減半，延長(zhǎng)標(biāo)本保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本收集 2015年10～11月收集來(lái)自云南昆鋼醫(yī)院疼痛科、風(fēng)濕免疫科及康復(fù)科門診就診及住院疑患者，采集上述人員空腹靜脈血2 mL，以乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝。

1.1.2 儀器與試劑 流式細(xì)胞儀型號(hào)：Beckman Coulter FC500；FLow-CheckTM熒光微球；HLA-B27FITC/ HLA-B7-PE抗體；同型對(duì)照為IgG2a- FITC/IgG-PE；溶血?jiǎng)镺ptiLyse C Lysing Solution；以上試劑均購(gòu)自Beckman Coulter公司。

1.2 方法

1.2.1 收集33例(其中包含9例HLA-B27陽(yáng)性和24例HLA-B27陰性)待測(cè)標(biāo)本，根據(jù)使用HLA-B27的抗體劑量不同分為兩組，分別檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比。(1)10 μL組：在試管中加入10 μL抗體，依次加入50 μL抗凝血，充分混勻后分別避光靜置20 min，加入300 μL溶血?jiǎng)┎⒘⒓礈u旋混勻，室溫避光10 min后3 000 r/min離心5 min，棄上清液后加2 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后棄上清液,加500 μL PBS平衡5 min后上機(jī)檢測(cè)；(2)20 μL組：在試管中加入 20 μL抗體，依次加入100 μL抗凝血，充分混勻后分別避光靜置20 min，加入500 μL溶血?jiǎng)┎⒘⒓礈u旋混勻，室溫避光10 min后3 000 r/min離心5 min，棄上清液后加2 mL PBS洗滌后棄上清液,加500 μL PBS平衡5 min后上機(jī)檢測(cè)。

1.2.2 收集12例(其中包含6例HLA-B27陽(yáng)性和6例HLA-B27陰性)待測(cè)標(biāo)本，根據(jù)標(biāo)本保存時(shí)間分為兩組；0 d檢測(cè)組：標(biāo)本按10 μL組的操作流程當(dāng)天上機(jī)進(jìn)行檢測(cè)；7 d檢測(cè)組：標(biāo)本放置于4 ℃冰箱保存7 d后按10 μL組的操作流程上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 抗體減量對(duì)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分率的影響 結(jié)果表明，抗體減半與抗體全量檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 不同劑量類型B27陽(yáng)性率比較

2.2 保存時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響 結(jié)果表明，當(dāng)天與樣本4℃保存1周檢測(cè)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表2 不同檢測(cè)時(shí)間B27陽(yáng)性率比較

3 討 論

強(qiáng)直性脊柱炎(AS)是脊柱及附屬組織的自身免疫性疾病，主要累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱、脊柱骨軟組織及四肢關(guān)節(jié)。流行病學(xué)研究證實(shí)AS患者中96%具有HLA-B27，而健康者僅有7%，從發(fā)病到明確診斷往往需要4～10年[2]。AS最初起病隱匿，患者脊柱或周圍關(guān)節(jié)疼痛往往與其他原因引起的脊柱或關(guān)節(jié)疼痛癥狀相似而又沒(méi)有骶髂關(guān)節(jié)炎的明確表現(xiàn)。因此，在臨床上不宜確診，僅以X線所見(jiàn)為依據(jù)，可能對(duì)一些早期病例的診斷不可靠，如果患者根據(jù)臨床資料診斷AS的概率為50%，在檢出HLA-B27時(shí)則可提高至93%，因而，結(jié)合患者癥狀與臨床上其他診斷進(jìn)行HLA-B27檢測(cè)具有十分重要的意義[3]。流式細(xì)胞術(shù)是根據(jù)直接熒光染色的原理，利用熒光標(biāo)記的抗B27的單克隆抗體和淋巴細(xì)胞表面的B27抗原結(jié)合，使細(xì)胞具有一定的熒光強(qiáng)度，這種熒光強(qiáng)度可被流式細(xì)胞儀測(cè)得的通道值反映。根據(jù)通道值的高低判斷B27抗原陽(yáng)性或陰性[4]。該方法操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確，尤其適用于大規(guī)模樣本檢驗(yàn)。本研究對(duì)抗體用量減半和抗凝標(biāo)本保存7 d對(duì)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分率的結(jié)果進(jìn)行了探討,結(jié)果表明，抗體減半以及標(biāo)本保存至7天對(duì)HLA-B27陽(yáng)性細(xì)胞百分率的檢測(cè)結(jié)果沒(méi)有影響，為醫(yī)院高效利用抗體和集中收集樣本后統(tǒng)一進(jìn)行檢測(cè)提供方便,在臨床工作中具有實(shí)際意義。

[1]王建中．臨床流式細(xì)胞分析[M]．上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2005：169-172．

[2]黎勤云，李志強(qiáng)．強(qiáng)直性脊柱炎相關(guān)HLA-B27的研究進(jìn)展[J]．中國(guó)輸血雜志，2012，25(11)：1138-1140．

[3]李娜，高文波，周玉明．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) HLA-B27最佳抗體劑量與作用時(shí)間研究[J]．國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2015，36(20)：2965-2966．

[4]李維，府偉靈，王芳，等．流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)98例獻(xiàn)血者外周血HLA-B27的臨床意義[J]．第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2003，25(8)：727-729．

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.065 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B 文章編號(hào)：1673-4130(2016)07-1008-02

2015-11-13)