自發(fā)性腦出血中紅細(xì)胞對(duì)血腦屏障通透性的影響

江雷振 史保中 葛朋莉

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 洛陽 471000 2)河南安陽地區(qū)醫(yī)院血液科 安陽 455000

自發(fā)性腦出血中紅細(xì)胞對(duì)血腦屏障通透性的影響

江雷振1)史保中1)葛朋莉2)

1)河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科 洛陽 471000 2)河南安陽地區(qū)醫(yī)院血液科 安陽 455000

目的 研究自發(fā)性腦出血(SICH)中紅細(xì)胞對(duì)血腦屏障(BBB)通透性的影響。方法 大鼠自體血腦內(nèi)注射法造成自發(fā)性腦出血模型，用腦立體定位儀向大鼠右側(cè)尾狀核注入自體全血(WB)或紅細(xì)胞(RBC)以建立SICH動(dòng)物模型。分組按照不同時(shí)間點(diǎn)(6 h、1 d、3 d、5 d)處死大鼠，處死前經(jīng)尾靜脈注射2%伊文思藍(lán)(Evans blue，EB)溶液 2 mL/kg，取標(biāo)本后用甲酰胺浸泡法檢測(cè)腦組織EB含量。結(jié)果 BBB通透性檢測(cè)腦組織EB含量：RBC、WB、SO組6 h、1 d、3 d、5 d比較，其中在RBC第1、3天組明顯高于6 h和5 d組，SICH后6 h開始升高，1 d達(dá)到高峰，3 d開始恢復(fù)，5 d有所下降(P<0.05)。結(jié)論 SICH后導(dǎo)致BBB功能障礙，紅細(xì)胞對(duì)BBB結(jié)構(gòu)破壞起至關(guān)重要的作用。

自發(fā)性腦出血；紅細(xì)胞；血腦屏障;通透性

腦內(nèi)出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是指多種原因所致的大腦內(nèi)血管破裂至腦實(shí)質(zhì)內(nèi)的出血，是臨床上致殘、致死率很高的神經(jīng)系統(tǒng)常見的疾病之一。主要包括自發(fā)性腦內(nèi)出血(spontaneous intracerebral hemorrhage，SICH)和創(chuàng)傷性腦內(nèi)出血(traumatic intracerebral hemorrhage，TICH)。前者占所有腦卒中的44%以上，后者占頭外傷的15%以上[1]。SICH在亞洲國(guó)家占腦卒中的20%～30%[2]，但病死率卻最高，主要原因之一即腦水腫。研究認(rèn)為[3]，SICH后血腫的占位效應(yīng)、周圍缺血、神經(jīng)毒性以及血腦屏障(blood brain barrier，BBB)的破壞可能在腦水腫的形成過程中起一定的作用。SICH后腦水腫是BBB通透性增高所導(dǎo)致的一種主要病理狀態(tài)，在其持續(xù)發(fā)展的病理過程中又進(jìn)一步加重BBB的損壞，因此腦水腫與BBB的狀態(tài)密切相關(guān)。研究SICH后血腫中主要成分紅細(xì)胞對(duì)腦水腫的影響以及與BBB通透性的關(guān)系，不但能為腦水腫形成的病理生理機(jī)制深入研究奠定基礎(chǔ)，也會(huì)能為臨床治療SICH后腦水腫開辟新的有效途徑。

本實(shí)驗(yàn)用鼠腦立體定向儀向大鼠右側(cè)尾狀核注射全血和紅細(xì)胞液進(jìn)行局灶性堆積制作SICH模型；在6 h、1 d、3 d、5 d 4個(gè)時(shí)段處死動(dòng)物，處死前2 h經(jīng)尾靜脈注射依文思藍(lán)(Evans Blue，EB)檢測(cè)BBB通透性，以闡明在SICH后紅細(xì)胞對(duì)BBB通透性的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 腦立體定向儀；微量注射器；牙科磨鉆；721型紫外分光光度計(jì)；電熱恒溫水浴鍋；伊文思藍(lán)；甲酰胺。

1.2 動(dòng)物分組制作模型

1.2.1 動(dòng)物分組：選用健康成年雄性清潔級(jí)SD大鼠80只，體質(zhì)量210～300 g，均由河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。將大鼠隨機(jī)分4組：紅細(xì)胞(red blood cell，RBC)組、全血(whole blood，WB)組、假手術(shù)(sham operation，SO)組、正常(normal group，NG)組，其中RBC組、WB組、SO組按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的處死時(shí)間(6 h、1 d、3 d、5 d)再分為4個(gè)亞組，每亞組5只，用于檢測(cè)腦EB含量。

1.2.2 血液標(biāo)本的制備：WB標(biāo)本的制備：麻醉成功后，用38 ℃的溫水加熱鼠尾使尾部動(dòng)脈擴(kuò)張，從尾尖2 cm處剪斷，用EP管取動(dòng)脈血1 mL，以備用。RBC標(biāo)本的制備：應(yīng)用Xi等[4]的方法制RBC，將1 mL股動(dòng)脈血依次：①500 r/min離心操作15 min；②移除離心管中上半層的血漿和RBC上的薄層乳糜狀物質(zhì)；③在剩余的RBC中加入5倍RBC體積的等滲鹽水，500 r/min離心操作7 min，移去上清液；④將步驟③再重復(fù)2次，即得RBC；⑤將所得的RBC加等量等滲鹽水，備用。

1.2.3 麻醉及SICH模型制作手術(shù)方法：① RBC組模型手術(shù)：根據(jù)大鼠體質(zhì)量，用2%戊巴比妥鈉按2 mL/kg行腹腔內(nèi)注射麻醉。麻醉成功后，俯臥位固定。調(diào)整立體定向儀，剃毛消毒，頭部正中縱形切口長(zhǎng)約1.0 cm，確定右側(cè)尾狀核位置(參照包新民等主編《大鼠腦立體定位圖譜》)，即前囟前0.2 mm，正中線旁開3 mm，顱骨鉆孔，直徑約1 mm，微量注射器將大鼠自體紅細(xì)胞液50 μL以10 μL/min的速度推注入腦(進(jìn)針深度達(dá)硬膜下6 mm)，留針5 min后緩慢拔針。骨蠟封骨孔間斷縫切口，消毒。② WB組制作：同RBC組方法，注射全血50 μL。③ SO組模型制作：同RBC組模型方法，進(jìn)針后不往腦內(nèi)注射任何液體，留針5 min。④ NG組麻醉成功后，不做處理，直接斷頭取材。

1.3 采集標(biāo)本 在RBC、WB、SO 的3組模型完成后，按6 h、1 d、3 d、5 d時(shí)間點(diǎn)對(duì)各組大鼠處死并取材。

1.4 檢測(cè)方法與指標(biāo) 采用甲酰胺浸泡法[5]檢測(cè)腦組織中EB含量。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：用精確度為0.1 mg的電子天平稱取5 mg的EB加到25 mL容量瓶中，將等滲鹽水加至25 mL，充分搖勻后用移液管吸取0.3 mL，加入到5.7 mL甲酰胺溶液里配置成第一管標(biāo)準(zhǔn)液，然后用移液管吸取第一管標(biāo)準(zhǔn)液3 mL，再加入3 mL甲酰胺溶液。如此程序依次配制8管標(biāo)準(zhǔn)液，其所含伊文思藍(lán)(EB)的量依次是20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.15625 μg/mL。加橡塞密封后置入37 ℃水浴鍋中孵育24 h。依次編號(hào)加入比色皿中，用紫外光光度計(jì)比色，測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)管中相應(yīng)的光密度值(X)，并求出其與伊文思藍(lán)(EB)含量(Y)的直線回歸方程Y=29.029X-0.1178(R2=0.9999，P<0.001)。

應(yīng)用甲酰胺浸泡法檢測(cè)腦組織中EB的含量評(píng)定BBB損傷的程度。腦組織EB含量(μg/g濕腦)=A×甲酰胺量(mL)/腦組織濕質(zhì)量(g)，其中A為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程求得的樣本伊文思藍(lán)(EB)的含量，結(jié)果以μg/g表示。

檢測(cè)組在相應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)處死前經(jīng)尾靜脈注射2% EB溶液 2 mL/kg，觀察眼結(jié)膜、暴露皮膚、四肢等處在數(shù)秒后被藍(lán)染，表示注射EB的成功。2 h后灌注并斷頭取腦，冠狀面切開取血腫周圍腦組織約100 mg，用濾紙吸除表面水分，稱取濕質(zhì)量后，置于含5 mL甲酰胺溶液的試管中，加塞密封，37 ℃水浴鍋中孵育48 h，離心取上清液，加入比色皿中，用721型紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為632 nm處進(jìn)行比色，測(cè)定其光密度(OD)值。根據(jù)預(yù)先設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各組大鼠腦組織中EB含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 21.0對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，計(jì)量資料2組間采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評(píng)分 待大鼠自然蘇醒，按照Bederson評(píng)分法[6]判定制作的腦出血斷模型是否成功(Ⅰ級(jí)：將大鼠尾巴提起，正常側(cè)前肢向地面伸展，癱瘓側(cè)前肢則回并收屈曲于腹下；Ⅱ級(jí)：除有Ⅰ級(jí)體征外，向癱瘓側(cè)推大鼠時(shí)阻力較健側(cè)明顯減低；Ⅲ級(jí)：除有以上體征外，SD大鼠活動(dòng)時(shí)軀體向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn))。

2.2 各組腦組織EB含量的變化 見表1。

2.2.1 組間比較：RBC組和WB組在第1天時(shí)EB含量明顯高于SO組和NG組(P<0.05)，RBC組稍高于WB組(P<0.05)，而WB組亦明顯高于SO組和NG組(P<0.05)，RBC組高于WB組(P<0.05)。

2.2.2 組內(nèi)比較：RBC組第1天明顯高于6 h、5 d(P<0.01)，稍高于3 d；RBC組第3天高于6 h、5 d(P<0.01)，RBC組第5天高于6 h(P<0.01)；WB組第1天明顯高于6 h、5 d(P<0.01)，稍高于3 d，WB組第3天高于6 h 、5 d(P<0.01)，WB組第5天高于6 h(P<0.05)；SO以及NG組內(nèi)相比無明顯變化(P>0.05)。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)腦組織EB含量的變化±s)

3 討論

3.1 動(dòng)物模型制作的意義 本課題主要探索SICH中紅細(xì)胞與BBB通透性的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)所選用的SD大鼠，因其與人類大腦發(fā)育以及結(jié)構(gòu)形式基本近似[7-8]，最有利于研究本課題的基本條件，且價(jià)格低廉易于飼養(yǎng)，模擬人的SICH好發(fā)部位——尾狀核的基底節(jié)區(qū)，定位也較容易。研究提示[9]，制作SICH模型時(shí)注入1 μL自體血相當(dāng)于人類腦出血約0.75 mL。本研究課題注入50 μL制造相當(dāng)于人類大腦約30 mL的出血量，從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以肯定制作的動(dòng)物模型是符合實(shí)驗(yàn)要求標(biāo)準(zhǔn)的。因此，本課題所選用大鼠自體血腦內(nèi)注射法制作SICH動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的成功，更符合模擬人類SICH的各項(xiàng)病理學(xué)特征。

3.2 SICH中紅細(xì)胞對(duì)BBB功能的影響 通過檢測(cè)腦組織EB含量，說明SICH后BBB通透性改變程度。EB作為染料制劑，與血漿白蛋白具有很高的親和力，因此其常作為一種示蹤劑在神經(jīng)科學(xué)研究中檢測(cè)觀察BBB的通透性。正常情況下，血漿白蛋白無法穿過BBB，所以向血管內(nèi)注入EB使血液染色，如果神經(jīng)系統(tǒng)中的BBB是完整的，血液中的EB無法通過BBB進(jìn)入腦組織，則無法使腦組織藍(lán)染；如果BBB結(jié)構(gòu)被破壞，EB可以通過BBB進(jìn)入腦組織而使之著色藍(lán)染。所以，通過檢測(cè)腦組織中EB的含量，證明BBB通透性的變化，進(jìn)而反映SICH后腦水腫的嚴(yán)重程度與BBB破壞的關(guān)系[10-11]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，RBC組、WB組、SO組在SICH后的第6小時(shí)，腦組織中的EB含量開始升高；SICH后第1天時(shí)，RBC組EB含量最高達(dá)(161.607±6.376)μg/g，比其他各分組明顯高；SICH后第3天時(shí)，RBC組EB含量仍處于較高水平，但已經(jīng)趨于平穩(wěn)；SICH第5天時(shí)各組EB含量已開始下降，但仍高于其他時(shí)間點(diǎn)。WB組在SICH后第1天時(shí)，EB含量顯示最高，可達(dá)(154.35±4.658)μg/g，明顯高于假手術(shù)組；在第3天時(shí)趨于平穩(wěn)，但仍較高，在SICH第5天時(shí)EB含量開始下降，可以看出WB組與RBC組的EB含量呈動(dòng)態(tài)變化，但WB組各時(shí)間點(diǎn)均低于紅細(xì)胞組。而SO組、NG組EB含量在各時(shí)間點(diǎn)均無明顯變化。4組EB含量比較發(fā)現(xiàn)，RBC組1 d明顯比SO組、NG組高(P<0.01)，WB-1 d組高于SO-1 d組(P<0.05)，RBC-1 d組比WB-1 d組含量高(P<0.05)，SO組、NG組比較無顯著差異(P>0.05)。提示RBC-1 d組的腦組織EB含量比其他各分組明顯增高。

在SICH后血腫中的RBC所產(chǎn)生的毒性物質(zhì)與BBB的通透性之間關(guān)系密切，呈正相關(guān)。說明BBB的通透性的改變對(duì)SICH后腦水腫的形成起至關(guān)重要的作用，研究和了解BBB通透性與血腫中RBC之間的關(guān)系，認(rèn)識(shí)其在健康和疾病時(shí)的功能改變對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的預(yù)防和治療具有重要的臨床意義。

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(收稿 2015-03-12)

河南科技大學(xué)青年科學(xué)基金(項(xiàng)目編號(hào)：2010QN0037)

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A

1673-5110(2016)07-0021-02