神經(jīng)干細(xì)胞移植減少腦出血大鼠神經(jīng)功能的凋亡

祁紹艷 祁 景 劉曉靜 劉小軍

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450014

神經(jīng)干細(xì)胞移植減少腦出血大鼠神經(jīng)功能的凋亡

祁紹艷 祁 景 劉曉靜 劉小軍

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科 鄭州 450014

目的 探討神經(jīng)干細(xì)胞移植對腦出血大鼠神經(jīng)功能的影響。方法 采用立體定位儀制作腦出血大鼠模型，隨機將大鼠分為sham組、ICH組及NSCs組，通過mNSS評分定量評價細(xì)胞移植后，觀察腦出血大鼠在第1、3、7、14、28天的神經(jīng)功能的行為學(xué)的動態(tài)變化；進(jìn)行Caspase-3的免疫組織化學(xué)及灰度分析，觀察其表達(dá)情況。結(jié)果 NSCs組mNSS評分在14、28 d均較ICH組明顯改善(P<0.05)。NSCs組大鼠腦血腫周圍組織的Caspase-3的表達(dá)水平較ICH組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論 NSCs移植能有效改善腦出血大鼠的神經(jīng)功能評分，其機制可能是通過調(diào)節(jié)Caspase-3的表達(dá)減少細(xì)胞凋亡。

NSCs；腦出血；凋亡

腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)是一種高的病死率及高致殘率的嚴(yán)重威脅人類健康的重大疾病，目前尚無有效的辦法治療腦出血引起的嚴(yán)重神經(jīng)功能障礙，干細(xì)胞移植治療是目前腦出血研究的主要方向之一，但干細(xì)胞移植治療腦出血的機制仍不明確[1]。本文對NSCs移植治療腦出血在細(xì)胞凋亡方面的機制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 動物：SD大鼠的飼養(yǎng)及相關(guān)實驗程序均經(jīng)過鄭州大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。選取SPF級雄性SD大鼠30只(250～300 g)均來自河南省實驗動物中心提供；細(xì)胞：NSCs為本實驗室自已保存。

1.2 主要試劑和儀器 DMEM、DMEM/F12、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液(Pen-Strep solution)，抗體Caspase-3(美國invitrogen公司)；DMSO、Polyrene(sigma公司)；胎牛血清(hyclone公司)；Ⅶ型膠原酶(sigma公司)，鼠腦立體定位儀(日本Narishige SN-3公司)，DAB試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；倒置顯微鏡(德國LEICA公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物的分組及動物模型的制作：隨機選取雄性SD大鼠30只分為sham組(立體定位儀定位穿刺但不打入Ⅶ型膠原酶)10只，ICH模型組(立體定位儀定位穿刺并打入Ⅶ型膠原酶)10只，NSCs干預(yù)組(模型鑒定成功后24 h內(nèi)采用立體定位儀定位穿刺立體定位注射NSCs)10只，模型制作方法：將大鼠俯臥位固定在大鼠腦立體定位儀上，參照George Paxinos大鼠腦立體定位圖譜[2]，取大鼠左側(cè)紋狀體為定位點，選取前囟后0.2 mm，左側(cè)旁開3 mm，垂直進(jìn)針6 mm。以10 μL微量進(jìn)樣器緩慢注入0.5 U(2 μL)Ⅶ型膠原酶溶液，留針10 min，之后緩慢退針。針退出后，清潔創(chuàng)面，縫合頭皮。術(shù)后24 h進(jìn)行mNSS評分，納入8～12分的大鼠。

1.3.2 NSCs細(xì)胞的培養(yǎng)：將復(fù)蘇的NSCs(本實驗室保存)傳代直至達(dá)到移植細(xì)胞數(shù)(1×106L-1)。

1.3.3 大鼠的神經(jīng)功能評分：采用mNSS(modified neurological severity scores)評分評價大鼠神經(jīng)功能缺損和恢復(fù)情況[3]，各組大鼠分別在術(shù)后1、3、7、14、28 d進(jìn)行評分。

1.3.4 組織的取材、切片及染色：造模后28 d分別提取各組大鼠的腦組織標(biāo)本，采取多聚甲醛灌注固定法固定大鼠腦組織，進(jìn)行梯度蔗糖脫水以后進(jìn)行冰凍冠狀切片(厚12 mm)；各組切片分別進(jìn)行Caspase-3的免疫組織化學(xué)染色。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能評分 注射膠原酶大鼠腦出血后，24 h內(nèi)大鼠迅速出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損的表現(xiàn)，其癥狀體征在造模術(shù)后1～3 d達(dá)到高峰，隨后隨時間延長逐漸恢復(fù)。NSCs組較模型組術(shù)后14、28 d的mNSS評分均較低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組各時間點mNSS評分比較

2.2 免疫組化染色陽性細(xì)胞 光學(xué)顯微鏡下觀察為胞漿被染為棕褐色或棕黃色、淡黃色顆粒狀，Caspase-3在NSCs組較假手術(shù)組，與模型組表達(dá)減少 (圖1)。NSCs組與假手術(shù)組的陽性細(xì)胞數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 Caspase-3免疫組化染色 A：假手術(shù)組；B：模型組；C：NSCs組(400×)

圖2 NSCs組較ICH組Caspase-3的灰度值明顯降低

3 討論

腦出血是一種具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率嚴(yán)重影響患者神經(jīng)功能障礙的疾病。多數(shù)患者預(yù)后均遺留不同程度的神經(jīng)功能障礙[4]，目前尚無針對腦出血后神經(jīng)功能障礙確切有效的治療手段。干細(xì)胞治療腦出血成為治療腦出血的研究方向，但其治療機制尚不明確。本實驗采用向大鼠紋狀體立體定位注入膠原酶的方法，制作大鼠腦出血模型，模型成功后出現(xiàn)典型的大鼠神經(jīng)功能缺損的癥狀，可持續(xù)1～3 d，隨后有不同程度的功能恢復(fù)，假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損的癥狀。我們將NSCs移植入ICH大鼠腦內(nèi)，觀察其治療效果。NSCs組自第14天起，mNSS評分優(yōu)于模型組，第14、28天評分顯著優(yōu)于模型組。行為學(xué)表明NSCs移植具有明確的治療作用。

腦出血引發(fā)機體的三種明顯的病理變化：神經(jīng)細(xì)胞及膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡，血管源性腦水腫，以及血腦屏障破壞。但腦出血出現(xiàn)的病理變化的確切機制目前還未確定，近來的研究表明Caspase-3可激活特定的信號系統(tǒng)，產(chǎn)生核皺縮、DNA片段形成等凋亡現(xiàn)象，繼而調(diào)控著細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展[5]。此外，研究報道，Caspase-3還可以通過破壞細(xì)胞抗凋亡因素(如bcl-2)破壞細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，如結(jié)構(gòu)蛋白actin、fodrin、lamin。通過本實驗可以觀察到NSCs組的Caspase-3表達(dá)較ICH組明顯減少。Caspase-3的激活在腦出血后神經(jīng)細(xì)胞的凋亡過程中起著極為重要的調(diào)控作用。NSCs是一種神經(jīng)干細(xì)胞[6]，具有可以替代凋亡神經(jīng)細(xì)胞的功能，同時也可以通過調(diào)控Caspase-3的表達(dá)，從而減少組織細(xì)胞的凋亡，繼而促進(jìn)大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實驗以ICH模型大鼠為研究對象，采用NSCs移植治療。研究表明，NSCs移植能有效改善ICH模型大鼠的神經(jīng)功能障礙，其作用機制可能與調(diào)控凋亡有關(guān)。

[1] Han N, Ding SJ, Wu T, et al.Correlation of free radical level and apoptosis after intracerebral hemorrhage in rats[J].Neurosci Bull, 2008,24(12):351-358.

[2] Marchetto MC, Winner B, Gage FH.Pluripotent stem cells in neurodegenerative and neurodevelopmental diseases[J].Human Molecular Genetics, 2010,19(1):71-76.

[3] Jeong SW, Chu K, Jung KH, et al.Human neural stem cell transplantation promotes functional recovery in rats with experimental intracerebral hemorrhage[J].Stroke, 2003,34(9):2258-2263.

[4] Steiner T, B?sel J.Options to restrict hematoma expansion after spontaneous intracerebral hemorrhage[J].Stroke, 2010,41(21):402-409.

[5] Uccelli AF, Laroni BA, Giunti D.Neuroprotective features of mesenchymal stem cells[J].Best Pract Res Clin Haematol, 2011,24(1):59-64.

[6] 祁景,劉小軍,周明鍇.神經(jīng)干細(xì)胞移植減輕ICH 模型大鼠神經(jīng)功能障礙[J].中國實用神經(jīng)疾病雜志,2015,18(13):49-50.

(收稿 2015-03-21)

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1673-5110(2016)07-0076-02