薯蕷皂苷對糖尿病腎病大鼠TLR4/NF-κB/TNF-α 通路及腎間質淋巴細胞浸潤的影響

路 琪 李菲菲 孫虹燕 （淄博市中西醫(yī)結合醫(yī)院腎病內分泌科，淄博 255000）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）是糖尿病導致的一種全身慢性微血管并發(fā)癥，可造成蛋白尿、糖脂代謝紊亂、腎組織細胞變性死亡、毛細血管損傷等癥狀，引發(fā)慢性腎功能不全，病情進展到最后，患者會死于終末期腎衰竭［1-2］。DN 發(fā)病機制復雜，巨噬細胞浸潤造成的腎間質損傷是引發(fā)腎衰竭的主要病理因素，炎癥反應在其中發(fā)揮著關鍵作用［3-4］。TLR4/NF-κB/TNF-α 信號對氧化應激和炎癥反應具有重要的調控作用，下調其通路蛋白表達，可抑制炎癥細胞因子的上調，減輕缺血再灌注引發(fā)的氨基酸神經(jīng)毒性，保護腦組織，還可通過抑制炎癥改善結腸炎大鼠癥狀［5-6］；另外通過抑制TLR4/NFκB/TNF-α 信號激活可減輕高糖誘導的腎組織氧化應激、炎癥、細胞外基質積累和系膜細胞增殖，緩解DN 病情進展［7］，因而抑制TLR4/NF-κB/TNF-α 信號是減輕腎間質淋巴細胞浸潤，改善DN 臨床癥狀的潛在治療手段。薯蕷皂苷是傳統(tǒng)中草藥薯蕷中的主要活性成分，可抗腫瘤、降血糖、消炎、減輕過氧化水平，對心腦腎等器官的缺血再灌注損傷、潰瘍性結腸炎、肝臟纖維化和類風濕關節(jié)炎等炎癥病癥具有較好的療效［8］；以薯蕷皂苷處理雙側卵巢切除誘導的心臟功能損傷小鼠，可下調炎癥因子TNF-α、IL-6 和IL-1β 表達，改善血脂紊亂，修復心臟功能［9］。由此可推測，薯蕷皂苷可能通過抑制炎癥而改善DN 大鼠癥狀。本研究通過構建DN 大鼠模型，探討薯蕷皂苷對DN 大鼠TLR4/NF-κB/TNF-α 通路及腎間質淋巴細胞浸潤的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD 雄性大鼠，生產(chǎn)許可SCXK（滬）2018-0003，上海靈暢生物科技有限公司，SPF級，體質量180～220 g。在淄博市中西醫(yī)結合醫(yī)院動物中心飼養(yǎng)，動物房內相對濕度55%，溫度25 ℃，12 h/12 h明暗交替照明，噪音<80分貝，通風良好。

1.1.2 主要藥品及試劑 薯蕷皂苷（貨號SND-522），滁州仕諾達生物科技有限公司；鏈脲佐菌素（貨號MC17049），上海明萱生物科技有限公司；二甲雙胍（貨號A0003），北京麥瑞博生物科技有限公司；HE 染色試劑盒（貨號G1120-10），上海信帆生物科技有限公司；細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒（貨號78833），美國Thermo Fisher Scientific 公司；大鼠IL-8 ELISA 試劑盒（CK-E30583），武漢益普生物科技有限公司；大鼠TNF-α ELISA 試劑盒（ab100785）、兔源LFA-1 一抗（ab186873）、兔源TLR4 一抗（ab214185）、兔源PCNA 一抗（ab18197）、兔源NF-κB p65 一抗（ab16502）、兔源GAPDH 一抗（ab181602）、兔源TNF-α 一抗（ab66579）、羊抗兔二抗（貨號ab150077），英國Abcam 公司；大鼠二步法免疫組織化學試劑盒（貨號ZLI-9017），北京中杉金橋公司；BCA 試劑盒（貨號PC0020），北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3 主要實驗儀器 BIOSEN C_Line 血糖儀（北京德?？悼瀑Q有限公司）；BS-280 全自動生化分析儀、MR-96A 酶標儀（南京貝登醫(yī)療股份有限公司）；1X70 光學倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；YGQ-3126F 輪轉式切片機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司）；Mini PROTEAN 蛋白電泳儀、Power-pac 3000轉膜儀（美國伯樂公司）；ImageMaster 凝膠成像分析儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型建立及分組給藥 制備DN 模型大鼠的方法參照文獻［10］：取SD 大鼠，使用高脂高糖飼料喂養(yǎng)8 周后，以30 mg/kg 的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素溶液1次，2周后重復注射1次，4周后測量血糖，若測量結果至少2 次>16 mmol/L，且以代謝籠收集的24 h 尿液中尿蛋白含量>30 mg，表明DN 模型大鼠構建成功。共使用64 只SD 大鼠造模，成功60只，隨機分為模型組、二甲雙胍（140 mg/kg）組、薯蕷皂苷低（10 mg/kg）、中（20 mg/kg）、高（40 mg/kg）劑量組，每組12只，另取12只SD大鼠使用普通飼料喂養(yǎng)8周后，腹腔注射等量生理鹽水，設為對照組。

以生理鹽水溶解薯蕷皂苷和二甲雙胍，分別配制為2.5、5、10 mg/ml 的薯蕷皂苷藥液［11］，14 mg/ml的二甲雙胍藥液，薯蕷皂苷各劑量組分別以10、20、40 mg/kg 的劑量灌胃給藥，二甲雙胍組以140 mg/kg的劑量灌胃給藥［12］，模型組和對照組以同量的生理鹽水灌胃，每天上午給藥1次，共給藥21次。

1.2.2 血糖、24 h尿蛋白含量檢測及標本采集 大鼠在用藥結束后，以代謝籠收集其24 h 尿液，以全自動生化分析儀測定其中尿蛋白含量；然后以乙醚麻醉大鼠，通過注射器從尾靜脈采血4 ml，取1 ml使用血糖儀測量其中血糖水平；剩余血液經(jīng)4 ℃離心（15 min，3 000 r/min）后，上清液放入?80 ℃冰箱中保存。開腹取出腎臟，取0.5 g 腎組織，剪為小碎塊后，勻漿，以細胞核蛋白與細胞漿蛋白抽提試劑盒提取胞漿蛋白和核內蛋白（操作步驟按照試劑盒說明書進行），均放入?80 ℃冰箱中保存；剩余腎組織放入生理鹽水中洗滌干凈，再經(jīng)10%甲醛固定、30%蔗糖脫水、二甲苯透明后，以石蠟對其進行包埋，使用切片機進行切片，得到厚3 μm的連續(xù)病理切片。

1.2.3 大鼠腎組織病理形態(tài)和腎間質淋巴細胞浸潤情況檢測 取1.2.2 中的腎組織切片，以二甲苯進行脫蠟處理后，依次置于100%、85%、70%的梯度乙醇溶液中浸泡，每只大鼠選取3張切片進行HE染色；另選取3 張切片，置于LFA-1 一抗溶液中孵育，4 ℃過夜后，以PBS 緩沖液洗滌，再加入二抗溶液，進行免疫組織化學染色。上述切片均以PBS緩沖液洗滌、30%蔗糖脫水、二甲苯透明后封片，在光學顯微鏡下觀察腎組織病理形態(tài)和LFA-1 陽性細胞比例，具體操作按照各自試劑盒說明書進行。

1.2.4 腎功能及炎癥因子水平檢測 提前取出

1.2.2 中的血清，放入4 ℃冰箱中解凍，取500 μl，以全自動生化分析儀檢測血清肌酐（Serum creatinine，Scr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）水平；剩余血清以ELISA法測量其中炎癥因子（TNF-α、IL-8）水平，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.2.5 大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α 通路相關蛋白表達檢測 提前取出1.2.2 中的蛋白樣品液，放入冰水浴中解凍，以BCA 法測定其中蛋白總濃度（操作步驟按照試劑盒說明書進行），100 ℃煮沸5 min，蛋白變性后，各組分別取含20 μg總蛋白的樣品液，加入SDS-PAGE凝膠中，在110 V恒壓下，電泳后濕轉，將分離蛋白轉移到硝酸纖維膜上，將膜以5%脫脂牛奶溶液室溫封閉處理2 h，剪下目的蛋白，分別以兔源TLR4、NF-κB p65、TNF-α、GAPDH、PCNA 一抗溶液孵育，4 ℃過夜后以TBST 溶液漂洗，以羊抗兔二抗溶液室溫孵育，2 h 后以TBST 溶液漂洗，膜上滴加ECL 顯色液，使蛋白條帶顯影，使用凝膠成像分析儀拍照后，通過Image-J軟件分析條帶灰度值，得出各組目的蛋白相對表達。

1.3 統(tǒng)計學分析 以統(tǒng)計軟件SPSS24.0分析實驗數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩之間進一步比較行LSD-t檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 薯蕷皂苷對大鼠血糖、24 h 尿蛋白含量的影響 與對照組相比，模型組大鼠血糖、24 h尿蛋白含量明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血糖、24 h 尿蛋白含量降低（P<0.05），且薯蕷皂苷各組呈劑量依賴性（P<0.05）。薯蕷皂苷高劑量組與二甲雙胍組相比，血糖、24 h 尿蛋白含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表1。

表1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白含量（±s，n=12）Tab.1 Content of blood glucose and 24 h urinary protein of rats in each group（±s，n=12）

表1 各組大鼠血糖、24 h尿蛋白含量（±s，n=12）Tab.1 Content of blood glucose and 24 h urinary protein of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with diosgenin low-dose group，3）P<0.05；compared diosgenin medium-dose group，4）P<0.05.

24 h urinary protein/mg 4.08±0.63 64.15±9.471）46.12±6.142）23.29±4.362）3）4.97±0.692）3）4）5.01±0.712）3）4）Groups Control Model Diosgenin low-dose Diosgenin medium-dose Diosgenin high-dose Metformin Blood glucose/（mmol·L?1）5.04±0.72 27.38±4.031）20.15±2.582）12.37±1.922）3）5.85±0.842）3）4）5.94±0.732）3）4）

2.2 薯蕷皂苷對大鼠腎功能指標（BUN、Scr）的影響 與對照組相比，模型組大鼠腎功能指標（BUN、Scr）明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎功能指標（BUN、Scr）降低（P<0.05），且薯蕷皂苷各組呈劑量依賴性（P<0.05）。薯蕷皂苷高劑量組與二甲雙胍組相比，腎功能指標（BUN、Scr）差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），見表2。

表2 各組大鼠腎功能指標（±s，n=12）Tab.2 Renal function indexes of rats in each group（±s，n=12）

表2 各組大鼠腎功能指標（±s，n=12）Tab.2 Renal function indexes of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with diosgenin low-dose group，3）P<0.05；compared diosgenin medium-dose group，4）P<0.05.

Scr/（μmol·L?1）51.02±3.92 92.15±7.301）81.17±6.922）66.05±5.382）3）51.73±4.032）3）4）51.85±4.072）3）4）Groups Control Model Diosgenin low-dose Diosgenin medium-dose Diosgenin high-dose Metformin BUN/（mmol·L?1）4.56±0.61 32.82±3.971）24.71±3.022）13.86±2.642）3）5.10±0.672）3）4）5.21±0.752）3）4）

2.3 薯蕷皂苷對大鼠腎組織病理改變的影響 對照組大鼠腎組織形態(tài)完整清晰，無病理改變。模型組大鼠腎組織充血、水腫，腎小球皺縮嚴重，系膜基質增生，間質可見明顯炎癥淋巴細胞浸潤，顯示明顯病理損傷。與模型組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷均呈現(xiàn)不同程度減輕，且隨薯蕷皂苷劑量升高，病理損傷減輕程度增加，薯蕷皂苷高劑量組與二甲雙胍組大鼠腎組織病理損傷減輕程度最高，幾乎恢復正常，且兩者相比，病理形態(tài)無顯著性差異，見圖1。

圖1 各組大鼠腎組織病理形態(tài)的HE染色結果（×400）Fig.1 HE staining results of renal pathological morphology of rats in each group（×400）

2.4 薯蕷皂苷對大鼠腎組織間質中浸潤的LFA-1陽性細胞比例的影響 與對照組相比，模型組大鼠腎組織間質中浸潤的LFA-1陽性細胞比例明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織間質中浸潤的LFA-1陽性細胞比例降低（P<0.05），且薯蕷皂苷各組呈劑量依賴性（P<0.05）。薯蕷皂苷高劑量組與二甲雙胍組相比，腎組織間質中浸潤的LFA-1 陽性細胞比例差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖2、表3）。

表3 各組大鼠腎組織間質中浸潤的LFA-1 陽性細胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of LFA-1 positive cells infiltrating in renal interstitial tissue of rats in each group（±s，n=12）

表3 各組大鼠腎組織間質中浸潤的LFA-1 陽性細胞比例（±s，n=12）Tab.3 Proportion of LFA-1 positive cells infiltrating in renal interstitial tissue of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with diosgenin low-dose group，3）P<0.05；compared diosgenin medium-dose group，4）P<0.05.

Proportion of LFA-1 positive cells/%2.03±0.40 40.56±4.321）29.25±3.012）14.32±2.162）3）2.21±0.372）3）4）2.26±0.412）3）4）Groups Control Model Diosgenin low-dose Diosgenin medium-dose Diosgenin high-dose Metformin

圖2 各組大鼠腎組織間質中浸潤的LFA-1 陽性細胞的免疫組織化學染色結果（×400）Fig.2 Immunohistochemical staining results of LFA-1 positive cells infiltrating in renal interstitium of rats in each group（×400）

2.5 薯蕷皂苷對大鼠血清炎癥因子（TNF-α、IL-8）水平的影響 與對照組相比，模型組大鼠血清炎癥因子（TNF-α、IL-8）水平明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠血清炎癥因子（TNF-α、IL-8）水平降低（P<0.05），且薯蕷皂苷各組呈劑量依賴性（P<0.05）。薯蕷皂苷高劑量組與二甲雙胍組相比，大鼠血清炎癥因子（TNF-α、IL-8）水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，表4）。

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平（±s，n=12）Tab.4 Levels of serum inflammatory factors in rats of each group（±s，n=12）

表4 各組大鼠血清炎癥因子水平（±s，n=12）Tab.4 Levels of serum inflammatory factors in rats of each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with diosgenin low-dose group，3）P<0.05；compared diosgenin medium-dose group，4）P<0.05.

IL-8/（pg·L?1）41.02±4.34 89.75±15.301）75.10±11.592）58.38±8.172）3）42.32±4.522）3）4）42.47±4.832）3）4）Groups Control Model Diosgenin low-dose Diosgenin medium-dose Diosgenin high-dose Metformin TNF-α/（pg·L?1）34.73±3.72 95.67±17.231）76.52±14.732）53.47±10.762）3）35.32±4.012）3）4）35.47±4.252）3）4）

2.6 薯蕷皂苷對大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α通路相關蛋白表達的影響 與對照組相比，模型組大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α 通路相關蛋白TLR4、核內NF-κB p65、TNF-α 表達水平明顯升高（P<0.05）。與模型組相比，薯蕷皂苷低、中、高劑量組及二甲雙胍組大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α 通路相關蛋白TLR4、核內NF-κB p65、TNF-α表達水平明顯降低（P<0.05），且薯蕷皂苷各組呈劑量依賴性（P<0.05）。薯蕷皂苷高劑量組與二甲雙胍組相比，各蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05，圖3、表5）。

圖3 各組大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α 通路相關蛋白表達的Western blot檢測結果Fig.3 Western blot results of TLR4/NF-κB/TNF-α path?way related protein expression in renal tissue of rats in each group

表5 各組大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α 通路相關蛋白相對表達水平（±s，n=12）Tab.5 Relative expression levels of TLR4/NF-κB/TNF-α pathway related proteins in renal tissues of rats in each group（±s，n=12）

表5 各組大鼠腎組織TLR4/NF-κB/TNF-α 通路相關蛋白相對表達水平（±s，n=12）Tab.5 Relative expression levels of TLR4/NF-κB/TNF-α pathway related proteins in renal tissues of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with control group，1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05；compared with diosgenin low-dose group，3）P<0.05；compared diosgenin medium-dose group，4）P<0.05.

Groups Control Model Diosgenin low-dose Diosgenin medium-dose Diosgenin high-dose Metformin TLR4/GAPDH 0.19±0.06 1.37±0.311）0.83±0.242）TNF-α/GAPDH 0.17±0.05 1.31±0.281）0.79±0.202）Nuclear NF-κB p65/PCNA 0.20±0.06 1.34±0.271）0.98±0.252）0.49±0.112）3）0.47±0.092）3）0.43±0.082）3）0.21±0.052）3）4）0.23±0.072）3）4）0.20±0.042）3）4）0.21±0.052）3）4）0.19±0.042）3）4）0.21±0.072）3）4）

3 討論

糖尿病患者的血糖長期處于高水平，而腎臟組織在高血糖狀態(tài)下，可發(fā)生微血管損傷、系膜細胞增殖、血流動力學異常、細胞外基質大量積累等病理變化，其中腎間質淋巴細胞浸潤誘導的炎癥反應是高糖引發(fā)的上述腎損傷的關鍵因素，因而抑制炎癥，減輕腎間質淋巴細胞浸潤，是緩解DN 病情進展的有效治療手段［13-15］。LFA-1 是一種淋巴細胞功能相關抗原，其表達水平可反映炎癥反應中淋巴細胞的浸潤情況［16］。本研究通過喂養(yǎng)高脂高糖飼料后腹腔注射鏈脲佐菌素的方法構建DN 大鼠模型，結果顯示，大鼠經(jīng)上述處理后，其腎組織充血、水腫，腎小球皺縮嚴重，系膜基質增生，間質可見明顯炎癥淋巴細胞浸潤，顯示明顯病理損傷，血糖、24 h 尿蛋白含量、Scr、BUN、TNF-α 及IL-8水平、LFA-1陽性細胞比例明顯升高，表明DN 模型大鼠血糖升高，引發(fā)腎組織炎癥反應，造成腎間質淋巴細胞浸潤，損傷腎功能，揭示模型建立成功。

薯蕷皂苷是提取自藥用植物薯蕷的皂甙類成分，具有明顯的抗炎作用，可下調炎癥細胞因子表達，抑制炎癥反應，降低過敏性哮喘小鼠肺組織炎癥細胞浸潤，改善其臨床癥狀，修復肺功能，因而可推測薯蕷皂苷可能通過減輕炎癥而改善DN 引發(fā)的腎間質淋巴細胞浸潤，緩解其病情進展［17-18］。本研究以不同劑量的薯蕷皂苷處理DN 模型大鼠，結果顯示，相比模型組，大鼠經(jīng)處理后，其腎組織病理損傷均減輕，且隨薯蕷皂苷劑量升高，病理損傷減輕程度增加，另外大鼠血糖、24 h 尿蛋白含量、Scr、BUN、TNF-α 及IL-8 水平、LFA-1 陽性細胞比例降低，且薯蕷皂苷各組之間呈劑量依賴性，表明薯蕷皂苷可降低血糖，下調炎癥因子表達，抑制炎癥發(fā)生發(fā)展，緩解腎間質淋巴細胞浸潤，減輕腎組織損傷，促使腎功能修復，并隨薯蕷皂苷劑量升高而作用增強。

TLR4/NF-κB/TNF-α信號在機體炎癥介質釋放、炎癥細胞浸潤、細胞變性凋亡過程中起到重要的調控作用，抑制其激活，可明顯降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β 的合成釋放，抑制炎癥發(fā)生及進展，減輕上皮細胞-間充質轉化和細胞外基質沉積，緩解單側輸尿管梗阻誘導的腎纖維化［19］；另外有研究報道，小檗堿可通過下調TLR4/NF-κB/TNF-α 通路蛋白表達，減輕鏈脲佐菌素誘導的足細胞凋亡和腎臟炎癥損傷，改善DN 癥狀，延緩其病情進展［20］。由此可知，TLR4/NF-κB/TNF-α 信號是改善DN 病情及緩解腎間質淋巴細胞浸潤的作用靶點之一。但薯蕷皂苷對DN 大鼠TLR4/NF-κB/TNF-α 通路及腎間質淋巴細胞浸潤的影響，目前還未見明確報道，本課題組對此進行了初步研究，結果顯示，DN 模型大鼠腎組織TLR4、核內NF-κB p65、TNF-α蛋白表達明顯升高，經(jīng)不同劑量的薯蕷皂苷處理后，其腎組織TLR4、核內NF-κB p65、TNF-α 蛋白表達降低，且薯蕷皂苷各組之間呈劑量依賴性，表明在DN 病理過程中，TLR4/NF-κB/TNF-α信號起到重要的調控作用，薯蕷皂苷可抑制其激活，緩解腎間質淋巴細胞浸潤，減輕腎組織炎癥損傷，修復腎功能。

綜上所述，薯蕷皂苷可抑制TLR4、TNF-α 蛋白表達和NF-κB p65 的核轉移，下調炎癥因子合成釋放，減輕炎癥反應，緩解腎組織炎癥損傷，降低腎組織損傷，促使腎功能恢復，抑制TLR4/NF-κB/TNF-α信號傳導可能是其藥理機制，但本研究的證據(jù)效力還存在一定不足，后續(xù)還需通過激活和抑制該通路進行對照驗證，進而對薯蕷皂苷治療DN 的藥理機制進行更全面明確的闡釋。