石榴果肉PgF3′5′H基因克隆及不同溫度處理下的表達(dá)分析

關(guān)曉彎,陳　磊,涂佳麗,張水明

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,合肥 230036)

?

石榴果肉PgF3′5′H基因克隆及不同溫度處理下的表達(dá)分析

關(guān)曉彎,陳磊,涂佳麗,張水明*

(安徽農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院,合肥 230036)

摘要:為探討不同溫度處理對(duì)采后石榴果肉花青苷含量的影響及花青苷合成相關(guān)基因(F3′5′H)在石榴果肉花青苷生物合成途徑中的作用,該研究以“玉石籽”石榴為試材,于不同溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃)處理下測定石榴果肉花青苷含量,同時(shí)利用RACE技術(shù)克隆了石榴果肉花青苷合成相關(guān)基因,命名為PgF3′5′H,GenBank登錄號(hào)為KU058892;并利用RT-PCR技術(shù)分析PgF3′5′H基因在不同貯期溫度下石榴果肉中的表達(dá)特性。結(jié)果表明:(1)不同溫度處理下,石榴果肉花青苷含量隨著貯藏時(shí)間(0～56 d)的增長呈上升趨勢;在整個(gè)貯藏過程中,15 ℃條件下,花青苷含量最高,10 ℃次之,5 ℃和0 ℃則處于較低水平;15 ℃時(shí)花青苷含量在14 d后表現(xiàn)不穩(wěn)定。(2)PgF3′5′H基因全長cDNA為1 199 bp,開放閱讀框918 bp,編碼305個(gè)氨基酸,在N端36～39處含有細(xì)胞色素P450家族基因的特征保守氨基酸序列(CYP基序“PPGP”);生物信息學(xué)分析表明,該基因編碼的氨基酸序列與巨桉的EgF3′5′H2、麻風(fēng)樹的JcF3′5′H2和荷花的NnF3′5′H2氨基酸序列一致性分別高達(dá)86%、82%和81%。(3)在0 ℃、5 ℃、10 ℃處理?xiàng)l件下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)量隨著貯藏時(shí)間(0～56 d)的延長均呈上升趨勢,15 ℃處理下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)量不穩(wěn)定;石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)與花青苷含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。研究結(jié)果為深入探討采后石榴果肉花青苷的含量變化奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:石榴果肉;花青苷;溫度;PgF3′5′H;RACE;RT-PCR

石榴(PunicagranatumL.)屬于石榴科石榴屬,為多年生落葉喬木或灌木,是最早發(fā)現(xiàn)的可食用水果之一[1]。近年來,由于石榴具有多種醫(yī)療保健作用受到人們越來越多的重視[2]。石榴果肉中含有豐富的花青苷,花青苷是自然界一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素,主要存在于彩色植物葉片、花或種子的葉肉細(xì)胞和表皮細(xì)胞的液泡中[3]。花青苷具有顯著的抗氧化、抗炎、抑菌、防止肝脂肪積聚及變性、防治心血管疾病、抑制多種癌細(xì)胞生長等多種生理活性,在食品、醫(yī)藥、化妝等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[4]。但花青苷是一類不穩(wěn)定的物質(zhì),其生物合成和積累易受環(huán)境因子的調(diào)節(jié)[5-6],溫度是其中的一個(gè)主要的環(huán)境因子,不僅能影響花青苷生物合成的速率,而且可以對(duì)其積累量和穩(wěn)定性產(chǎn)生作用[7],這在葡萄[8]、長葉車前[9]、馬鈴薯[10]等研究中已得到證實(shí)。而溫度對(duì)采后石榴果肉中花青苷含量的影響方面的研究還未見報(bào)道。

花青苷合成代謝涉及多個(gè)結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因的相互作用,基因編碼的酶決定了花青苷合成的種類[11]?；ㄇ嘬盏纳锖铣芍饕杀奖彼峤獍泵?PAL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)、類黃酮3′羥基化酶(F3′H)、類黃酮3′,5′羥基化酶(F3′5′H)、二羥基黃酮醇還原酶(DFR)、花青苷合成酶(ANS)以及類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)等多種酶基因調(diào)控[12-13]。其中CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等基因已在石榴中克隆[1],而在石榴中尚未見到關(guān)于花青苷合成相關(guān)基因(F3′5′H)的研究報(bào)道。國內(nèi)外研究表明,F3′5′H基因在仙客來[14]、馬鈴薯[15]等很多植物中已經(jīng)克隆,通過調(diào)節(jié)花青苷的生物合成途徑,從而影響花青苷的種類和含量。

本研究以安徽懷遠(yuǎn)“玉石籽”石榴為試材,研究采后不同貯藏溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃)對(duì)石榴果肉花青苷含量的影響。同時(shí)利用RACE技術(shù)克隆花青苷合成相關(guān)基因(PgF3′5′H)cDNA全長,然后利用RT-PCR技術(shù)分析該基因在不同貯期溫度石榴果肉中的表達(dá)特性,為深入研究采后石榴果肉花青苷的含量變化奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

供試材料為‘玉石籽’的成熟果實(shí),于2014年9月16日采自安徽省蚌埠市懷遠(yuǎn)縣,選擇成熟度相同、果形勻稱、大小一致(約300 g)和無機(jī)械傷的果實(shí),置于4 ℃條件下預(yù)冷72 h后,將果實(shí)分成4批分別置于0 ℃、5 ℃、10 ℃和15 ℃條件下。定期(0、14、28、42和56 d)取樣,并模擬貨架期,置于20 ℃恒溫環(huán)境條件下7 d后,剝?nèi)∽蚜?液氮速凍后,于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2花青素苷含量的測定

采用pH示差法[16]分別對(duì)不同貯藏溫度不同貯藏期石榴果肉的花青苷含量進(jìn)行測定:取混合石榴籽粒解凍,冰上研磨后,迅速轉(zhuǎn)移至離心管稱重,7 000 r/min離心10 min,收集上清液,記錄上清液體積;取上清液1 mL,分別用0.4 mol/L KCl-HCl緩沖溶液(pH 1.0)和0.4 mol/L醋酸鈉緩沖溶液(pH 4.5)稀釋至5 mL,混勻,室溫放置20 min;用蒸餾水作對(duì)照,在510和700 nm下測定光密度值,重復(fù)3次。

石榴果肉中花青苷含量(mg/g)=△A×M×DF×V×100/(m×ε×L),其中:A=(A510 nm-A700 nm)pH 1.0-(A510 nm-A700 nm)pH 4.5;M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對(duì)分子質(zhì)量(449.2 g/mol);DF為稀釋因子;V為石榴汁體積(mL);m為稱取的石榴果肉質(zhì)量(g);ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾比吸收系數(shù)(26 900 L·mol-1·cm-1)]，L為光程,1 cm。

1.3PgF3′5′H基因cDNA全長克隆

1.3.1PgF3′5′H基因中間片段的獲得依據(jù)GenBank中已經(jīng)登錄的其他植物F3′5′H基因的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域保守區(qū),使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)目的片段的擴(kuò)增引物F3′5′H-F和F3′5′H-R(表1),獲取基因同源片段。利用艾德萊RNA試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取“玉石籽”石榴果肉總RNA,用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)合成cDNA,以其為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min,PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收并連接至PGEM-Teasy載體(Promega)上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α(上?？禎櫳锕?進(jìn)行克隆,挑取陽性單菌落進(jìn)行測序。

1.3.2PgF3′5′H基因末端擴(kuò)增及全長cDNA拼接根據(jù)獲得的F3′5′H中間片段核苷酸序列,設(shè)計(jì)用于3′端和5′端克隆的基因特異性引物(表1)。參照SMARTerTMRACE cDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech公司)說明書,以3′-CDS Primer A為接頭,反轉(zhuǎn)錄得到3′-RACE-Ready cDNA,以5′-CDS Primer和BD SMART Ⅱ A oligo為接頭,反轉(zhuǎn)錄得到5′-RACE-Ready cDNA。

采用巢式PCR法進(jìn)行5′端擴(kuò)增,F3′5′H-5′GSP1外特異性引物與UPM-Long作為第1輪擴(kuò)增引物,以此PCR產(chǎn)物為模板,F3′5′H-5′GSP2內(nèi)特異性引物與NUP作為引物進(jìn)行第2輪擴(kuò)增,獲得F3′5′H基因的5′端序列,兩輪擴(kuò)增程序相同,退火溫度分別為55 ℃和60 ℃?；厥諗U(kuò)增產(chǎn)物并連接至PGEM-Teasy載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α進(jìn)行克隆,篩選陽性單菌落進(jìn)行測序。分別用特異性引物F3′5′H-3′GPS1、F3′5′H-3′GPS2和通用引物UPM-Long和NUP,進(jìn)行3′端擴(kuò)增,兩輪退火溫度分別為55 ℃和58 ℃,擴(kuò)增方法參照5′端擴(kuò)增。將所得的5′端序列、3′端序列和目的片段進(jìn)行拼接,獲得PgF3′5′H基因的全長序列。

1.4PgF3′5′H基因的生物信息學(xué)分析

將PgF3′5′H基因序列在NCBI數(shù)據(jù)庫中運(yùn)用Blast工具進(jìn)行序列比對(duì)和同源性分析;運(yùn)用Finder軟件(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)查找并翻譯開放閱讀框;運(yùn)用ExPASy-Protparam Tool(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì);運(yùn)用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)進(jìn)行蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域搜索;運(yùn)用Claustalx和GENEDOC軟件進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)和相似性分析;運(yùn)用MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5石榴果肉PgF3′5′H基因在不同貯期溫度的表達(dá)分析

利用艾德萊RNA試劑盒提取不同溫度(0 ℃、5 ℃、10 ℃、15 ℃)處理石榴果肉的總RNA,采用Takara公司的PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒將總RNA

表1　本實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物序列

反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)PgF3′5′H基因的全長序列,使用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物PgF3′5′H-F/PgF3′5′H-R(表1)。分別以不同處理的cDNA為模板,采用Actin基因作為內(nèi)標(biāo)對(duì)樣品的cDNA模板量進(jìn)行校準(zhǔn),進(jìn)行特異性表達(dá)分析。反應(yīng)體系按TaKaRa SYBR Premix ExTaq試劑盒步驟進(jìn)行操作:SYBR Premix ExTaq(2×)為10 μL,ROX Peference Dye(50×)為0.4 μL,模板為2 μL,正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL,ddH2O為6.4 μL,總體系為20 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃預(yù)變性30 s,95 ℃變性5 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品各設(shè)置4個(gè)重復(fù),以ROX作為熒光校正,使用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析。

2結(jié)果和分析

2.1不同溫度處理石榴果肉花青苷含量分析

采用pH示差法測得不同溫度不同貯藏期石榴果肉的花青苷含量(圖1)。在0℃和5℃貯藏條件下,石榴果肉花青苷含量在貯藏0～14 d過程中快速升高,花青苷含量差異均達(dá)到顯著水平;貯藏14～42 d期間,花青苷含量處于一個(gè)比較穩(wěn)定的階段;貯藏42～56 d期間,花青苷含量急劇上升,達(dá)到最大值,分別為0 d的2.03和2.88倍。在10 ℃條件下,貯藏0～42 d期間,花青苷含量呈快速上升趨勢,到42 d時(shí)達(dá)到高峰,為0 d的3.25倍,且各個(gè)階段花青苷含量差異性均達(dá)到顯著水平;到56 d時(shí),花青苷含量開始緩慢下降,僅次于42 d。在15 ℃條件下,貯藏0～14 d花青苷含量快速上升,達(dá)到第一個(gè)高峰,為0 d的3.19倍;貯藏14～28 d開始緩慢下降,28～56 d又開始回升,到56 d時(shí)達(dá)到最高峰,為0 d的4.17倍,花青苷含量雖一直處于最高水平,但不穩(wěn)定。結(jié)果表明:不同溫度(0℃、5℃、10℃、15 ℃)處理?xiàng)l件下,石榴果肉花青苷含量隨著貯藏時(shí)間(0～56 d)的增長均呈不斷上升趨勢;在整個(gè)貯藏過程中,15 ℃處理?xiàng)l件下,花青苷含量一直處于最高水平,10 ℃次之,5 ℃和0 ℃則處于較低水平。

2.2石榴PgF3′5′H基因的克隆

根據(jù)基因特異引物F3′5′H-F/F3′5′H-R擴(kuò)增石榴果肉中F3′5′H基因目的片段,電泳回收后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化,篩選陽性克隆,測序得到一個(gè)367 bp的核酸片段(圖2,A)。測序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站的Blast中進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)該片段序列與錦繡杜鵑(Rhododendron×pulchrum)的RpF3′5′H(AB289598.1)的序列一致性高達(dá)80%,初步判斷該片段為石榴F3′5′H基因序列片段。

5′端擴(kuò)增得到一個(gè)486 bp的片段(圖2,B),其5′端發(fā)現(xiàn)起始密碼子ATG。NCBI序列對(duì)比結(jié)果顯示,該片段序列與巨桉(Eucalyptusgrandis)的EgF3′5′H2-like(XM_010046774.1)的序列一致性高達(dá)83%,說明已克隆到石榴F3′5′H基因cDNA的5′端序列。3′端擴(kuò)增得到一個(gè)503 bp的片段(圖2,C),其3′端發(fā)現(xiàn)終止密碼子TAA和PolyA尾巴,說明已到達(dá)3′末端。NCBI序列對(duì)比結(jié)果顯示,該片段序列與山字草(Clarkiaarcuata)的CaF3′5′H1(KC019237.1)的序列一致性高達(dá)81%,分析確定為石榴F3′5′H基因的3′序列。將獲得的3′段序列、5′段序列和目的片段序列進(jìn)行拼接,得到一個(gè)長1 199 bp的cDNA序列。

小寫字母表示同一溫度不同貯期

M.DL2000;A.PgF3′5′H;B.5′-RACE;C.3′-RACE

2.3PgF3′5′H基因生物信息學(xué)分析

通過NCBI的ORF Finder分析,PgF3′5′H基因全長cDNA為1 199 bp,其中包含5′非編碼區(qū)115 bp,3′非編碼區(qū)166 bp和開放閱讀框918 bp,編碼一個(gè)含有305個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì),起始密碼子為ATG,終止密碼子為TAA(圖3)。將其命名為PgF3′5′H,GenBank登錄號(hào)為KU058892。

Protparam分析其理化性質(zhì),推測該蛋白分子式為C1546H2477N419O404S23,相對(duì)分子量為34 135.6,等電點(diǎn)為9.89,理論推導(dǎo)其半衰期大約為30 h,不穩(wěn)定參數(shù)為42.85,蛋白質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定(40以下為穩(wěn)定蛋白);該蛋白中相對(duì)含量較多的氨基酸是亮氨酸Leu(10.5 %,32個(gè))和丙氨酸Ala(9.2%,28個(gè)),含量較少的是半胱氨酸Cys(1.0%,3)和色氨酸Trp(1.3%,4個(gè));總的帶負(fù)電荷殘基(Asp + Glu)為25,總的帶正電荷殘基(Arg + Lys)為41;脂肪族氨基酸指數(shù)為94.33,總平均疏水指數(shù)(GRAVY)為0.097,該蛋白為疏水性蛋白。

將PgF3′5′H基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析(圖4),結(jié)果發(fā)現(xiàn),該氨基酸序列與巨桉EgF3′5′H2、麻風(fēng)樹JcF3′5′H2和荷花NnF3′5′H2的氨基酸一致性較高,均達(dá)到80%以上。NCBI保守結(jié)構(gòu)域搜索結(jié)果顯示,PgF3′5′H氨基酸序列含有細(xì)胞色素P450家族基因的特征保守氨基酸序列:N端36～39處的CYP基序“PPGP”,為連接膜的錨定位點(diǎn)和酶蛋白的球體部分,在不同的物種中是高度保守區(qū)[17]。將PgF3′5′H推導(dǎo)的氨基酸序列與其它植物中調(diào)控花青苷合成代謝的F3′5′H氨基酸序列進(jìn)行比對(duì),并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5),發(fā)現(xiàn)PgF3′5′H與巨桉EgF3′5′H2(Accession:XP_010045081.1)的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較近。

方框中堿基序列ATG表示起始密碼子;*表示終止密碼子TAA

圖中從上至下依次代表的是石榴、巨桉、荷花、黑果茶藨、麻風(fēng)樹、甜橙、可可、

節(jié)點(diǎn)數(shù)字表示Bootstrap驗(yàn)證中基于1 000次重復(fù)的可信度(大于30%顯示);標(biāo)尺代表遺傳距離;括號(hào)內(nèi)編號(hào)為氨基酸登錄號(hào)

2.4不同溫度處理石榴果肉PgF3′5′H基因的差異表達(dá)分析

應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析PgF3′5′H基因在不同貯期溫度石榴果肉中的表達(dá)特性(圖6)。在0 ℃貯藏條件下,0～14 d期間,PgF3′5′H基因表達(dá)量一直處于一個(gè)較低水平;14～42 d,PgF3′5′H基因表達(dá)量快速上升,達(dá)到高峰,為0 d基因表達(dá)量的3.54倍,且各階段基因表達(dá)量差異顯著;56 d又開始下降,僅次于42 d。在5 ℃和10 ℃條件下,PgF3′5′H基因表達(dá)量均呈現(xiàn)快速上升趨勢,到56 d時(shí),基因表達(dá)量分別為0 d的5.51和4.02倍;在15 ℃貯藏條件下,0～14 d期間,PgF3′5′H基因表達(dá)量急劇上升,14 d時(shí)達(dá)到第一個(gè)高峰,為0 d基因表達(dá)量的3.99倍;14～42 d期間,基因表達(dá)量急劇下降,下降了2.48倍,且各個(gè)階段基因表達(dá)量差異顯著;到56 d時(shí),基因表達(dá)量又急劇上升,達(dá)到最大值,為0 d基因表達(dá)量的5.26倍。結(jié)果表明:在0 ℃、5 ℃、10 ℃處理?xiàng)l件下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)量隨著貯藏時(shí)間(0～56 d)的增長呈不斷上升趨勢；在15 ℃處理?xiàng)l件下,石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)量14 d后表現(xiàn)不穩(wěn)定。

用SPSS軟件對(duì)不同溫度處理石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)量與花青苷含量(圖1)進(jìn)行相關(guān)性比較分析可知,PgF3′5′H基因表達(dá)與花青苷含量呈顯著正相關(guān)(r=0.742,P<0.05)。

小寫字母表示同一溫度不同貯期相對(duì)表達(dá)量0.05水平差異顯著性

3討論

本研究通過分析不同溫度貯期石榴果肉的花青苷含量發(fā)現(xiàn):適當(dāng)?shù)牡蜏?10 ℃)促進(jìn)花青苷含量增長,這在許多植物中已經(jīng)得到證實(shí)。如Yamane等[18]對(duì)葡萄、謝興斌[19]對(duì)蘋果、李智[20]對(duì)茶樹的研究表明,適當(dāng)?shù)牡蜏貤l件促進(jìn)葡萄皮、蘋果皮、茶樹芽葉花青苷積累。而在較低溫度(0 ℃和5 ℃)貯期下,石榴果肉花青苷含量增長緩慢,張學(xué)英等[21]對(duì)李的研究表明,李果實(shí)在0 ℃低溫下的花青苷含量積累緩慢,說明促進(jìn)植物花青苷積累的低溫也是有一定閾值范圍的,非常低的溫度不利于花青苷的合成。溫度稍高(15 ℃)時(shí),石榴果肉花青苷含量不穩(wěn)定。Huh等[22]對(duì)菊花、Poudel等[23]對(duì)葡萄的研究表明,高溫(30 ℃左右)會(huì)影響花青苷的穩(wěn)定性,也就是說當(dāng)溫度升高時(shí),花青苷的合成速率會(huì)減慢,降解速率卻增加,進(jìn)而導(dǎo)致花青苷的積累量降低,至于高溫對(duì)采后石榴果肉花青苷積累及穩(wěn)定性的影響,還有待進(jìn)一步研究?？梢?溫度不僅影響采后石榴果肉花青苷積累,還影響其穩(wěn)定性。

經(jīng)過F3′5′H氨基酸多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),PgF3′5′H含有與其他F3′5′H相似的保守區(qū),不同物種F3′5′H氨基酸序列的主要差異存在于N端約31個(gè)氨基酸,這段序列主要含有疏水氨基酸殘基,是膜插入點(diǎn)的信號(hào)序列[24]。F3′5′H屬于細(xì)胞色素P450家族的單加氧酶[11],細(xì)胞色素P450家族基因含有3個(gè)特征保守氨基酸序列:N端CYP基序“PPGP”、I螺旋基序“AGTDT”和血紅素(HBR)結(jié)合區(qū)域序列“FGAGRRICAG”[17]。PgF3′5′H僅含有CYP基序,缺少I螺旋基序和HBR結(jié)合區(qū)域序列,這與矮牽牛(Petunia×hybrida)的PhF3′5′H氨基酸序列(BAF64483.1)相一致。至于這些基序的缺乏對(duì)石榴果肉花青苷的生物合成有什么具體影響,還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

通過RT-PCR技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),不同溫度貯期石榴果肉PgF3′5′H基因的相對(duì)表達(dá)量存在差異:適當(dāng)?shù)牡蜏?5 ℃和10 ℃)促進(jìn)PgF3′5′H基因的表達(dá);而在較低溫度(0 ℃)下,PgF3′5′H基因的表達(dá)量增長緩慢;溫度稍高(15 ℃)時(shí),石榴果肉PgF3′5′H基因的表達(dá)量雖然顯著上升,但不穩(wěn)定。可見,溫度影響PgF3′5′H基因的表達(dá)。另外,不同貯期溫度石榴果肉PgF3′5′H基因表達(dá)與花青苷含量呈顯著正相關(guān),推測PgF3′5′H基因促進(jìn)石榴果肉花青苷的合成。這與近年來國內(nèi)外許多研究結(jié)果相一致,如葡萄(Vitisvinifera)VvF3′5′H[25]和月季(Rosahybrida)RhF3′5′H[26]基因的表達(dá)有助于花青苷含量的增長。另外,通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)引入外源F3′5′H基因來改變植物花青苷積累,已在多種植物上獲得成功,如風(fēng)鈴草(Campanulamedium)的CmF3′5′H基因[27]和野茶樹(Camelliasinensis)的CsF3′5′H基因[28]轉(zhuǎn)化煙草,轉(zhuǎn)化株系中均提高了花青苷含量。花青苷是影響石榴品質(zhì)的一個(gè)重要因子,由于花青苷生物合成途徑復(fù)雜,至于其他結(jié)構(gòu)基因、調(diào)節(jié)基因和環(huán)境因子對(duì)采后石榴果肉花青苷積累的影響,還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1]ZHAO X Q,YUAN Z H,FENG L J,etal.Cloning and expression of anthocyanin biosynthetic genes in red and white pomegranate[J].JournalofPlantResearch,2015,128:687-696.

[2]馮玉增,胡清波.無公害農(nóng)產(chǎn)品高效生產(chǎn)技術(shù)叢書:石榴[M].北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2007:5-6.

[3]馮立娟,尹燕雷,苑兆和,等.不同發(fā)育期石榴果實(shí)果汁中花青苷含量及品質(zhì)指標(biāo)的變化[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2010,26(3):179-183.

FENG L J,YIN Y L,YUAN Z H,etal.Change of anthocyanin content and quality index in pomegranate fruits during different developmental period[J].ChineseAgriculturalScienceBulletin,2010,26(3):179-183.

[4]趙貝塔.不同石榴品種花色苷的提取、純化工藝及抗氧化活性研究[D].陜西楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

[5]郭松年,董周永,孫海燕,等.石榴汁花色苷熱穩(wěn)定性及其降解動(dòng)力學(xué)研究[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào),2008,24(3):256-259.

GUO S N,DONG Z Y,SUN H Y,etal.Stability of anthocyanin in pomegranate juice and its degradation kinetics[J].TransactionsoftheChineseSocietyofAgriculturalEngineering,2008,24(3):256-259.

[6]胡可,韓科廳,戴思蘭.環(huán)境因子調(diào)控植物花青素苷合成及呈色的機(jī)理[J].植物學(xué)報(bào),2010,45(3):307-317.

HU K,HAN K T,DAI S L.Regulation of plant anthocyanin synthesis and pigmentation by environmental factors[J].ChineseBulletinofBotany,2010,45(3):307-317.

[7]李秀芳,楊拉弟,韓葉,等.溫度對(duì)采后‘紅富士’蘋果果皮色澤、色素及其相關(guān)酶活性變化的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2014,23(5):97-103.

LI X F,YANG L D,HAN Y,etal.Effects of temperature on peel color,pigments and activities of related enzymes of ‘Red Fuji’ apple during post-harvest storage[J].ActaAgriculturaeBoreali-OccidentalisSinica,2014,23(5):97-103.

[8]MORI K,GOTO-YAMAMOTO N,KITAYAMA M,etal.Loss of anthocyanins in red-wine grape under high temperature[J].JournalofExperimentalBotany,2007,58:1 935-1 945.

[9]STILES E A,CECH N B,DEE S M,etal.Temperature-sensitive anthocyanin production in flowers ofPlantagolanceolata[J].PhysiologiaPlantarum,2007,129:756-765.

[10]盧其能.馬鈴薯花色苷及其生物合成的主要關(guān)鍵酶基因的克隆與表達(dá)分析[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[11]劉曉芬,李方,殷學(xué)仁,等.花青苷生物合成轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào),2013,40(11):2 295-2 306.

LIU X F,LI F,YIN X R,etal.Recent advances in the transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis[J].ActaHorticulturaeSinica,2013,40(11):2 295-2 306.

[12]張龍,李衛(wèi)華,姜淑梅,等,花色素苷生物合成與分子調(diào)控研究進(jìn)展[J].園藝學(xué)報(bào),2008,35(6):909-916.

ZHANG L,LI W H,JIANG S M,etal.Progress of molecular basis of biosynthesis and transcriptional regulation of anthocyanins [J].ActaHorticulturaeSinica,2008,35(6):909-916.

[13]李霞,王欣,劉亞菊,等.甘薯花青苷生物合成調(diào)控研究進(jìn)展[J].分子植物育種,2014,12(3):567-576.

LI X,WANG X,LIU Y J,etal.Progress on anthocyanin biosynthesis of sweetpotato[J].MolecularPlantBreeding,2014,12(3):567-576.

[14]BOASE M R,LEWIS D H,DAVIES K M,etal.Isolation and antisense suppression of flavonoid 3′,5′-hydroxylase modifies flower pigments and colour in cyclamen[J].BMCPlantBiology,2010,10:107.

[15]JUNG C S,GRIFFITHS H M,DE JONG D M,etal.The potato P locus codes for flavonoid 3′,5′-hydroxylase[J].TheoreticalandAppliedGenetics,2005,110:269-275.

[16]楊兆艷.pH示差法測定桑葚紅色素中花青苷含量研究[J].食品科技,2007,(4):201-203.

YANG Z Y.Anthocyanin content in mulberry red pigment by pH-differential spectrophotometry[J].FoodScienceandTechnology,2007,(4):201-203.

[17]田新惠.彩色棉GhF3′H和GhF3′5′H基因的克隆、鑒定及四種類黃酮物質(zhì)的HPLC分析[D].新疆石河子:石河子大學(xué),2010.

[18]YAMANE Y,JEONG ST,GOTO-YAMAMOTO N,etal.Effects of temperature on anthocyanin biosynthesis in grape berry skins[J].AmericanJournalofEnologyandViticulture,2006,(57):54-59.

[19]謝興斌.蘋果 bHLH 轉(zhuǎn)錄因子MdTTL1對(duì)低溫誘導(dǎo)花青苷合成和果實(shí)著色的多途徑調(diào)控[D].山東泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2011.

[20]李智.不同環(huán)境因子調(diào)控茶樹紫色芽葉形成的分子機(jī)制研究[D].山東泰安:山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[21]張學(xué)英,張上隆,秦永華,等.溫度對(duì)李果實(shí)采后花色素苷合成的影響,園藝學(xué)報(bào),2005,32(6):1 073-1 076.

ZHANG X Y,ZHANG S L,QIN Y H,etal.Effects of temperature on anthocyanin synthesis of postharvest plum fruit[J].ActaHorticulturaeSinica,2005,32(6):1 073-1 076.

[22]HUH E J,SHIN H K,CHOI S Y,etal.Thermosusceptible developmental stage in anthocyanin accumulation and color response to high temperature in red chrysanthemum cultivars[J].KoreanJournalofHorticulturalScience&Technology,2008,26:357-361.

[23]POUDEL P R,MOCHIOKA R,BEPPU K,etal.Influence of temperature on berry composition of interspecific hybrid wine grape ‘Kadainou R-1’ (Vitisficifoliavar.ganebu×V.vinifera‘Muscat of Alexandria’)[J].JournaloftheJapaneseSocietyforHorticulturalScience,2009,78:169-174.

[24]孟麗,戴思蘭.瓜葉菊F3′5′H基因cDNA的克隆、序列分析及其原核表達(dá)[J],分子植物育種,2005,3(6):780-786.

MENG L,DAI S L.Cloning,sequencing and prokaryotic expression ofF3′5′HcDNA fromPericalliscruentia(L.) Herit.[J].MolecularPlantBreeding,2005,3(6):780-786.

[25]CASTELLARIN S D,GASPERO G D,MARCONI R,etal.Colour variation in red grapevines (VitisviniferaL.):genomic organization,expression of flavonoid 3′-hydroxylase,flavonoid 3′,5′-hydroxylase genes and related metabolite profiling of red cyanidin-/blue delphinidin-based anthocyanins in berry skin[J].BMCGenomics,2006,7:12.

[26]KATSUMOTO Y,FUKUCHI-MIZUTANI M,FUKUI Y,etal.Engineering of the rose flavonoid biosynthetic pathway successfully generated blue-hued flowers accumulating delphinidin[J].PlantandCellPhysiology,2007,48:1 589-1 600.

[27]OKINAKA Y,SHIMADA Y,NAKANO-SHIMADA R,etal.Selective accumulation of delphinidin derivatives in tobacco using a putative flavonoid 3′,5′-hydroxylase cDNA fromCampanulamedium[J].BioscienceBiotechnologyandBiochemistry,2003,67:161-165.

[28 ]WANG Y S,XU Y J,GAO L P,etal.Functional analysis of flavonoid 3′,5′-hydroxylase from tea plant (Camelliasinensis):critical role in the accumulation of catechins[J].BMCPlantBiology,2014,14:347.

(編輯:宋亞珍)

Clone ofPgF3′5′HGene in Pomegranate Pulp and Its Expression under Different Temperature Treatments

GUAN Xiaowan,CHEN Lei,TU Jiali,ZHANG Shuiming*

(College of Horticulture,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Abstract:To explore the effects of different temperature treatments on anthocyanin contents of postharvest pomegranate pulp,and the function of anthocyanin biosynthesis-related gene (F3′5′H) in anthocyanin biosynthesis pathway of pomegranate pulp,taking pomegranate cultivar ‘Yushizi’ as test materials,we measured anthocyanin contents of pomegranate pulp under different temperature (0 ℃,5 ℃,10 ℃,15 ℃) treatments.At the same time a anthocyanin biosynthesis-related gene was cloned from pomegranate pulp by RACE,named PgF3′5′H(GenBank accession:KU058892).The expression levels of PgF3′5′H in pomegranate pulp during different temperature storage periods were analyzed by RT-PCR.The results showed that:(1)under different temperature treatments,anthocyanin contents of pomegranate pulp showed a rising trend as the storage time (0-56 d) went on;In the whole storage time,anthocyanin contents were the highest under 15 ℃ treatments,secondly 10 ℃,5 ℃ and 0 ℃ at lower levels;Anthocyanin contents under 15 ℃ were unstable after 14 d.(2)The full-length cDNA of PgF3′5′H was 1 199 bp with an open reading frame of 918 bp encoding 305 amino acids.The 36th to 39th amino acids of the N-terminus of PgF3′5′H contained the characteristic conserved sequences (CYP motif “PPGP”) of the cytochrome P450 family genes;Bioinformatics showed that the amino acid sequences of PgF3′5′H had high consistency with Eucalyptus grandis EgF3′5′H2,Jatropha curcas JcF3′5′H2 and Nelumbo nucifera NnF3′5′H2 as 86%,82% and 81%,respectively.(3)The expression levels of PgF3′5′H showed a rising trend as the storage time (0-56 d) went on under 0 ℃,5 ℃ and 10 ℃ treatments,being unstable under 15 ℃;The relative expression of PgF3′5′H was significantly positively correlated with anthocyanin contents of pomegranate pulp.The research results laid the foundation for exploring the changes of anthocyanin contents in postharvest pomegranate pulp.

Key words:pomegranate pulp;anthocyanin;temperature;PgF3′5′H;RACE;RT-PCR

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡介:關(guān)曉彎(1989-),女,在讀碩士研究生,主要研究果樹資源與生物技術(shù)育種。E-mail:15256564232@163.com*通信作者:張水明,博士,副教授,主要從事園藝植物種質(zhì)資源與生物技術(shù)育種研究。E-mail:zhangshm893@sohu.com

基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金(30900971)

收稿日期:2015-12-26;修改稿收到日期:2016-02-01

文章編號(hào):1000-4025(2016)03-0435-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.03.0435